Submitted by FABIANA DA SILVA FRANÇA (fabiana21franca@gmail.com) on 2017-11-09T16:00:06Z No. of bitstreams: 2 arquivototal.pdf: 6569210 bytes, checksum: e5c8caef20052f8926c2763bec055f88 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-09T16:00:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivototal.pdf: 6569210 bytes, checksum: e5c8caef20052f8926c2763bec055f88 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / Background: Nitric oxide (NO) donors can act in the control and treatment of various cardiovascular complications, such as hypertension. In particular, an organic nitrate, 2-nitrate-1,3-dibutoxipropane (NDBP) developed in recent years by UFPB has shown great therapeutic potential. However, its mechanisms are not fully clarified. Aim: To investigate the effects and mechanisms of NDBP, elucidating their therapeutic potential in angiotensin II-mediated hypertension. Methods: In the first stage of the study, were performed in vitro experiments in normotensives Wistar rats (n=11) tissues for characterization of compound about ability to release NO by direct measurement of NO; and modulation of NADPH oxidase activity, by chemiluminescence technique. In the second stage of the study, in vivo experiments in C57BL / 6J mice (n=24), divided in four groups (control, NDBP, Ang II and Ang II + NDBP) were performed to investigate the therapeutic potential of NDBP in angiotensin II-mediated hypertension. The animals had implantation of osmotic minipumps containing Ang II (400 mg / kg / 24h) and after 9 days were treated with NDBP (40 mg / kg / day; ip). Blood pressure (BP) was measured by tail-cuff. At the end of the experiments, the animals were euthanized and blood and tissues were collected for analysis. Histopathological analyzes were performed using staining picrosirius. Superoxide levels were measured by NADPH oxidase activity via chemiluminescence and DHE fluorescence (5 mmol • L-1). Levels of serum nitrate/nitrite and cGMP were performed using specific kits. NADPH oxidase subunit expression were analyzed by real time qPCR. Putative antioxidant activity was determined by autoxidation with pyrogallol. Results: In vitro experiments revealed a dose-dependent increase in NO production mediated by NDBP in liver and kidney tissues, which was attenuated by the xanthine oxidase inhibitor febuxostat. In addition, the NDBP reduced NADPH oxidase activity and prevented its activation induced by ANG II. In vivo experiments showed that NDBP prevents the increase in hypertension in mice with chronic infusion of ANG II. This results were associated to the attenuation of cardiac hypertrophy, renal fibrosis, and reduced NADPH oxidase-derived oxidative stress in the kidneys, the heart, and liver. Furthermore, NDBP also increased plasma levels of nitrite and nitrate. On the other hand, the autoxidation with pyrogallol revealed that NDBP does not act as a direct antioxidant, justifying its involvement in the modulation of NADPH oxidase. Conclusions: The organic nitrate NDBP prevents the progression of angiotensin II-mediated hypertension. Regarding the mechanisms, our findings suggest that NDBP treatment is associated with sustained NO release and attenuated activity of NADPH oxidase, which requires functional xanthine oxidase. / Introdução: Doadores de óxido nítrico (NO) podem atuar no controle e tratamento de diversas complicações cardiovasculares, como por exemplo, a hipertensão arterial. Em particular, um nitrato orgânico, 2-nitrato-1,3-dibutoxipropano (NDBP) desenvolvido nos últimos anos pela UFPB vem apresentando grande potencial terapêutico. No entanto, seus mecanismos não estão totalmente esclarecidos. Objetivo: Investigar os efeitos e os mecanismos de ação do NDBP, elucidando seu potencial terapêutico na hipertensão arterial induzida por Angiotensina II (ANG II). Métodos: Na primeira etapa do estudo foram realizados experimentos in vitro em tecidos de ratos Wistar normotensos (n=11) para caracterização do composto, sobre sua capacidade de liberação de NO, por meio da medida direta de NO; e modulação da atividade da enzima NADPH oxidase, pela técnica de quimioluminescência. Na segunda etapa do estudo, experimentos in vivo em camundongos C57BL/6J (n=24), classificados em quatro grupos (Controle, NDBP, ANG II e ANG II + NDBP), foram realizados para investigar o potencial terapêutico do NDBP na hipertensão induzida por ANG II. Os animais tiveram implante de minibombas osmóticas contendo ANG II (400 μg/kg/24h) e após 9 dias receberam tratamento com NDBP (40 mg/kg/dia; i.p.). A pressão arterial (PA) foi verificada via pletismografia de cauda. Ao término dos experimentos, os animais foram eutanasiados e tecidos e sangue foram coletadas para análise posterior. Análises histopatológicas foram realizadas utilizando a coloração com Picro-sirius. Os níveis de superóxido foram mensurados por meio da atividade da enzima NADPH oxidase, via quimioluminescência e fluorescência com DHE (5 mmol·L−1). Além disso, os níveis séricos de nitrato/nitrito e cGMP foram realizados, utilizando kits específicos. Foi investigada também a expressão de subunidades da enzima NADPH oxidase pela técnica de qPCR em tempo real e a possível atividade antioxidante por meio da autoxidação com pyrogallol. Resultados: os experimentos in vitro utilizando tecidos de fígado e rim revelaram um aumento dose-dependente na produção de NO, mediado pelo NDBP, que foi atenuado pelo inibidor da enxima xantina oxidase, o febuxostato. Além disso, o NDBP reduziu a atividade da NADPH oxidase e preveniu sua ativação induzida pela ANG II. Os experimentos in vivo mostraram que o NDBP previne o aumento da hipertensão arterial em camundongos com infusão crônica de ANG II. Esses resultados foram associados à atenuação da hipertrofia cardíaca, fibrose renal, e redução do estresse oxidativo mediado pela redução da atividade da enzima NADPH oxidase nos rins, coração e fígado. Além disso, o NDBP aumentou os níveis plasmáticos de nitrito e nitrato. Por outro lado, a autooxidação com pyrogalol revelou que o NDBP não atua como um antioxidante direto, justificando então sua participação na modulação da NADPH oxidase. Conclusão: o nitrato orgânico NDBP impede a progressão da hipertensão arterial mediada pela angiotensina II. Em relação aos seus mecanismos, os achados sugerem que o tratamento com NDBP está associado a uma contínua liberação de NO e redução da atividade da enzima NADPH oxidase, que parece ser dependente da xantina oxidase funcional.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 4258055 bytes, checksum: ee74f99507084e08e3e09b960fa1630d (MD5) Previous issue date: 2014-03-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Previous studies have show that the organic nitrate tetrahydrofurfuryl (NTHF) induces vasorelaxation in mesenteric artery rings with involvement of the NO-sGC-PKG pathway. This study evaluated the action of NTHF on cardiovascular parameters in spontaneously hypertensive (SHR) and Wistar Kyoto (WKY) rats, investigating: the nitric oxide (NO) release, acute toxicity, the NTHF effect on blood pressure and heart rate, its vasorelaxant effect and its ability to induce tolerance. NTHF increased NO levels in rat aortic smooth muscle cells (SMC) and cardiomyocites. In acute toxicity studies, a high single dose from NTHF showed low toxicity. In normotensive animals, NTHF induced hypotension after oral administration of NTHF, and bradycardic and hypotensive effects following administration of this nitrate. These results were similar that found using nitroglycerine (NTG). In addition, these effects were not altered by pretreatment with hexamethonium, a ganglionic blocker. However the treatment with methylene blue, a sGC inhibitor, promoted attenuation of both hypotensive and bradycardic effects, suggesting the involvement of the sGC pathway in these effects. In mesenteric artery rings from SHR and WKY rats precontracted with phenylephrine, NTHF induced concentration dependent vasodilatation in both intact and removed endothelium. This result suggests that the vasorelaxant effect is an endothelium derived relaxation factors (EDRFs) independent mechanism. Furthermore, in the presence of NO° scavenging (PTIO) or ODQ, a sGC inhibitor, the vasorelaxation induced by NTHF was decreased, indicating the involvement of NO-sGC pathway in this response in both SHR and WKY. In the presence of cyanamide, an aldehyde dehydrogenase (mtALDH) inhibitor, the vasorelaxant effect was diminished, suggesting that NTHF is metabolized by this enzyme. After exposure to depolarizing agent KCl, the nitrate effect was significantly attenuated, a characteristic of substances which acts by K+ channels activation. This effect was confirmed after using tetraetylamonium (TEA), a K+ channels inhibitor. In normotensive rats treated with NTHF, the acute administration of NTHF promoted bradycardia and hypotension were are not changed in relation to which those observed in vehicle-treated animals, suggesting that organic nitrate did not induce in vivo tolerance. In vitro tolerance was evaluated in both mesenteric artery rings from animals pretreated with NTHF as well as rings previously exposed to isolated concentrations of NTHF. The vasorelaxant effect was not modified by pretreatment or exposure to NTHF, unlike that observed with NTG. In rings treated with NTG, the effect induced by NTHF was not modified, indicating that NTHF did not promote in vitro tolerance. The results demonstrated that NTHF promoted hypotensive and bradycardic effects in both SHR and WKY rats, with involvement of sGC enzyme; NTHF induced a vasorelaxant effect with participation of NO-sGC-PKG pathway and K+ channels. These effects seem to be mediated by NO release from cardiomyocites and SMC. Finally this study will help to advance the field towards clinical trials, since NTHF caused low toxicity and this nitrate was devoid of in vivo and in vitro tolerance. / Estudos anteriores demonstraram que o nitrato orgânico tetra-hidrofurfurílico (NTHF), promoveu efeito vasorrelaxante em artéria mesentérica de ratos normotensos, com envolvimento da via NO-sGC-PKG. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos cardiovasculares induzidos pelo NTHF em ratos espontaneamente hipertensos (SHR) e normotensos Wistar Kyoto (WKY), investigando: a liberação de óxido nítrico (NO), a toxicidade aguda, o efeito do NTHF sobre pressão arterial (PA) e frequência cardíaca (FC), o efeito vasodilatador desse composto, além de sua capacidade em induzir tolerância. Em células musculares lisas vasculares (CMLV) de aorta de rato e cardiomiócitos, NTHF promoveu aumento dos níveis de NO. Na avaliação da toxicidade aguda, NTHF foi administrado por via oral numa dose elevada, e nestas condições o nitrato orgânico apresentou baixa toxicidade. Em animais normotensos, NTHF promoveu hipotensão quando administrado por via oral e efeito hipotensor e bradicárdico após a administração intravenosa, semelhante ao observado pelo gliceril trinitrato (GTN). Este efeito não foi alterado pelo prétratamento com hexametônio, um bloqueador nicotínico ganglionar. Porém, o tratamento com azul de metileno, inibidor da enzima ciclase de guanilil solúvel (sGC), promoveu diminuição da resposta, indicando a participação da sGC nos efeitos hipotensor e bradicárdico. Em animais WKY e SHR NTHF promoveu efeito hipotensor e bradicárdico. Em anéis de artéria mesentérica de ratos SHR e WKY, pré-contraídos com fenilefrina, NTHF promoveu vasodilatação concentraçãodependente, com endotélio vascular intacto ou removido, sugerindo um efeito independente da liberação dos fatores relaxantes derivados do endotélio (EDRFs). Na presença do sequestrador de NO radicalar (PTIO) ou do inibidor seletivo da sGC (ODQ), o efeito vasorrelaxante do NTHF foi atenuado, indicando a participação da via NO-sGC tanto em SHR quanto WKY. Na presença de cianamida, um inibidor da enzima aldeído desidrogenase mitocondrial (mtALDH), o efeito vasorrelaxante foi atenuado, indicando que o nitrato é metabolizado por esta enzima. Após a exposição ao agente despolarizante KCl e após adição de tetraetilamônio (TEA), inibidor de canais para K+, o efeito do NTHF foi diminuído. Em animais normotensos prétratados com NTHF, a administração aguda de NTHF hipotensão e bradicardia, comparáveis às observadas no grupo controle, sugerindo que o NTHF não induz tolerância in vivo. A tolerância in vitro foi avaliada em artéria mesentérica de animais tratados previamente com NTHF, quando previamente expostos a concentrações isoladas do nitrato. O efeito vasorrelaxante não foi modificado pelo tratamento ou exposição prévia ao NTHF. Efeito contrário ao obtido com GTN. Em anéis prétratados com GTN, o efeito induzido pelo NTHF não foi modificado, sugerindo que o nitrato em estudo não promove tolerância in vitro. Os resultados demonstram que o NTHF promoveu efeito hipotensor e bradicárdico em animais normotensos e hipertensos, com envolvimento da enzima sGC; apresentou efeito vasorrelaxante, com participação da via NO-sGC-PKG e também de canais para K+. Esses efeitos parecem ser mediados por meio da liberação de NO tanto em CMLV quanto em cardiomiócitos. Por fim, NTHF evidencia um potencial clínico por apresentar baixa toxicidade e não induzir tolerância in vivo e in vitro

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1974119 bytes, checksum: 87d088fb9d6973822abebb19f69d61d5 (MD5) Previous issue date: 2013-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The organic nitrates are classified as drugs donors of nitric oxide (NO) that might potentially be useful in the treatment of cardiovascular diseases, principally to mimick endogenous NO. A new-found organic nitrate, the nitrate-12- cis- 9- ethyl octadecanoate (NCOE), synthesized from ricinoleic acid from castor oil, was studied in order to evaluate its cardiovascular effects, using in vivo and in vitro approaches. In normotensive rats, NCOE (10, 20, 30, 40 and 60 mg /kg, iv) induced hypotension (2.5 ± 0.9, -3.9 ± 0.7, -31.0 ± 6.6, -40.6 ± 3.9 and -50.4 ± 3.5%) and bradycardia (-5.6 ± 0.9, -8.9 ± 1.0, -57.2 ± 8.9; -70.9 ± 5.3 and -77.9 ± 2.7%) transients, both dose-dependent effects. In isolated rat superior mesenteric artery rings pre-contracted with phenylephrine (Phe) (1 mM), NCOE (10-10-10-3 M) induced a concentration-dependent vasorelaxation in presence (MR = 107.3 ± 4.43%; pD2 = 5.59 ± 0.06) or absence (MR = 118.0 ± 3.5%; pD2 = 5.90 ± 0.05) of endothelium, suggesting a NCOE effect independent of endothelium-derived factor. All subsequent experiments were performed in the absence of endothelium. The NCOE effect was attenuated after a contraction induced by depolarizing solution with high K+ (MR = 92.0 ± 4.1%) compared to the nitrate effect on Phe-contractions. The pre-incubation with PTIO (300 mM), a free radical form of NO (NO●) scavenger, attenuated the NCOE vasorelaxation potency (pD2 = 5.10 ± 0.05), suggesting NO● involvement in the nitrate effect. However, in the presence of L-cysteine (3 mM), a reduced form of NO (NO-) scavenger, NCOE response was potentiated (pD2 = 6.34 ± 0.03). Similar effect was observed in the presence of N-acetylcysteine (NAC) (3 mM), a free radicals intracellular scavenger (pD2 = 6.56 ± 0.05). The NCOE effect was not altered in the presence of proadifeno (10 mM), an inhibitor of cytochrome P450 (pD2 = 5,99 ± 0,07%). However, the vasodilation was reduced in the presence of cyanamide (1 mM), inhibitor of mitochondrial aldehyde dehydrogenase (mtALDH) (MR = 94.3 ± 6.26%), and of ODQ (10 μM), inhibitor of soluble guanylyl cyclase (sGC) (MR = 55.2 ± 3.60%), suggesting these enzymes involvement in NCOE response. After preincubation with TEA (3 mM), a K+ channels non-selective blocker, the nitrate vasorelaxation was reduced (MR = 107.1 ± 7.09), demonstrating the participation of these channels in nitrate effect. When using iberiotoxin (100 nM) and glibenclamide (10 μM), KATP and BKCa selective blockers, respectively, the vasodilatory effect was reduced (MR = 106.2 ± 1.49%; pD2 = 5.61 ± 0.04, respectively), although the effect was not modified in the presence of 4-aminopyridine (1 mM), KV blocker (pD2 = 5,70 ± 0,04%). Furthermore, NCOE increased NO levels in rat aorta smooth muscle cells, detected by NO-sensitive dye DAF-2T. These results together suggest that NCOE induces hypotension and bradycardia transients, and promotes vasorelaxation due NO● release through the compound metabolism via mtALDH and consequent sGC, KATP and KBCa activation. / Os nitratos orgânicos são classificados como drogas doadoras de óxido nítrico (NO), utilizadas no tratamento de doenças cardiovasculares, mimetizando as ações do NO endógeno. Um nitrato orgânico inédito, o 12-nitrato-cis-9-octadecanoato de etila (NCOE), sintetizado a partir do ácido ricinoléico do óleo da mamona, foi estudado com o objetivo de avaliar seus efeitos cardiovasculares, utilizando abordagens in vivo e in vitro. Em ratos normotensos, o NCOE (10; 20; 30; 40 e 60 mg/kg, i.v.) promoveu hipotensão (- 2,5 ± 0,9; -3,9 ± 0,7; -31,0 ± 6,6; -40,6 ± 3,9 e -50,4 ± 3,5%) e bradicardia (-5,6 ± 0,9; -8,9 ± 1,0; -57,2 ± 8,9; -70,9 ± 5,3 e -77,9 ± 2,7%) transientes, ambas dependente de dose. Em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, pré-contraídos com fenilefrina (FEN) (1 μM), o NCOE (10-10 - 10-3 M) induziu vasorrelaxamento, dependente de concentração, na presença (Emáx = 107,3 ± 4,43%; pD2 = 5,59 ± 0,06) e ausência (Emáx = 118,0 ± 3,53%; pD2 = 5,90 ± 0,05) do endotélio, sugerindo que o efeito do NCOE parece ser independente dos fatores liberados pelo endotélio. Todos os experimentos subsequentes foram realizados na ausência do endotélio. O efeito do NCOE foi atenuado após contração induzida por solução despolarizante de 60 mM de KCl (Emáx = 92,0 ± 4,1%), quando comparado com o efeito do NCOE frente à FEN. A pré-incubação com PTIO (300 μM), sequestrador do NO na forma radicalar (NO●), atenuou a potência do vasorrelaxamento do NCOE (pD2 = 5,10 ± 0,05), sugerindo a participação do NO● no efeito deste nitrato. Entretanto, na presença de L-cisteína (3 mM), um sequestrador do NO na forma reduzida (NO-), o vasorrelaxamento do NCOE foi potencializado (pD2 = 6,34 ± 0,03). Efeito semelhante foi observado na presença da N-acetilcisteína (NAC) (3 mM), um sequestrador de radicais livres intracelulares (pD2= 6,56 ± 0,05). O efeito do NCOE não foi alterado na presença do proadifeno (10 μM), um inibidor do citocromo P450 (pD2 = 5,99 ± 0,07%). No entanto, o efeito vasorrelaxante foi reduzido na presença da cianamida (1 mM), inibidor da aldeído desidrogenase mitocondrial (mtALDH) (Emàx = 94,3 ± 6,26%); e do ODQ 10 μM, inibidor da ciclase de guanilil solúvel (sGC) (Emáx = 55,2± 3,60%), sugerindo o envolvimento destas enzimas no efeito do NCOE. Após pré-incubação com TEA (3 mM), concentração que bloqueia de forma não seletivo os canais para K+, o vasorrelaxamento do nitrato foi atenuado (Emáx = 107,1 ± 7,09%), demonstrando o envolvimento destes canais neste efeito. Ao utilizar a iberiotoxina (100 nM) e a glibenclamida (10 μM), bloqueadores seletivos dos BKCa e KATP, respectivamente, o efeito vasodilatador foi diminuído (Emàx = 106,2 ± 1,49%; pD2 = 5,61 ± 0,04, respectivamente); entretanto, o efeito não foi modificado na presença de 4-aminopiridina (1 mM), bloqueador dos KV (pD2 = 5,70 ± 0,04%). Além disso, NCOE aumentou os níveis de NO em células musculares lisas de aorta, detectado pela fluorescência emitida por DAF-2T. Estes resultados, em conjunto, sugerem que NCOE induz hipotensão e bradicardia transientes, e promove vasorrelaxamento, devido a liberação de NO●, por meio da metabolização do composto via mtALDH, e consequente ativação da sGC e dos canais KATP e KBCa.