Shiga Toxin (Stx)-konvertierende Bakteriophagen besitzen eine konservierte lambdo-ide Genomstruktur, weisen aber ein hohes Maß an genetischer Diversität auf. Aus diesem Grund wurden die bereits vorhandenen Sequenzdaten der Stx1-Phagen CP-1639 des Escherichia coli O111:H- Stammes 1639/77 und BP-4795 des E. coli O84:H4 Stammes 4795/97 vervollständigt und analysiert. Im Gegensatz zu dem induzierbaren Bakteriophagen BP-4795 fehlen CP-1639 einige Gene, die für den lytischen Lebenszyklus eines Bakteriophagen notwendig sind. Daher handelt es sich bei CP-1639 um einen kryptischen Prophagen, der nicht mehr in der Lage ist das Wirtschromosom zu verlassen und intakte Phagenpartikel zu bilden. Die Integra-tionsstellen wurden innerhalb des Gens yehV für BP-4795 und ssrA für CP-1639 bestimmt. In unmittelbarer Umgebung des Integrationsortes von CP-1639 befindet sich ein eigenständiges integratives Element. Dieses besteht aus drei offenen Lese-rahmen unbekannter Herkunft, sowie einem Integrasegen und kann auch ohne Assoziation mit Phagen-DNA auftreten. Phagen können zusätzlich zu ihrem Genom Gene bakteriellen Ursprungs tragen. Diese können unter anderem infolge von Transpositionen oder einer unkorrekten Exzision der Phagen-DNA aus dem Wirtschromosom während des lytischen Lebenszyklus in das betreffende Phagengenom eingebaut werden. Eines solches Gen des Bakteriophagen BP-4795 kodiert das Typ III Effektorprotein NleA4795, dessen Funktionalität nach dem C-terminalen Einbau von neun Codons des Hämagglutinin (HA)-Epitopes des humanen Influenzavirus in die Sequenz des Gens nleA4795 überprüft wurde. Dies erfolgte unter Verwendung der Western Blot Analyse durch die Expression dieses Fusionsproteins in dem Wildtyp-Stamm 4795/97 und in der Deletionsmutante 4795escN des Stammes 4795/97. Die Typ III Sekretionssys-tem (T3SS)-inaktive Mutante 4795escN wurde im Verlauf dieser Arbeit hergestellt. Diese Untersuchungen zeigten ebenfalls, dass zur Sekretion von NleA4795 ein in-taktes T3SS notwendig ist. Weiterhin zeigte die Infektion einer HeLa-Zelllinie mit NleA4795-HA exprimierenden Bakterienstämmen und die anschließende Analyse mit Hilfe der Immunfluoreszenz, die Translokation des Proteins in eukaryotische Wirts-zellen. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse dieser Untersuchung auf eine Lokali-sation von NleA4795-HA innerhalb des Trans-Golgi Netzwerkes hin. Die Verbreitung des Gens nleA wurde in insgesamt 170 Shiga Toxin-produzierenden E. coli und enteropathogenen E. coli Stämmen untersucht. Dies führte zur Identifika-tion von 14 verschiedenen Varianten des Gens nleA in 149 der überprüften Stämme, wobei mit Ausnahme von zwei Isolaten ebenfalls ein Markergen des T3SS nachge-wiesen werden konnte. Neben drei bereits bekannten Varianten konnten elf neue Varianten identifiziert werden, deren abgeleitete Aminosäuresequenzen sich zu 71% bis 96% glichen. Sequenzunterschiede traten insbesondere aufgrund der Deletion oder Insertion von vier bis 51 Aminosäuren im Mittelteil der potentiellen Proteine auf. Weiterhin deuten die Ergebnisse dieser Untersuchungen eine Assoziation bestimm-ter Varianten des Gens nleA mit spezifischen E. coli Serogruppen an. Southern-Blot Hybridisierungen zeigten, dass etwa ein Viertel der nleA-positiven Stämme zwei Ko-pien dieses Gens in ihrem Genom tragen. Hierbei handelt es sich meist um zwei verschiedene Varianten. In fast allen Fällen kodiert eine dieser Varianten, aufgrund einer Punktmutation oder Insertion eines IS-Elementes, ein verkürztes und vermut-lich nicht funktionelles Protein. Mit Hilfe von Transduktionsexperimenten konnten verschiedene Varianten des Gens nleA im Genom induzierbarer Phagen nachge-wiesen werden, was auf eine Verbreitung des Gens nleA durch den horizontalen Gentransfer hinweist.

Shiga Toxin (Stx)-konvertierende Bakteriophagen besitzen eine konservierte lambdo-ide Genomstruktur, weisen aber ein hohes Maß an genetischer Diversität auf. Aus diesem Grund wurden die bereits vorhandenen Sequenzdaten der Stx1-Phagen CP-1639 des Escherichia coli O111:H- Stammes 1639/77 und BP-4795 des E. coli O84:H4 Stammes 4795/97 vervollständigt und analysiert. Im Gegensatz zu dem induzierbaren Bakteriophagen BP-4795 fehlen CP-1639 einige Gene, die für den lytischen Lebenszyklus eines Bakteriophagen notwendig sind. Daher handelt es sich bei CP-1639 um einen kryptischen Prophagen, der nicht mehr in der Lage ist das Wirtschromosom zu verlassen und intakte Phagenpartikel zu bilden. Die Integra-tionsstellen wurden innerhalb des Gens yehV für BP-4795 und ssrA für CP-1639 bestimmt. In unmittelbarer Umgebung des Integrationsortes von CP-1639 befindet sich ein eigenständiges integratives Element. Dieses besteht aus drei offenen Lese-rahmen unbekannter Herkunft, sowie einem Integrasegen und kann auch ohne Assoziation mit Phagen-DNA auftreten. Phagen können zusätzlich zu ihrem Genom Gene bakteriellen Ursprungs tragen. Diese können unter anderem infolge von Transpositionen oder einer unkorrekten Exzision der Phagen-DNA aus dem Wirtschromosom während des lytischen Lebenszyklus in das betreffende Phagengenom eingebaut werden. Eines solches Gen des Bakteriophagen BP-4795 kodiert das Typ III Effektorprotein NleA4795, dessen Funktionalität nach dem C-terminalen Einbau von neun Codons des Hämagglutinin (HA)-Epitopes des humanen Influenzavirus in die Sequenz des Gens nleA4795 überprüft wurde. Dies erfolgte unter Verwendung der Western Blot Analyse durch die Expression dieses Fusionsproteins in dem Wildtyp-Stamm 4795/97 und in der Deletionsmutante 4795escN des Stammes 4795/97. Die Typ III Sekretionssys-tem (T3SS)-inaktive Mutante 4795escN wurde im Verlauf dieser Arbeit hergestellt. Diese Untersuchungen zeigten ebenfalls, dass zur Sekretion von NleA4795 ein in-taktes T3SS notwendig ist. Weiterhin zeigte die Infektion einer HeLa-Zelllinie mit NleA4795-HA exprimierenden Bakterienstämmen und die anschließende Analyse mit Hilfe der Immunfluoreszenz, die Translokation des Proteins in eukaryotische Wirts-zellen. Darüber hinaus deuten die Ergebnisse dieser Untersuchung auf eine Lokali-sation von NleA4795-HA innerhalb des Trans-Golgi Netzwerkes hin. Die Verbreitung des Gens nleA wurde in insgesamt 170 Shiga Toxin-produzierenden E. coli und enteropathogenen E. coli Stämmen untersucht. Dies führte zur Identifika-tion von 14 verschiedenen Varianten des Gens nleA in 149 der überprüften Stämme, wobei mit Ausnahme von zwei Isolaten ebenfalls ein Markergen des T3SS nachge-wiesen werden konnte. Neben drei bereits bekannten Varianten konnten elf neue Varianten identifiziert werden, deren abgeleitete Aminosäuresequenzen sich zu 71% bis 96% glichen. Sequenzunterschiede traten insbesondere aufgrund der Deletion oder Insertion von vier bis 51 Aminosäuren im Mittelteil der potentiellen Proteine auf. Weiterhin deuten die Ergebnisse dieser Untersuchungen eine Assoziation bestimm-ter Varianten des Gens nleA mit spezifischen E. coli Serogruppen an. Southern-Blot Hybridisierungen zeigten, dass etwa ein Viertel der nleA-positiven Stämme zwei Ko-pien dieses Gens in ihrem Genom tragen. Hierbei handelt es sich meist um zwei verschiedene Varianten. In fast allen Fällen kodiert eine dieser Varianten, aufgrund einer Punktmutation oder Insertion eines IS-Elementes, ein verkürztes und vermut-lich nicht funktionelles Protein. Mit Hilfe von Transduktionsexperimenten konnten verschiedene Varianten des Gens nleA im Genom induzierbarer Phagen nachge-wiesen werden, was auf eine Verbreitung des Gens nleA durch den horizontalen Gentransfer hinweist.

La présentation antigénique par les molécules de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH II) est un mécanisme essentiel au contrôle des pathogènes par le système immunitaire. Le CMH II humain existe en trois isotypes, HLA-DP, DQ et DR, tous des hétérodimères composés d’une chaîne α et d’une chaîne β. Le CMH II est entre autres exprimé à la surface des cellules présentatrices d’antigènes (APCs) et des cellules épithéliales activées et a pour fonction de présenter des peptides d’origine exogène aux lymphocytes T CD4+. L’oligomérisation et le trafic intracellulaire du CMH II sont largement facilités par une chaperone, la chaîne invariante (Ii). Il s’agit d’une protéine non-polymorphique de type II. Après sa biosynthèse dans le réticulum endoplasmique (ER), Ii hétéro- ou homotrimérise, puis interagit via sa région CLIP avec le CMH II pour former un complexe αβIi. Le complexe sort du ER pour entamer son chemin vers différents compartiments et la surface cellulaire. Chez l’homme, quatre isoformes d’Ii sont répertoriées : p33, p35, p41 et p43. Les deux isoformes exprimées de manière prédominante, Iip33 et p35, diffèrent par une extension N-terminale de 16 acides aminés portée par Iip35. Cette extension présente un motif de rétention au réticulum endoplasmique (ERM) composé des résidus RXR. Ce motif doit être masqué par la chaîne β du CMH II pour permettre au complexe de quitter le ER. Notre groupe s’est intéressé au mécanisme du masquage et au mode de sortie du ER des complexes αβIi. Nous montrons ici que l’interaction directe, ou en cis, entre la chaîne β du CMH II et Iip35 dans une structure αβIi est essentielle pour sa sortie du ER, promouvant la formation de structures de haut niveau de complexité. Par ailleurs, nous démontrons que NleA, un facteur de virulence bactérien, permet d’altérer le trafic de complexes αβIi comportant Iip35. Ce phénotype est médié par l’interaction entre p35 et les sous-unités de COPII. Bref, Iip35 joue un rôle central dans la formation des complexes αβIi et leur transport hors du ER. Ceci fait d’Iip35 un régulateur clef de la présentation antigénique par le CMH II. / Antigen presentation by the major histocompatibility complex class II molecules (MHCII) is a pathway essential to the immune system control over pathogens. There are three MHCII isotypes in humans, which are HLA-DP, DQ and DR. These are all heterodimers made of an α and a β chain. MHCII is expressed at the cell surface of antigen presenting cells (APCs) and activated epithelial cells and its role is mainly to present peptides of exogenous origin to CD4+ T lymphocytes. MHCII oligomerization and trafficking are largely favored by its chaperone, the invariant chain (Ii). Ii is a non-polymorphic type II protein. It hetero- or homotrimerizes right after biosynthesis in the endoplasmic reticulum (ER), and then its CLIP region interacts with MCHII to form a αβIi structure. This multimer exits the ER and starts its journey towards numerous compartments and the cell surface. Humans have four Ii isoforms: p33, p35, p41 et p43. The two most predominantly expressed are Ii p33 and p35. They differ in a N-terminal extension long of 16 amino acids that is displayed by Iip35. This extension bears an ER retention motif (ERM) made of the RXR residues. The RXR motif must be masked by the MHCII β chain in order for the αβIi multimer to exit the ER. Our group investigated the masking and ER exit mechanisms of the αβIi structures. Here we show that a direct (cis) interaction between the MHCII β chain and Iip35 is essential for ER exit, thus promoting the formation of high order αβIi structures. Moreover, we demonstrate that the bacterial virulence factor NleA impairs the trafficking of Iip35-containing αβIi multimers. This observation is mediated by an interaction between COPII subunits and Iip35. Altogether, Iip35 plays a crucial role in the αβIi multimer formation and ER exit. Iip35 is therefore a key regulator for MHCII antigen presentation.

La chaîne invariante (Ii) agit à titre de chaperon dans l’assemblage et le trafic des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMHII). Chez l’humain, les deux isoformes prédominantes, p33 et p35, diffèrent par la présence d’un motif di-arginine (RXR). Ce dernier permet la rétention de p35 au réticulum endoplasmique (RE) jusqu’à son masquage par une molécule de CMHII. La chaîne invariante forme des trimères auxquels s’associent successivement jusqu’à trois dimères αß de CMHII résultant en la formation de pentamères, heptamères et nonamères. Toutefois, la stœchiométrie exacte des complexes Ii-CMHII qui quittent le RE et le mécanisme permettant le masquage du motif RXR demeurent un sujet de débats. Dans un premier temps, nous avons examiné par une approche fonctionnelle la stœchiométrie des complexes formés autour de p33 et de p35. Nous avons observé que p35 engendre la formation de complexes nonamériques (αßIi)3 et permet l’incorporation de différents isotypes de CMHII autour d’un même trimère de p35 alors que p33 facilite la formation de pentamères (αß)1Ii3. Lors de l’étude du masquage du motif RxR par les CMHII, nous avons montré que son inactivation requiert une interaction directe (en cis) entre les sous-unités p35 et CMHII, résultant en une rétention des trimères de p35 insaturés au RE. Aussi, nous avons observé que contrairement aux complexes p33-CMHII, les complexes p35-CMHII sont retenus au RE lorsque coexprimés avec la protéine NleA de la bactérie Escherichia coli entérohémorragique. Comme l’expression de NleA interfère avec la formation des vésicules COPII responsable de l’export du RE, nous supposons que la sortie du RE des complexes p35-CMHII dépend des vésicules COPII alors que la sortie des complexes formés autour de l’isoforme p33 est indépendante de la formation de ces vésicules. La trimérisation d’Ii représente la toute première étape dans la formation des complexes Ii-CMHII. Deux domaines d’Ii permettent la formation de trimères; le domaine de trimérisation (TRIM) et le domaine transmembranaire (TM). Nous nous sommes intéressés à la nécessité de ces domaines dans la trimérisation de la chaîne et la formation subséquente de complexes avec les CMHII. Nous avons démontré que le domaine TRIM n’est pas essentiel à la trimérisation de la chaîne, à la formation de pentamères et de nonamères ainsi qu’au trafic adéquat de ces complexes Ii-CMHII dans la cellule. En absence des domaines TM d’Ii et des CMHII, nous avons observé la formation de complexes pseudo-nonamériques. Ceci suppose que la présence de ce domaine n’est pas un prérequis à la formation de nonamères. En conséquence, la présence d’un seul domaine de trimérisation de Ii est requise pour la formation de trimères et de complexes nonamériques. L’ensemble de nos résultats démontrent que la fonction de p35 n’est pas redondante à celle de p33. p35 influence de manière distincte le trafic des CMHII puisqu’il affecte la stœchiométrie des sous-unités incorporées aux complexes Ii- CMHII. / The invariant chain (Ii) assists in the folding and trafficking of MHC class II molecules (MHCII). Four different isoforms of the human Ii have been described (p33, p35, p41 and p43). The main isoforms, p33 and p35, differ by the presence of a di-arginine (RXR) endoplasmic reticulum (ER) retention motif in p35. This motif is inactivated upon binding of MHCII. In the ER, p33 and p35 assemble into trimers before associating with MHCII. The sequential binding of up to three MHCII αß dimers to Ii trimers results in the formation of pentamers, heptamers and nonamers. However, the exact stoichiometry of the Ii-MHCII complex and the mechanism allowing shielding of the ER retention motif remain a matter of debate. To shed light on these issues, we chose a functional approach to examine the stoichiometry of complexes formed around the p33 and p35 isoforms. We showed that p35 promotes formation of nonameric complexes (αßIi)3 while formation of pentameric complexes (αß)1Ii3 was observed for p33. We then showed that formation of nonameric complexes can result in the inclusion of distinct MHCII isotypes around a single trimeric p35 scaffold. When answering the question wetter masking of the p35 RXR motif by MHCII results in the formation of nonamers, we showed that the actual inactivation of motif requires a direct cis-interaction between p35 and the MHCII, precluding ER egress of unsaturated p35 trimers. Interestingly, as opposed to p33-MHCII complexes, p35-MHCII complexes remained in the ER when co-expressed with the NleA protein of enterohaemorrhagic Escherichia coli. Expression of this bacterial protein is thought to interfere with the formation of COPII vesicles, leading to the conjecture that p35-MHCII and p33-MHCII complexes exit the ER in a COPII-dependant and COPII-independent manner, respectively. The trimerization of Ii represents the very first step in the formation of Ii-MHCII complex. Two domains of Ii, the trimerization domain (TRIM) and the transmembrane (TM) domain have been shown to trigger the trimerization of the chain. We focused our attention on the requirement of the two trimerization domains in Ii self-association and in the formation of pentameric and nonameric complexes. We showed that the TRIM domain of Ii is not essential for the chain’s trimerization, formation of pentamers and nonamers and for proper traffic with MHCII molecules. In absence of the Ii and MHCII TM domains, we observed the formation of a nonamer-like structure hereby suggesting that the presence of this domain is not a prerequisite for nomamer complex formation. Consequently, our results showed that either Ii trimerization domains are sufficient for Ii trimer formation and nonameric complex trafficking. Taken together, our results demonstrate that the function of the p35 isoform is not redundant, influencing distinctively MHCII trafficking as the subunit stoichiometry of oligomeric Ii/MHCII complexes is affected by p35.