Les avancées des nouvelles techniques de séquençage (NGS) ont permis dans le cadre des études en écologie microbienne de passer de l'analyse de quelques centaines de séquences par étude à des centaines de millions de séquences. Cette différence quantitative des données produites a induit des différences qualitatives quant aux études réalisées. En effet, avec le changement du type de données, les approches classiques d'analyse ne peuvent être appliquées et il est devenu nécessaire de définir de nouvelles stratégies en tenant compte des contraintes que posent ces données. Alors qu'il était possible d'insérer classiquement quelques dizaines de séquences issues des techniques de première génération dans des phylogénies expertisées, le nombre de séquences généré aujourd'hui par les NGS à chaque expérience rend cette tâche irréalisable et nécessite la mise en place de nouvelles stratégies et l'utilisation d'outils adaptés. Par ailleurs, les outils disponibles d'analyse de la diversité microbienne adaptés aux amplicons de nouvelle génération, implémentent des approches probabilistes et/ou de recherche de similitude pour l'identification des séquences environnementales. L'approche phylogénétique quant à elle, bien qu'elle soit la plus robuste, n'est pas utilisée pour l'annotation taxonomique de ce type de données du fait de ses besoins en temps et en ressources de calcul. Au-delà de l'approche d'annotation taxonomique, les nouvelles techniques de séquençage posent également le problème de la qualité des séquences produites et son impact sur l'estimation de la diversité. Ainsi, ce travail de thèse avait pour objectif la définition d'une stratégie d'analyse bioinformatique de données de séquençage massif dans le contexte de l'étude de la diversité microbienne, en tenant compte des limitations imposées par les ressources informatiques actuelles (matérielles et logicielles) d'un côté, et de l'avantage des méthodes phylogénétiques par rapport aux autres approches d'annotation taxonomique. Ce travail a donné lieu au développement d'une chaîne de traitement proposant une série d'analyses allant des séquences brutes jusqu'à la visualisation des résultats, tout en replaçant les séquences environnementales dans un contexte évolutif. L'approche développée a été optimisée pour la gestion de gros volumes de données, et a été comparée en terme de précision d'affiliation aux autres approches communément utilisées en écologie microbienne. Les tests et simulations ont montré qu'à partir d'une taille d'amplicons de 400 pb, l'affiliation phylogénétique avait les meilleurs résultats mais aussi, que la qualité de cette affiliation différait selon la région hypervariable ciblée. La chaîne de traitements mise en place a ensuite été par implémentée dans un contexte de calcul à haute performance, notamment sur un cluster de calcul, pour proposer un service web dédié à l'analyse de la diversité microbienne. / The characterization of microbial community structure via SSU rRNA gene profiling has been greatly advanced in recent years by the introduction of NGS amplicons, leading to a better representation of sample diversity at a lower cost. This progress in method development has provided a new window into the composition of microbial communities and sparked interest in the members of the rare biosphere. Concurrently, the processing of such amount of data has become an important bottleneck for the effectiveness of microbial ecology studies, and a multitude of analysis platforms have been developed for the handling of these data. As implemented, these tools have a steep learning curve for the biologist who is not computationally inclined, as they require extensive user intervention and consume many CPU hours due to dataset analysis and complexity, which can present a significant barrier to researchers. Moreover, although phylogenetic affiliation has been shown to be more accurate for the taxonomic assignment of NGS reads, the existing tools assign taxonomy by either a similarity search or a probabilistic approach, with the phylogenies being restricted to samples' comparison. Beyond the taxonomic assignment, the new sequencing technologies also arise the problem of the quality of the generated sequences and its impact on the richness estimation. In this work, we aimed to define a strategy for the bioinformatic analysis of high-throughput sequences in order to depict the microbial diversity, taking into account both the limitations imposed by current computer resources (hardware and software), and the advantage of the phylogenetic methods over the other taxonomic annotation approaches. This work has led to the development of a pipeline offering a set of analyzes ranging from raw sequences processing to the visualization of the results, while replacing the environmental sequences in an evolutionary framework. The developed approach was optimized for managing large volumes of data, and has been compared in term of the accuracy of taxonomic assignment to the approaches commonly used in the field of microbial ecology. This pipeline was then used to the developement of a dedicated web server for high-throughput sequencing analysis, that relies on a computing cluster and performs large-scale phylogeny-based analyses of rRNA genes with no need for specialized informatics expertise, and uses the phylogenies for both the taxonomy assessment and the delineation of monophyletic groups to highlight clades of interest.

Les mutations de résistance pour une molécule sont produites avant que la molécule en question ne soit utilisée, et c’est sous « pression de sélection » que la souche résistante va être sélectionnée. Des données récentes montrent que des variants résistants minoritaires (VRMs) peuvent être une source d’échec virologique. Les nouvelles techniques de séquençage sont bien plus sensibles que les techniques classiques de séquençage et permettent la détection des VRMs. Afin d’évaluer l’intérêt de l’utilisation de ces techniques, nous avons étudié les prélèvements de patients en situation d’échec virologique après traitement par deux combinaisons antirétrovirales très utilisées (tenofovir/emtricitabine/efarirenz et tenofovir/emtricitabine/rilpivirine). De nombreux variants de résistance supplémentaires ont été détectés, touchant principalement la classe des Inhibiteurs Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse (INTIs), avec un impact potentiel sur le choix du traitement de relais. Nous avons également étudié la prévalence des mutations de résistance transmise sur le gène de la protéase et de la transcriptase inverse chez des patients naïfs chroniquement infectés, chez deux groupes de transmission : des patients hommes ayant des rapports avec d’autres hommes (HSH), et des patients hétérosexuels. Nous avons retrouvé une prévalence plus élevée de mutations touchant les INTIs dans le groupe des patients hétérosexuels. Parmi les patients HSH, ceux infectés par un virus de sous-type B étaient plus fréquemment infectés par un virus résistant. Cette thèse met en avant la puissance des ces techniques, dont les conditions d'utilisation ne sont pas encore complètement définies. / Resistance mutations for a given molecule are produced before the molecule is used, and it is under "selection pressure" that the resistant strain will be selected. Recent data show that minority resistant variants (MRV) can be a source of virologic failure. New sequencing techniques are much more sensitive than conventional sequencing techniques and allow MRV detection. To assess the value of these new techniques, we studied samples from patients experiencing virologic failure after treatment with two antiretroviral combinations widely used (tenofovir/emtricitabine/efarirenz et tenofovir/emtricitabine/rilpivirine). Many additional resistance variants affecting the class of nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTIs) were detected, with a potential impact on the choice of the subsequent regimen. We also studied the prevalence of transmitted resistance mutations in the protease and reverse transcriptase genes among naive patients chronically infected, among two groups of transmission: patients of men who have sex with men (MSM) and heterosexual patients. We found a higher prevalence of NRTI mutations among the heterosexual group. Among MSM patients, those infected with subtype B viruses were more frequently infected with a resistant virus. This thesis highlights the power of these techniques, the conditions of use are not yet fully defined.

Les avancées des nouvelles techniques de séquençage (NGS) ont permis dans le cadre des études en écologie microbienne de passer de l'analyse de quelques centaines de séquences par étude à des centaines de millions de séquences. Cette différence quantitative des données produites a induit des différences qualitatives quant aux études réalisées. En effet, avec le changement du type de données, les approches classiques d'analyse ne peuvent être appliquées et il est devenu nécessaire de définir de nouvelles stratégies en tenant compte des contraintes que posent ces données. Alors qu'il était possible d'insérer classiquement quelques dizaines de séquences issues des techniques de première génération dans des phylogénies expertisées, le nombre de séquences généré aujourd'hui par les NGS à chaque expérience rend cette tâche irréalisable et nécessite la mise en place de nouvelles stratégies et l'utilisation d'outils adaptés. Par ailleurs, les outils disponibles d'analyse de la diversité microbienne adaptés aux amplicons de nouvelle génération, implémentent des approches probabilistes et/ou de recherche de similitude pour l'identification des séquences environnementales. L'approche phylogénétique quant à elle, bien qu'elle soit la plus robuste, n'est pas utilisée pour l'annotation taxonomique de ce type de données du fait de ses besoins en temps et en ressources de calcul. Au-delà de l'approche d'annotation taxonomique, les nouvelles techniques de séquençage posent également le problème de la qualité des séquences produites et son impact sur l'estimation de la diversité. Ainsi, ce travail de thèse avait pour objectif la définition d'une stratégie d'analyse bioinformatique de données de séquençage massif dans le contexte de l'étude de la diversité microbienne, en tenant compte des limitations imposées par les ressources informatiques actuelles (matérielles et logicielles) d'un côté, et de l'avantage des méthodes phylogénétiques par rapport aux autres approches d'annotation taxonomique. Ce travail a donné lieu au développement d'une chaîne de traitement proposant une série d'analyses allant des séquences brutes jusqu'à la visualisation des résultats, tout en replaçant les séquences environnementales dans un contexte évolutif. L'approche développée a été optimisée pour la gestion de gros volumes de données, et a été comparée en terme de précision d'affiliation aux autres approches communément utilisées en écologie microbienne. Les tests et simulations ont montré qu'à partir d'une taille d'amplicons de 400 pb, l'affiliation phylogénétique avait les meilleurs résultats mais aussi, que la qualité de cette affiliation différait selon la région hypervariable ciblée. La chaîne de traitements mise en place a ensuite été par implémentée dans un contexte de calcul à haute performance, notamment sur un cluster de calcul, pour proposer un service web dédié à l'analyse de la diversité microbienne.