Os métodos sorológicos para determinar o fenótipo Vel- requerem o uso de antissoros humanos raros e não permitem o rastreamento de muitas amostras ao mesmo tempo, limitando sua aplicação como ferramenta para busca de doadores raros. Neste estudo, desenvolvemos uma estratégia de triagem molecular de baixo custo, usando PCR em tempo real e reciclagem do DNA extraído de pools de plasma da rotina viral NAT (Teste de Ácido Nucleico) para identificar doadores Vel- e Vel+W. Um total de 25.322 doadores de sangue do Sudeste Brasileiro foram genotipados por PCR em tempo real para detectar a deleção de 17nt (c.64_80del17) no gene SMIM1, que determina o fenótipo Vel-, utilizando DNA extraído de pools de plasma de seis doadores rotineiramente descartados após a liberação dos resultados NAT para HBV, HCV e HIV. Cento e oitenta e oito (188) de 4.220 pools foram reativos para deleção. A deleção SMIM1*64_80del17 estava presente em 210 doadores sendo em 208 (0,4%) em heterozigose e em apenas dois (0,008%), em homozigose. A estratégia de genotipagem de pools de DNA, usando o ensaio de PCR em tempo real, desenhado para a identificação da deleção de 17 nucleotídeos no gene SMIM1, mostrou-se eficaz e acurada na identificação de doadores com fenótipo Vel- e Vel+W. A reciclagem do DNA da rotina NAT a torna uma técnica economicamente atrativa e definitivamente superior às técnicas sorológicas para o rastreamento deste fenótipo raro. / Serologic methods to determine the Vel- phenotype require the use of rare human antisera and do not allow for many samples to be tested simultaneously, which limits their application as a tool to search for rare donors. This study developed a low-cost molecular screening strategy using the real-time polymerase chain reaction (PCR) with DNA extracted from plasma pools used for viral nucleic acid test (NAT) screening, to identify Vel- and Vel+W donors. A total of 25,322 blood donors from the Brazilian southeast region were genotyped through real-time PCR targeting the 17-nucleotide (c.64_80del17) deletion in the SMIM1 gene, which determines the Vel- phenotype, by using leftover nucleic acid from plasma pools of six donors, routinely discarded after the release of viral NAT results. One hundred and eighty eight from 4,220 pools tested were reactive. The SMIM1*64_80del17 deletion was present in 210 donors, 208 (0.4%) in heterozygosity and only 2 in homozygosis (0.008%). The DNA pool genotyping strategy using real-time PCR designed to detect the deletion in the SMIM1 gene proved effective and accurate in identifying donors with the Vel- and Vel+W phenotypes. The fact that residual nucleic acid from routine viral NAT screening was successfully employed renders this technique economically attractive and definitely superior to the serologic techniques available to search for this rare phenotype