Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-07-13T16:07:40Z No. of bitstreams: 1 2017_KaianAmorimTeles.pdf: 9165310 bytes, checksum: 0f2627fbc50890dca9c01374109f19e7 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-08-28T20:52:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_KaianAmorimTeles.pdf: 9165310 bytes, checksum: 0f2627fbc50890dca9c01374109f19e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-28T20:52:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_KaianAmorimTeles.pdf: 9165310 bytes, checksum: 0f2627fbc50890dca9c01374109f19e7 (MD5) Previous issue date: 2017-08-28 / A cromatina é uma estrutura fundamental para a fisiologia celular e pode ser regulada através de uma variedade de pequenas moléculas e proteínas que, em sua maioria, atuam em nível nucleossomal. A competição entre diferentes Proteínas Ligantes de Nucleossomo (NBPs) ajudam a definir o estado final da cromatina. Embora toda a superfície do nucleossomo seja alvo de diferentes NBPs, uma região conhecida como patch acídico é o alvo preferêncial dessas moléculas. A fim de compreender como o impacto que NBPs tem sob o nucleossomo o ensaio de thermal shift foi feito para desvendar como diferentes NBPs afetam a estabilidade desse complexo. Foram utilizadas peptídeos baseados nas NBPs identificadas que se ligam aos nucleossomos conhecidos como Nucleosome Biding Molecules (NBMs). Foi observado que diferentes sítios de ligação que NBMs fazem com o patch acídico induzem diferentes desfechos na desnaturação do nucleossomo. Assim, foi possível criar um mapa das regiões vitais da superfície do nucleossomo responsável pela estabilidade do complexo utilizando os dados estruturais (PDB) do nucleossomo:NBPs, que futuramente pode será utilizado para o desenho racional de fármacos. / The chromatin is a fundamental structure for the cell physiology. It can be regulated trough a variety of small molecules and proteins, most of which acting at a nucleosomal level. The competition among Nucleosome Binding Proteins (NBPs) binding help to define the final chromatin architecture. Although the entire nucleosome surface has been explored by several NBPs, a region known as the acidic patch is at the preferable target. In order to understand how the NBPs impact the nucleosome, thermal shift assay was conducted to understand how different NBPs influence over the stability fo the complex. We used peptides based on the structure of NBPs known as Nucleosome Biding Molecules (NBMs). We were able to identify biding sites that NBMs interact with the acidic patch and induce several denaturation outcomes of the nucleosome. Herein it was possible to create a map of the vital regions of the surface of the nucleosome responsable for the stability of the complex, using structural data (PDB) of the nucleosome:NBPs, that in the future can be used in rational drug design.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2018-04-10T17:38:54Z No. of bitstreams: 1 2017_CamylaMaradaSilvaRibeiro.pdf: 2147624 bytes, checksum: bc4db3ff95897ee865d19ffe7b63a8b4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-04-11T16:47:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_CamylaMaradaSilvaRibeiro.pdf: 2147624 bytes, checksum: bc4db3ff95897ee865d19ffe7b63a8b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T16:47:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_CamylaMaradaSilvaRibeiro.pdf: 2147624 bytes, checksum: bc4db3ff95897ee865d19ffe7b63a8b4 (MD5) Previous issue date: 2018-04-11 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). / O DNA de organismos eucarióticos é organizado sob a forma de cromatina, sendo responsável pela regulação da transcrição, replicação e reparo do DNA. O nucleossomo, unidade fundamental da cromatina, compreende estrutura formada por uma sequência de DNA enrolada no octâmero de histonas, chegando a altos níveis de compactação que dão origem ao cromossomo. Para o estudo da estrutura do nucleossomo, é imprescindível a sua reconstituição in vitro, na qual faz-se necessário um método eficiente para a obtenção de histonas recombinantes. Existem diversos protocolos para expressão e purificação de histonas recombinantes publicados na literatura. Portanto, o objetivo deste trabalho é estabelecer um protocolo para obtenção de histonas canônicas recombinantes. Para estabelecimento do protocolo de expressão, duas cepas competentes de E. coli (Rosetta gami e Rosetta pLysS) foram testadas quanto a capacidade de produzir grande quantidade de histona recombinante por duas diferentes metodologias: expressão clássica com uso de IPTG e expressão espontânea. As histonas foram purificadas por extração de corpos de inclusão seguido por cromatografia de troca iônica. Surpreendentemente, os melhores resultados de expressão, para todas as histonas, foram obtidos pela metodologia de auto-expressão com uso de Rosetta pLysS. No entanto, com exceção da H3, bons resultados também foram adquiridos por expressão clássica com IPTG. Ajustes no protocolo de purificação foram realizados de forma a reduzir a degradação por proteases, grande desafio encontrado nesta etapa. A utilização de associação de inibidores favoreceu a modulação desta degradação. Assim, foi possível estabelecer um método para expressão e purificação de histonas de forma a obter grande quantidade de histona recombinante livres de degradação. / Eukaryotic DNA is organized into chromatin that regulates gene transcription, DNA replication and repair. Nucleosomes, the basic unit of chromatin, are formed by a sequence of DNA wrapped around a histone octamer, achieving high levels of compaction that goes to chromosome. In order to reconstitute nucleosomes in vitro to perform structural studies on chromatin, it is necessary to have an efficient method for recombinant histone production. Although there is several established protocols for expression and purification of recombinant histones, our challenge is to adapt a protocol that will be compatible with laboratory. For establishment of histone expression protocol, two competent E. coli strains (Rosetta gami and Rosetta pLysS) were tested about the ability to produce large amounts of recombinant histone by two different methodologies: classical expression using IPTG and spontaneous expression. The human histones H2A, H2B, H3 e H4 were purified from inclusion body followed by ion exchange chromatography. Surprisingly, the best expression results for all histones were obtained by spontaneous expression methodology using Rosetta pLysS. However, with the exception of H3, good results were also acquired by classical expression with IPTG. Adjustments in purification protocol were performed in order to reduce degradation by proteases, a challenge encountered in this step. The use of association of inhibitors helped the modulation of degradation. Thus, it was possible to establish a method for expression and purification of histones in order to obtain large amounts of recombinant histone free of degradation

Tese (doutorado)Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de pós-graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2016-02-29T14:34:43Z No. of bitstreams: 1 2015_FonkouaMartin_Parcial.pdf: 121564 bytes, checksum: 42680feed538c086a4126ab94233299e (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2016-02-29T15:14:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_FonkouaMartin_Parcial.pdf: 121564 bytes, checksum: 42680feed538c086a4126ab94233299e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-29T15:14:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_FonkouaMartin_Parcial.pdf: 121564 bytes, checksum: 42680feed538c086a4126ab94233299e (MD5) / O DNA em seres eucarióticos é organizado na forma de cromatina, sendo esta a principal responsável pela regulação de diversas atividades vitais para célula, como a transcrição e manutenção do genoma. A cromatina é um complexo formado por unidades repetitivas de nucleossomos e pode se apresentar na forma aberta (10nm-permissiva) ou fechada (30nm- repressiva). Está evidente que a dinâmica de modulação da estrutura da cromatina determina a resposta transcricional e consequentemente o desfecho clínico. Desta forma, com objetivo de se analisar a dinâmica da cromatina, (i) procuramos estabelecer o desenvolvimento de uma metodologia in vitro para o estudo estrutural da cromatina. Em seguida, (ii) objetivamos estudar a ação do etanol, um agente desidratante, sobre a formação do mononucleossomo e de longas fibras de cromatina reconstituídos in vitro e (iii) estabelecer a concentração ideal de colesterol para induzir a formação do cromatossomo, complexo nucleossomo e linker histona (H5). Observamos, por ensaios bioquímicos que o etanol aumenta a estabilidade do mononucleossomo e auxilia a formação de fibras de cromatina de 10nm. Contudo, não observamos nenhum efeito do etanol sobre a formação da fibra de 30nm reconstituída in vitro. Além disso, determinamos a concentração mínima e máxima de colesterol capaz de induzir a formação do cromatossomo. Esses resultados sugerem que o etanol e colesterol possam auxiliar os estudos estruturais da cromatina reconstituída in vitro e que a desidratação da cromatina, através destes agentes, possa afetar a dinâmica da cromatina. Ainda desconhecemos os efeitos fisiológicos destes achados, mas nossos resultados apontam para um novo campo de pesquisa ainda inexplorado, onde pequenas moléculas ligantes de nucleosssomo afetam a estrutura da cromatina. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The DNA in eukaryotic beings is organized in the form of chromatin, which is one of the main molecule responsible for the regulation of vital activities in the cell, such as transcriptional process and genome maintenance. Chromatin is a complex formed by a repetitive units call nucleosomes .It can be present in an open (10nm-permissive) or closed (30nm-repression) structure. It is now evident that the transcriptional response is related to the chromatin structure and dynamic and this determines clinical outcome. In this way, in order to analyse the dynamics of chromatin, we first seek to establish an in vitro methodology for the structural study of chromatin. Therefore, the objectives were to study the action of ethanol, a dehydrating agent, on the formation of mononucleosome and long fibres of chromatin reconstituted in vitro and; II) study the action of cholesterol on the formation of chromatosome, a nucleosome and linker histone (H5) complex. We observe, through biochemical assays that ethanol increases the stability of the mononucleossome and helps in the formation of 10nm chromatin fibres. However, we have noticed no effect of ethanol on the formation of the 30nm fibre reconstituted in vitro. Moreover, we observe that the cholesterol induces the formation of chromatosome. These results suggest that ethanol and cholesterol may help in the structural studies of chromatin reconstituted in vitro and that dehydration of chromatin, through these agents, can affect his dynamics .We still don't know about the physiological effects of these findings, however, our results pointed out a new research field still unexplored where small molecules are able to bind to mononucleosome and affect the chromatin structure.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-10-15T13:31:51Z No. of bitstreams: 1 2013_IsabelTorresGomesSilva.pdf: 3349378 bytes, checksum: e037fab7e2667f2730822d4822ab69d5 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-10-16T13:36:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_IsabelTorresGomesSilva.pdf: 3349378 bytes, checksum: e037fab7e2667f2730822d4822ab69d5 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-16T13:36:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_IsabelTorresGomesSilva.pdf: 3349378 bytes, checksum: e037fab7e2667f2730822d4822ab69d5 (MD5) / O DNA em seres eucarióticos é organizado na forma de cromatina, sendo esta a principal responsável por regular diversas atividades vitais para célula, como o processo transcricional e a manutenção do genoma. A cromatina é um complexo formado por unidades repetitivas de nucleossomos e pode se apresentar na forma aberta (10nm-permissiva) ou fechada (30nm-repressiva). Está evidente que a dinâmica de modulação da estrutura da cromatina determina a resposta transcricional e consequentemente clínica. Neste trabalho, os objetivos foram: i) estudar a ação do colesterol, um agente desidratante e importante molécula sinalizadora, sobre a arquitetura da fibra de cromatina e ii) estabelecer uma metodologia para obtenção do complexo de Receptor nuclear:mononucleossomo. Observamos, por ensaios bioquímicos e imagens de microscopia eletrônica de transmissão, que o colesterol auxilia a formação de fibras de cromatina de 10 e 30nm reconstituídas in vitro, por direcionar as histonas para interação com o DNA. Entretanto, o colesterol afetou a estabilidade de longas fibras de cromatina. Acreditamos que a alteração da estequiometria das moléculas de água com o nucleossomo, causada pela presença do colesterol, possa ter grande impacto na arquitetura da cromatina e que estes resultados obtidos in vitro sirvam de ponto de partida para novas investigações dentro do contexto celular. Na segunda parte, realizamos uma revisão bibliográfica sobre a ação dos RNs no contexto da cromatina, iniciando a construção de clones, contendo elementos responsivos à RNs com o DNA 601, de forte posicionamento de nucleossomos. Também, preparamos um fragmento de DNA 601 para início das reconstituições de mononucleossomo. Estes resultados irão ajudar a implementação de metodologias para estudos in vitro das interações de RNs a nucleossomos e cromatina. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The genome in eukaryotes is organized into chromatin, which is the main responsible for regulating many vital cell activities, such as the transcriptional process and the maintenance of genome. It is clear that the local chromatin state open (10nm fiber- permissive) or close (30nm fiber - repressive), regulates the access of transcription factors, co-regulators and basic transcription machinery to specific enhancers in target genes. Thus, it seems obvious that the dynamic modulation of the chromatin structure determines transcriptional and clinical outcome. Herein, we aimed: i) to study the action of cholesterol, a dehydrating agent and an important signalling molecule, on the architecture of the chromatin fiber and ii) to establish a methodology for obtaining the complex Nuclear Receptor: nucleosome. We aimed to dissect the role of the water and electrostatic forces on the three dimensional structure of the first level of folding of nucleosome arrays and the higher order structure of chromatin. By comparing long chromatin fibers reconstituted in vitro, in presence and in absence of cholesterol, we observed that cholesterol improves the 10 and 30nm fibers formation by freeing the highly basic histone octamers to interact with the highly negative DNA. However, by thermo-denaturation assays, cholesterol showed to severely affect chromatin fibers stability. These observations suggest that disturbing the water stoichiometry of a chromatin fiber may have a great impact on chromatin architecture. Moreover, these results can be seen as a start point to investigate the effect of cholesterol in vivo as a potential chromatin remodeler. In the second part, I conducted a literature review on the action of RNs in a chromatin context. We also initiated the construction of clones containing responsive elements to RNs with DNA 601that has strong positioning of nucleosomes. Besides that, we prepared a DNA array for nucleosomes reconstitutions in vitro. These results will help to establish a new methodology for in vitro studies of RNs interaction to nucleosomes and chromatin.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-08-10T16:13:17Z No. of bitstreams: 1 2017_WanessaFelixCabral.pdf: 3821764 bytes, checksum: c37c36b987640585747add58dc37e633 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-05T12:52:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_WanessaFelixCabral.pdf: 3821764 bytes, checksum: c37c36b987640585747add58dc37e633 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-05T12:52:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_WanessaFelixCabral.pdf: 3821764 bytes, checksum: c37c36b987640585747add58dc37e633 (MD5) Previous issue date: 2017-10-05 / A cromatina é um complexo macromolecular formado por unidades repetitivas básicas, o nucleossomo. Este, por sua vez, é constituído por DNA e histonas. As Proteínas Ligantes de Nucleossomo (NBPs) são capazes de controlar a dinâmica de abertura e fechamento da cromatina e, dessa forma, regulam a expressão gênica e a manutenção do genoma. Acredita-se, com isso, que moléculas que se ligam à superfície nucleossomal possam ter profundo impacto na estrutura da cromatina. Uma classe de peptídeos, conhecida como stapled, é descrita por ter maior estabilidade que os peptídeos nativos frente à ação de proteases, bem como o aumento da sua penetrabilidade celular. Diante disso, esta pesquisa tem como objetivo o desenho e a síntese química de peptídeos miméticos ligantes de nucleossomo, e estabelecer a melhor metodologia de síntese em fase sólida no laboratório de pesquisa. Foram desenhados peptídeos stapled, baseados em estruturas atômicas e cristalográficas de NBPs, em especial a proteína RCC1 complexada ao nucleossomo, contendo uma restrição conformacional, um crosslink formado por hidrocarbonetos. Os peptídeos compostos por 19 aminoácidos foram sintetizados em fase sólida (SPPS) pela inserção de aminoácidos α,α-dissubstituídos. A reação de metátese (RCM) foi escolhida para a formação do macrociclo utilizando catalisadores de Grubbs contendo rutênio. Além disso, alguns desses peptídeos foram purificados com sucesso e analisados por dicroísmo circular. / The chromatin is a macromolecular complex formed by basic repeating units, the nucleosome, which is composed of DNA and histones. Nucleosome Binding Proteins (NBPs) are able to control the opening and closing dynamics of chromatin, and thus regulate gene expression and genome maintenance. It is plausible to believe that molecules that bind to the nucleosomal surface can have a profound impact on the clinical outcome. A class of peptides known as stapled is described by increasing the stability of their native peptides to the action of proteases, as well as increasing their cellular penetrability. The present work aims at the design and chemical synthesis of nucleosome binding mimetic peptides, optimizing solid phase synthesis methodology in the research laboratory. Stapled peptides were designed based on atomic and crystallographic structures of NBPs, in particular protein RCC1 complexed to the nucleosome, containing a conformational constraint, a crosslink formed by hydrocarbons. Peptides composed of 19 amino acids were synthesized in solid phase (SPPS) by the insertion of α,α-disubstituted amino acids. The metathesis reaction (RCM) was chosen for macrocycle formation using ruthenium-containing Grubbs catalysts. In addition, some of these peptides were successfully purified and analyzed by circular dichroism.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-09-12T19:56:50Z No. of bitstreams: 1 2016_ViníciusAlvesFernandes.pdf: 4594049 bytes, checksum: 48f78b5328fa30fbeae24f268a04373c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-20T21:41:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_ViníciusAlvesFernandes.pdf: 4594049 bytes, checksum: 48f78b5328fa30fbeae24f268a04373c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-20T21:41:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_ViníciusAlvesFernandes.pdf: 4594049 bytes, checksum: 48f78b5328fa30fbeae24f268a04373c (MD5) / A cromatina é essencial para manutenção da fisiologia celular por desempenhar papel-chave na regulação da transcrição, reparo e replicação do DNA. Para tanto, esta deve ser altamente dinâmica, permitindo alterações entre estados compactados e relaxados. O primeiro nível de compactação da cromatina é o nucleossomo, formado pelo DNA e um octâmero de histonas. Moléculas que se ligam ao nucleossomo tem potencial para modular a cromatina. Diversas evidências apontam para o colesterol, lipídio importante para o funcionamento basal das células, como uma molécula ligante de cromatina. Recentemente, foi demonstrado que o colesterol pode modular a estrutura das fibras de cromatina reconstituídas in vitro. Juntos, estes dados sugerem que o colesterol possui um efeito modulador da arquitetura da cromatina por se ligar diretamente ao nucleossomo. Entretanto, os detalhes moleculares da ação do colesterol sobre a estrutura da cromatina ainda não foram esclarecidos. O objetivo deste estudo foi investigar, in silico, a ligação do colesterol ao nucleossomo e observar seu impacto ao nível atômico. Logo, metodologias capazes de tratar interações moleculares com resolução atomística são fundamentais, como a dinâmica molecular (DM) e docking molecular. Aqui identificamos vários sítios de ligação do colesterol distribuídos pelo nucleossomo. Após 200 ns de DM, seis moléculas de colesterol amostradas permaneceram ligadas ao nucleossomo. Para cada sítio investigado, a energia livre de ligação, estimada pelo método LIE (Linear Interactions Energy), indica o favorecimento do complexo entre o colesterol e o nucleossomo. Foi observado um impacto nas flutuações atômicas de vários aminoácidos formadores dos sítios de ligação. Dentre estes, alguns são conhecidamente importantes para modulação da estrutura da cromatina. Além disso, houve redução significativa do número de moléculas de água nas interfaces de interação colesterol-nucleossomo, especialmente em regiões hidrofóbicas essenciais para a manutenção estrutural do nucleossomo. Esses resultados sugerem que o colesterol pode afetar a arquitetura da cromatina através da interação direta com o nucleossomo nos múltiplos sítios de ligação. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chromatin is essential for maintenance of cell physiology playing a key role in transcription regulation, DNA repair and replication. Therefore, it must be highly dynamic, allowing changes between compacted and relaxed states. The first level of chromatin compaction is the nucleosome, formed by DNA and histone octamer. Molecules that bind to the nucleosome have the potential to modulate chromatin. Several evidences indicate that cholesterol, important lipid for cell function, may bind to chromatin. Recently, it was demonstrated that in vitro cholesterol may modulate the structure of reconstituted chromatin fibers. Together, these data suggest that cholesterol may modulate chromatin architecture by direct binding to the nucleosome. However, the molecular details of cholesterol’s action on chromatin structure remain unclear. The aim of this study was an in silico investigation of the cholesterol binding to the nucleosome and its impact at the atomic level. Therefore, methodologies capable of handling molecular interactions with atomistic resolution are critical, such as molecular dynamics (MD) and molecular docking. Here, we identified several cholesterol binding sites distributed over the nucleosome. After 200 ns of MD, six sampled cholesterol molecules remained bound to the nucleosome. For every site, the estimated absolute free energies obtained by the LIE method, favour cholesterol binding thus explaining the stability of the molecular complex. Cholesterol impacts the atomic fluctuations of several amino acids forming the binding sites. Among these, some are well-known to modulate the chromatin structure. Furthermore, a significant reduction in the number of water molecules in cholesterol-nucleosome interfaces was observed, especially at key hydrophobic regions for nucleosome structural maintenance. These results suggest that cholesterol may affect the chromatin's architecture via direct interaction with the nucleosome through multiple binding sites.