Universiẗat, Diss., 2001--München.

Universiẗat, Diss., 2004--Bielefeld.

Having a comprehensive view of the entire gene complement and coding capacity of bacterial pathogens, and how their gene expression is regulated, is crucial for understanding their strategy for survival, stress adaptation as well as host colonization and infection. In pathogens like Campylobacter jejuni, where homologs of key virulence factors used by other enteric pathogens are absent, it is important to gain a complete census of genes to understand how it causes disease. Deep sequencing approaches have expanded our knowledge on global gene expression profiles and aided in a better understanding of the coding complexity in bacteria. For example, they revealed small regulatory RNAs (sRNAs) involved in, e.g., stress response and adaptation or highlighted the concept of genes within genes, including dual-function sRNAs or alternative open reading frames (ORFs) within or antisense to known genes. Techniques like ribosome profiling (Ribo-seq) spotlighted a major gap in bacterial genome annotations, as it revealed that the so-called small proteome/sORFome (census of small proteins and small ORFs) is largely underrepresented. Small proteins, here defined as independently translated proteins ≤ 70 amino acids (aa), were overlooked or even discarded from genome annotations, and challenges in the biochemical detection further hindered their characterisation. Nevertheless, recently characterised examples of small proteins were identified as important players in physiological processes such as virulence and stress response. In C. jejuni, the leading cause of bacterial gastroenteritis, a recent differential RNA-seq (dRNA-seq) analysis revealed several sRNAs, some of which were shown to be relevant for infection. However, the small proteome of C. jejuni has not been systematically explored, leaving it unclear how many small open reading frames (sORFs) are encoded in the C. jejuni genome and expressed in vivo. Consequently, their function in C. jejuni physiology remains largely elusive, which is further hampering the understanding of how this major foodborne pathogen causes disease in humans. The focus of this thesis was to globally catalogue sORFs in C. jejuni, validate their translation status in vivo and functionally characterise infection-relevant candidates. Therefore, classical Ribo-seq, translation initiation site (TIS) profiling and a novel translation termination site (TTS) profiling method were combined to systematically investigate sORFs of C. jejuni. In addition, mass spectrometry and epitope tagging followed by western blotting were used to validate sORF translation. Collectively, these methodologies revealed novel and hidden sORFs encoded in diverse genomic contexts, as well as further annotation refinements. Hence, the C. jejuni small proteome was expanded almost two-fold by adding 42 novel sORFs to the annotation, and translation of 47 out of 54 already annotated sORFs was validated. Among these, the novel small protein CioY (34 aa), previously missed in the C. jejuni strain NCTC11168 genome annotation, was found to be adjacently encoded to the CioAB terminal oxidase. Further analysis showed that CioY is part of this terminal oxidase with potentially similar functions as the 37 aa-long CydX in E. coli. To aid further characterisation of novel sORFs and to allow for broad access to the translatomics data and our updated annotation, the online resource CampyBrowse was established. To gain insights into the potential functions of small proteins, available functional genetics datasets were inspected to identify candidates that might affect C. jejuni virulence. A transposon sequencing (Tn-seq) screen of C. jejuni infections of human Caco-2 cells in our lab identified the small protein Cj0978c (Mot2, 57 aa) required for motility and colonization. This thesis revealed that the small lipoprotein is necessary for flagellar disk and stator assembly, as it is required for stability and localisation of the basal disk protein FlgP. In addition, to allow for identification of potential interaction partners of small proteins, gradient profiling by sequencing (Grad-seq) as well as thermal proteome profiling (TPP) were successfully established for C. jejuni. While TPP is a sensitive method that is able to detect even slight changes in complex compositions, e.g., due to the absence of a small protein-binding partner, Grad-seq will be a valuable resource to study the C. jejuni complexome, the entire set of protein and RNA complexes. Overall, this thesis expands the genome map of C. jejuni NCTC11168 with novel high-confidence sORFs by using diverse Ribo-seq approaches combined with extensive validation. This integrative translatomic approach will promote the general understanding of the coding complexity in bacteria and allow for future characterisation of diverse small protein/sORF candidates in C. jejuni. Moreover, functional characterisation of Mot2 revealed the importance of a small protein for the functionality of the complex flagella machinery – a crucial virulence-determining process of C. jejuni. / Das gesamte Genkomplement bakterieller Pathogene sowie ihre Kodierungskapazität und Regulierung zu kennen, ist für das Verstehen von Überlebensstrategien, Stressanpassung sowie Wirtskolonisierung und Infektionen entscheidend. Dies ist besonders bei Krankheitserregern wie Campylobacter jejuni wichtig, denen homologe Gene von relevanten Virulenzfaktoren anderer Darmpathogenen fehlen, um zu verstehen, wie sie Krankheiten verursachen. Hochdurchsatz-Sequenziermethoden haben unser Wissen über globale Genexpressionsprofile erweitert und zu einem besseren Verständnis der Komplexität von Bakteriengenomen beigetragen. So wurden beispielsweise kleine regulatorische RNAs (sRNAs) entdeckt, die unter anderem an der bakteriellen Stressanpassung beteiligt sind, oder das Konzept von Genen innerhalb beschriebener Gene enthüllt. Beispiele dafür sind sogenannte dual-function sRNAs, oder alternative offene Leserahmen (ORFs) innerhalb von oder antisense zu bereits bekannten Genen. Techniken wie ribosome profiling (Ribo-seq) haben eine große Lücke in bakteriellen Genomannotationen aufgedeckt, und aufgezeigt, dass das sogenannte kleine Proteom/sORFom (Gesamtheit kleiner Proteine und kleiner ORFs) weitgehend unterrepräsentiert ist. Kleine Proteine, hier als unabhängig translatierte Proteine mit einer Länge von bis zu 70 Aminosäuren (aa) definiert, wurden in Genomannotationen übersehen, oder sogar aussortiert, und Schwierigkeiten beim biochemischen Nachweis beeinträchtigten zusätzlich ihre Charakterisierung. Dennoch haben jüngste Studien gezeigt, dass kleine Proteine wichtige Akteure bei physiologischen Prozessen wie der bakteriellen Virulenz und Stressreaktion sind. Bei C. jejuni, dem Hauptverursacher bakterieller Gastroenteritis, bestätigte eine differential RNA-seq-Analyse (dRNA-seq) die Existenz mehrerer sRNAs, von denen sich einige als infektionsrelevant erwiesen. Das kleine Proteom von C. jejuni wurde jedoch nicht systematisch untersucht, so dass unklar ist, wie viele kleine ORFs (sORFs) im Genom von C. jejuni kodiert und in vivo exprimiert werden. Folglich ist ihre Funktion in der Physiologie des Bakteriums nach wie vor weitgehend unbekannt und erschwert dadurch unser Verständnis darüber, wie dieser wichtige Lebensmittelkeim Krankheiten beim Menschen verursacht. Der Fokus dieser Dissertation lag auf der globalen Katalogisierung von sORFs in C. jejuni, der Validierung ihrer Translation in vivo und der funktionellen Charakterisierung von infektionsrelevanten Kandidaten. Daher wurden Ribo-seq, Translationsinitiationsstellen (TIS)-Profiling und das neue Translationsterminationsstellen (TTS)-Profiling kombiniert, um die Gesamtheit der sORFs von C. jejuni zu untersuchen. Darüber hinaus wurden Massenspektrometrie, Epitopmarkierung und Western Blot Analysen zur Validierung der Translation von sORFs eingesetzt. Insgesamt enthüllte eine Kombination dieser Methoden neue sORFs in den verschiedensten genomischen Kontexten, sowie weitere Nachbesserungen der Annotation. So konnten 42 neue kleine Proteine in die Annotation aufgenommen und damit das kleine Proteom von C. jejuni um nahezu das Zweifache vergrößert werden. Außerdem wurde die Translation von 47 der 54 bereits annotierten sORFs validiert. Das neuartige kleine Protein CioY (34 aa), das zuvor in der Genomannotation von C. jejuni NCTC11168 übersehen wurde, ist in unmittelbarer Nähe der terminalen Oxidase CioAB kodiert. Diese Doktorarbeit hat gezeigt, dass CioY eine Untereinheit dieser terminalen Oxidase ist, und möglicherweise ähnliche Funktionen wie das 37 aa-lange CydX in E. coli hat. Um die weitere Charakterisierung neuer sORFs zu unterstützen und einen breiten Zugang zu den Datensätzen und unserer aktualisierten Annotation zu ermöglichen, wurde die Online-Ressource CampyBrowse eingerichtet. Um kleine Proteine zu identifizieren, welche möglicherweise die Virulenz von C. jejuni beeinflussen könnten, wurden verfügbare funktionelle Datensätze untersucht. Ein vorheriger Tn-seq-Screen aus unserem Labor von C. jejuni infizierten menschlichen Caco-2-Zellen, identifizierte das für die Motilität und Kolonisierung erforderliche kleine Protein Cj0978c (Mot2, 57 aa). Diese Dissertation hat gezeigt, dass das kleine Lipoprotein für den Zusammenbau von funktionellen flagellaren Motoren notwendig ist, da es für die Stabilität und Lokalisierung des basalen flagellaren Disk-Proteins FlgP erforderlich ist. Zur Identifizierung potenzieller Interaktionspartner kleiner Proteine wurden gradient profiling by sequencing (Grad-seq) und thermal proteome profiling (TPP) für C. jejuni erfolgreich etabliert. Während TPP eine sensitive Methode ist, mit der selbst geringfügige Veränderungen in der Komplexzusammensetzung, z. B. durch das Fehlen eines kleinen Proteinbindungspartners, erkannt werden können, dient Grad-seq als wertvolle Ressource zur Untersuchung des C. jejuni-Komplexoms, der Gesamtheit an Protein- und RNA-Komplexen. Insgesamt erweitert diese Doktorarbeit die Genomannotierung von C. jejuni NCTC11168 durch die Kombination verschiedener Ribo-seq-Ansätze und einer umfassenden Validierung um neue sORFs. Dieser integrative Ansatz fördert das allgemeine Verständnis über die Komplexität von bakteriellen Genomannotationen und ermöglicht die künftige Charakterisierung verschiedener kleiner Proteine/sORFs in C. jejuni. Darüber hinaus hebt die funktionelle Charakterisierung von Mot2 die Bedeutung eines kleinen Proteins für die Funktionalität der komplexen Flagellenmaschinerie hervor – ein entscheidender Virulenzmechanismus von C. jejuni.