Univ., Diss., 2009--Marburg. / Teilw. publ. in: Science, 315(2007), S. 646 - 649.

Das kolorektale Karzinom ist eines der häufigsten beim Menschen vorkommenden Karzinome [2]. Diesem liegen unterschiedliche Mutationen zugrunde, die in knapp 100% der kolorektalen Karzinome zu einer Überexpression von MYC führen, welches als Transkriptionsfaktor maßgeblich den Zellzyklus, Proliferation und Vaskularisierung beeinflusst [10,16]. Damit stellt MYC ein potenzielles Therapieziel in der Behandlung des Kolorektalen Karzinoms dar. Zusätzlich konnte in den letzten Jahren ein Onkoprotein namens CIP2A identifiziert werden, welches nach Depletion mit einem Verlust von MYC Protein einhergeht [69]. Zusätzlich ist CIP2A ein unabhängiger prognostischer Faktor im Kolorektalen Karzinom [70]. Diese Arbeit konnte zeigen, dass CIP2A-depletierte Zellen einen deutlichen Wachstumsnachteil gegenüber unbehandelten Zellen zeigen. Dieser Unterschied kann nicht durch eine gesteigerte Apoptose, sondern vielmehr durch einen verlängerten Zellzyklus erklärt werden. Weiterhin konnte eine neue Zelllinie mit DOX-induzierbarer shCIP2A hergestellt werden, die für weitere Experimente genutzt werden kann. Entgegen der Wirkweise im Zervixkarzinom [69], konnte im kolorektalen Karzinom kein Einfluss auf die Stabilität von MYC Protein durch CIP2A nachgewiesen werden. Auch konnte der Verlust von MYC nach CIP2A Knockdown nicht durch gleichzeitige Inhibierung des Abbaus, durch Okadasäure, MG132 oder in den FBWX7-defizienten Zellen, verhindert werden. Stattdessen resultiert die Herunterregulation von CIP2A in einem leichten Rückgang der MYC-mRNA Menge und einem deutlichen Verlust an MYC-Protein. In Zellen mit verschiedenen Konstrukten der MYC Transkripte kann dieser Verlust an MYC Protein auf eine translationelle Regulation in der 5’UTR zurückgeführt werden, was eine bisher nicht beschriebene Wirkweise von CIP2A darstellt. Da CIP2A in normalen Zellen praktisch nicht exprimiert ist [78], könnte dies ein mögliches Ziel in der Tumortherapie darstellen. Dieses gilt es in weiteren Experimenten noch genauer zu untersuchen. / Colorectal Cancer is one of the most common type of cancer in human beings [2]. These are based on different mutations, which, in nearly 100%, lead to overexpression of MYC. As an transcription factor, MYC influences cell cyclus, proliferation and vascularization [10,16]. So MYC appears to be a good target in the therapy of colorectal cancer. Additionally a oncoprotein called CIP2A could be identified in the last years, which depletion leads also to a loss of MYC protein [69]. CIP2A was also found to be a independent prognostic factor in colorectal cancer [70]. In this work it could be demonstrated, that CIP2A-depleted cells show disadvantage in cell growth compared to the untreated cells. This difference could not be explained through an increased cell death, but an extended cell cycle. Additionally, a new cell line with DOX-inducible shRNA against CIP2A was established, which can be used for further experiments. Contrary to the mode of action which was found in cells of cervix carcinoma [69] we could not see an influence of CIP2A on the stability of MYC. Furthermore, the loss of MYC protein after knockdown of CIP2A could not be prevented by simultaneous inhibition of MYC degradation by okadaic acid, MG132 or in FBWX7-deficient cells. Instead knockdown of CIP2A lead to little decrease of MYC-mRNA and a clear loss of MYC protein. In cells with different constructs of MYC mRNA the loss of MYC protein can be attributed to a regulation in the 5’UTR. Because CIP2A is rarely expressed in normal tissue [78] it seems to be a possible target in the treatment of colorectal cancer. This should be further evaluated in future experiments.

In Zellen liegen RNAs in Form von Ribonukleoprotein-Komplexen (RNP) vor, wobei das Zusammenwirken von RNA und Proteinen die Funktionen der einzelnen RNPs definiert. RNA-bindenden Proteinen kommt demnach eine zentrale Bedeutung beim Verständnis des RNA-Metabolismus zu. Zu dieser Proteingruppe zählen auch die La-verwandten Proteine (engl. La-related proteins, LARPs), welche eine evolutionär konservierte Familie von Faktoren bilden und durch eine putative RNA-bindende Domäne, dem La Modul, charakterisiert sind. Bereits für zwei Vertreter dieser Proteinklasse (LARP3 und LARP7) konnte eine über das La Modul vermittelte spezifische Interaktion mit uridylreichen RNA-Sequenzen gezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es, einen Vertreter der LARP-Familie, das sogenannte LARP4B, sowohl biochemisch als auch strukturell zu untersuchen und es somit einem zellulären Prozess zuzuordnen. Zellbiologische Studien zeigten zunächst, dass LARP4B unter normalen Wachstumsbedingungen eine homogene zytoplasmatische Verteilung aufweist. Unter Stressbedingungen akkumuliert LARP4B hingegen in diskreten subzellulären Domänen, den sogenannten Stress Granules (SGs). Obwohl SGs bislang noch wenig funktionell untersucht sind, wird davon ausgegangen, dass sie der reversiblen Speicherung von mRNA-gebundenen Translationsfaktoren dienen. Durch affinitätschromatographische Strategien ließen sich spezifische Interaktionspartner von LARP4B identifizieren. Als direkte Bindungspartner wurden das zytoplasmatische Poly (A) bindende Protein 1 (PABPC1) und der Rezeptor für aktivierte C Kinase 1 (RACK1) gefunden. Darüber hinaus zeigten Sedimentationsanalysen, dass LARP4B nahezu quantitativ mit Ribosomen und Polyribosomen assoziiert vorliegt. Diese Studie identifizierte daher LARP4B als ein Protein, das mit Schlüsselfaktoren der eukaryotischen Translation wechselwirkt. In Übereinstimmung mit diesen Befunden reduziert ein RNAi-induzierter Mangel des Proteins die Translationsrate drastisch, während die Überexpression von LARP4B in vivo zu einer Stimulation der Proteinbiosynthese führt. Da dieser stimulatorische Einfluss bei einer Vielzahl unterschiedlicher mRNA-Spezies detektiert werden konnte, kann LARP4B als genereller, positiver Translationsfaktor angesehen werden. Interessanterweise wurden in Studien, die zeitgleich für das verwandte LARP1 durchgeführt wurden, vergleichbare zelluläre Interaktionen wie für LARP4B beschrieben. Um zu klären, ob beide LARPs Orthologe darstellen und funktionelle Redundanz zeigen, wurde in der vorgelegten Arbeit ein Vergleich von LARP4B mit LARP1 durchgeführt. Unabhängige in vivo Studien und Sedimentationsanalysen zeigten deutlich, dass beide Proteine im mRNA-Metabolismus agieren, jedoch in diesem unterschiedliche Phasen der eukaryotischen Proteinbiosynthese beeinflussen. / The cooperation of RNA with different classes of proteins in so called ribonucleoprotein complexes (RNPs) is essential for the function of these RNPs. Therefore, RNA-binding proteins play a crucial role to understand the complex mechanisms of RNA-metabolism. One family of such proteins comprise the La-related proteins (LARPs). These evolutionary conserved factors are characterized by a putative RNA-binding domain, named the La module. For two of these factors (LARP3 and LARP7) a specific interaction with RNA containing uridine-rich sequence elements mediated via their La module could be described. The present work describes the biochemical and structural characterization of LARP4B, a thus far uncharacterized member of the LARP family. Immunofluorescence analyses identified LARP4B as a cytosolic protein that accumulates upon arsenite treatment in cellular stress granules (SGs). While still not sufficiently determined, these domains are believed to serve as storage pools for stalled, mRNA-bound translation initiation complexes formed upon polyribosome disassembly. Biochemical experiments further uncovered an interaction of LARP4B with the Poly(A) binding protein cytosolic 1 (PABPC1) and the receptor for activated C Kinase 1 (RACK1). Moreover, under physiological conditions, LARP4B co-sediments almost quantitatively with polysomes in cellular extracts, suggesting a role in translation. In agreement with this notion, knockdown of LARP4B by RNA-interference impaired translation of cellular mRNAs whereas over-expression stimulated protein synthesis. As this stimulatory effect could be detected for a wide range of different mRNA-species, LARP4B hence represents a general stimulator of translation. Interestingly, parallel studies uncovered comparable cellular interactions for another LARP family member (LARP1). To test whether LARP4B and LARP1 represent orthologs possessing redundant function, these two factors have been compared in this work using several independent in vivo and in vitro studies. These data clearly showed that both proteins positively influence RNA-metabolism but influence different phases of protein biosynthesis.

Tierärztl. Hochsch., Diss., 2003--Hannover.

Colorectal cancer (CRC) is the second most common tumour disease in Germany, with the sequential accumulation of certain mutations playing a decisive role in the transition from adenoma to carcinoma. In particular, deregulation of the Wnt signalling pathway and the associated deregulated expression of the MYC oncoprotein play a crucial role. Targeting MYC thus represents an important therapeutic approach in the treatment of tumours. Since direct inhibition of MYC is challenging, various approaches have been pursued to date to target MYC indirectly. The MYC 5' UTR contains an internal ribosomal entry site (IRES), which has a particular role in the initiation of MYC translation, especially in multiple myeloma. As basis for this work, it was hypothesised on the basis of previous data that translation of MYC potentially occurs via its IRES in CRC as well. Based on this, two IRES inhibitors were tested for their potential to regulate MYC expression in CRC cells. In addition, alternative, 5’ UTR-dependent translation of MYC and interacting factors were investigated. EIF3D was identified as a MYC 5' UTR binding protein which has the potential to regulate MYC expression in CRC. The results of this work suggest that there is a link between eIF3D and MYC expression/translation, rendering eIF3D a potential therapeutic target for MYC-driven CRCs. / Das kolorektale Karzinom (KRK) ist die zweithäufigste Tumorerkrankung in Deutschland, wobei die sequenzielle Akkumulation bestimmter Mutationen eine entscheidende Rolle beim Übergang vom Adenom zum Karzinom spielt. Insbesondere die Deregulation des Wnt-Signalweges und die damit verbundene deregulierte Expression des MYC-Onkoproteins spielen eine entscheidende Rolle. MYC ist ein zentraler Vermittler von Zellfunktionen und reguliert als Transkriptionsfaktor die Expression fast aller Gene sowie verschiedener RNA-Spezies. Selbst kleine Veränderungen der zellulären MYC-Konzentration können das Proliferationsverhalten beeinflussen und die Entstehung und das Fortschreiten von Tumoren fördern. Die gezielte Beeinflussung von MYC stellt daher einen wichtigen therapeutischen Ansatz für die Behandlung von Tumoren dar. Da eine direkte Hemmung von MYC aufgrund seiner Struktur herausfordernd ist, wurden bisher verschiedene Ansätze verfolgt, um MYC indirekt zu beeinflussen, etwa über seinen Interaktionspartner MAX oder auf Ebene der Stabilität, Transkription oder Translation. In unserer eigenen Forschungsgruppe lag der Schwerpunkt in den letzten Jahren speziell auf der Translation von MYC im KRK. Es konnte gezeigt werden, dass die Hemmung der kanonischen cap-abhängigen Translation nicht wie erwartet zu einer Verringerung der zellulären MYC-Level führt, was auf einen alternativen Mechanismus der MYC-Translation hindeutet, der unabhängig vom eIF4F-Komplex abläuft. Die 5'-UTR von MYC enthält eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES), die eine besondere Rolle bei der Initiierung der MYC-Translation spielt, insbesondere im Multiplen Myelom. Als Grundlage für diese Arbeit wurde daher die Hypothese aufgestellt, dass die Translation von MYC im KRK möglicherweise ebenfalls über die IRES erfolgt. Auf dieser Grundlage wurden zunächst zwei publizierte IRES-Inhibitoren auf ihr Potenzial zur Regulierung der MYC-Expression in KRK-Zellen getestet. J007-IRES hatte keine Auswirkungen auf die MYC-Proteinmenge, und Cymarin scheint weitaus globalere Auswirkungen zu haben, die nicht ausschließlich auf die Verringerung der MYC-Proteinmenge zurückzuführen sind. Daher wurde weiter untersucht, inwieweit die alternative Translation von MYC generell von der 5'-UTR und damit interagierenden Faktoren abhängig ist. EIF3D wurde als MYC-5'-UTR-Bindungsprotein identifiziert, dessen Knockdown zu reduzierten MYC-Leveln, einem Proliferationsdefizit sowie einer Verringerung der globalen Proteinsynthese in KRK-Zellen führte. Darüber hinaus führte die Depletion von EIF3D zu ähnlichen Veränderungen im zellulären Genexpressionsmuster wie die Depletion von MYC, wobei viele tumorassoziierte Signalwege betroffen waren. Mittels eCLIP-seq wurde die Bindung von eIF3D an die MYC mRNA nachgewiesen, der genaue Mechanismus einer möglicherweise durch eIF3D vermittelten Translation von MYC muss jedoch weiter untersucht werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass eine Verbindung zwischen eIF3D und der MYC-Expression/Translation besteht, wodurch eIF3D zu einem potenziellen therapeutischen Ziel für MYC-getriebene KRKs wird.

Techn. Universiẗat, Diss., 2000--Dresden.

Techn. Universiẗat, Diss., 2001--Dresden.

The eukaryotic gene expression requires extensive regulations to enable the homeostasis of the cell and to allow dynamic responses due to external stimuli. Although many regulatory mechanisms involve the transcription as the first step of the gene expression, intensive regulation occurs also in the post-transcriptional mRNA metabolism. Thereby, the particular composition of the mRNPs plays a central role as the components associated with the mRNA form a specific “mRNP code” which determines the fate of the mRNA. Many proteins which are involved in this regulation and the mRNA metabolism are affected in diseases and especially neurological disorders often result from an aberrant mRNP code which leads to changes in the regulation and expression of mRNPs. The focus of this work was on a trimeric protein complex which is termed TTF complex based on its subunits TDRD3, TOP3β and FMRP. Biochemical investigations revealed that the three components of the TTF complex are nucleo-cytosolic shuttle proteins which localize in the cytoplasm at the steady-state, associate with mRNPs and are presumably connected to the translation. Upon cellular stress conditions, the TTF components concentrate in stress granules. Thus, the TTF complex is part of the mRNP code, however its target RNAs and function are still completely unknown. Since the loss of functional FMRP results in the fragile X syndrome and TOP3β is associated with schizophrenia and intellectual disability, the TTF complex connects these phenotypically related neuro-psychiatric disorders with each other on a molecular level. Therefore, the aim of this work was to biochemically characterize the TTF complex and to define its function in the mRNA metabolism. In this work, evidence was provided that TDRD3 acts as the central unit of the TTF complex and directly binds to FMRP as well as to TOP3β. Thereby, the interaction of TDRD3 and TOP3β is very stable, whereas FMRP is a dynamic component. Interestingly, the TTF complex is not bound directly to mRNA, but is recruited via the exon junction complex (EJC) to mRNPs. This interaction is mediated by a specific binding motif of TDRD3, the EBM. Upon biochemical and biological investigations, it was possible to identify the interactome of the TTF complex and to define the role in the mRNA metabolism. The data revealed that the TTF complex is mainly associated with “early” mRNPs and is probably involved in the pioneer round of translation. Furthermore, TOP3β was found to bind directly to the ribosome and thus, establishes a connection between the EJC and the translation machinery. A reduction of the TTF components resulted in selective changes in the proteome in cultured cells, whereby individual protein subsets seem to be regulated rather than the global protein expression. Moreover, the enzymatic analysis of TOP3β indicated that TOP3β is a type IA topoisomerase which can catalytically attack not only DNA but also RNA. This aspect is particularly interesting with regard to the connection between early mRNPs and the translation which has been revealed in this work. The data obtained in this work suggest that the TTF complex plays a role in regulating the metabolism of an early mRNP subset possibly in the course of the pioneer round of translation. Until now, the link between an RNA topoisomerase and the mRNA metabolism is thereby unique and thus provides a completely new perspective on the steps in the post-transcriptional gene expression and its regulation. / Die eukaryotische Genexpression bedarf einer umfassenden Regulation um die Homöostase der Zelle zu gewährleisten und um dynamische Reaktionen auf externe Einflüsse zu ermöglichen. Obwohl viele der regulatorischen Mechanismen die Transkription als ersten Schritt der Genexpression betreffen, findet auch eine intensive Regulierung auf der Ebene des post-transkriptionellen mRNA-Metabolismus statt. Dabei spielt die jeweilige Zusammensetzung der mRNPs eine zentrale Rolle, da je nachdem, mit welchen Faktoren eine mRNA assoziiert ist, ein sog. „mRNP-Code“ entsteht, der das Schicksal der mRNA bestimmt. Viele der an der Regulierung und dem mRNA-Metabolismus beteiligten Proteine sind in Krankheiten betroffen und gerade neurologische Erkrankungen resultieren häufig von einem fehlerhaften mRNP-Code, der zu Veränderungen in der Regulation und Expression von mRNPs führt. Im Zentrum dieser Arbeit stand ein trimerer Proteinkomplex, der aufgrund seiner Untereinheiten TDRD3, TOP3β und FMRP als TTF-Komplex bezeichnet wird. Biochemische Daten haben gezeigt, dass die drei Komponenten des TTF-Komplexes nucleo-cytoplasmatische „Shuttle“-Proteine sind, die sich im „steady-state“ hauptsächlich im Cytoplasma befinden, mit mRNPs assoziieren und vermutlich mit der Translation in Verbindung stehen. Unter zellulären Stressbedingungen konzentrieren sich die TTF-Komponenten in Stress Granula. Der TTF-Komplex ist damit Teil des mRNP-Codes, dessen zelluläre Ziel-RNAs und Funktion bislang aber völlig unbekannt sind. Da der Verlust von funktionellem FMRP zu der Ausprägung des fragilen X Syndroms (FXS) führt und TOP3β mit Schizophrenie und geistiger Retardation in Verbindung steht, verbindet der TTF-Komplex phänotypisch verwandte neuro-psychiatrische Krankheiten auf molekularer Ebene miteinander. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, den TTF-Komplex biochemisch zu charakterisieren und seine Funktion im mRNA-Metabolismus zu definieren. Im Zuge dieser Arbeit gelang der Nachweis, dass TDRD3 als zentrale Einheit des TTF-Komplexes agiert und sowohl FMRP als auch TOP3β direkt bindet. Die Interaktion von TDRD3 und TOP3β ist hierbei sehr stabil, FMRP ist hingegen eine dynamische Komponente. Interessanterweise wird der TTF-Komplex nicht direkt an mRNA gebunden, sondern über den Exon-Junction-Komplex (EJC) an mRNPs rekrutiert. Diese Interaktion wird durch ein spezifisches Bindungsmodul in TDRD3, dem sog. EBM vermittelt. In einer Reihe von biochemischen und systembiologischen Studien konnte das Interaktom des TTF-Komplexes bestimmt und seine Rolle im mRNA-Metabolismus definiert werden. Die Daten offenbarten, dass der TTF-Komplex primär mit „frühen“ mRNPs assoziiert ist und sehr wahrscheinlich an der „pioneer round of translation“ beteiligt ist. Weiterhin zeigte sich, dass TOP3β das Ribosom direkt bindet und somit eine Verbindung des EJC und der Translationsmaschinerie etabliert. Die Reduktion von Komponenten des TTF-Komplexes in kultivierten Zellen führte zu selektiven Änderungen im Proteom, wobei einzelne Proteinteilgruppen, jedoch nicht die globale Expression durch den TTF-Komplex reguliert zu sein scheinen. Die enzymatische Analyse von TOP3β hat darüber hinaus gezeigt, dass es sich um eine Topoisomerase vom Typ IA handelt, die nicht nur DNA sondern auch RNA angreifen kann. Dieser Aspekt ist besonders interessant im Zusammenhang der in dieser Arbeit aufgedeckten Verbindung von frühen mRNPs mit der Translation. Die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Daten legen nahe, dass der TTF-Komplex eine Rolle bei der Regulation des Metabolismus „früher“ mRNP-Teilgruppen möglicherweise im Zuge der „Pionierrunde“ der Translation spielt. Dabei ist die Verbindung einer RNA-Topoisomerase mit dem mRNA-Metabolismus bisher einzigartig und eröffnet so eine ganz neue Sichtweise auf die post-transkriptionellen Schritte der Genexpression und ihre Regulation.

Die Etablierung der Transkription von kompletten Genen auf planaren Oberflächen soll eine Verbindung zwischen der Mikroarraytechnologie und der Transkriptomforschung herstellen. Darüber hinaus kann mit diesem Verfahren ein Brückenschlag zwischen der Synthese der Gene und ihrer kodierenden Proteine auf einer Oberfläche erfolgen. Alle transkribierten RNAs wurden mittels RT-PCR in cDNA umgeschrieben und in einer genspezifischen PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden hierfür entweder per Hand oder maschinell auf die Oberfläche transferiert. Über eine Oberflächen-PCR war es möglich, die Gensequenz des Reportergens EGFP direkt auf der Oberfläche zu synthetisieren und anschließend zu transkribieren. Somit war eine Transkription mit weniger als 1 ng an Matrize möglich. Der Vorteil einer Oberflächen-Transkription gegenüber der in Lösung liegt in der mehrfachen Verwendung der immobilisierten Matrize, wie sie in dieser Arbeit dreimal erfolgreich absolviert wurde. Die Oberflächen-Translation des EGFP-Gens konnte ebenfalls zweimal an einer immobilisierten Matrize gezeigt werden, wobei Zweifel über eine echte Festphasen-Translation nicht ausgeräumt werden konnten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Transkription und Translation von immobilisierten Gensequenzen auf planaren Oberflächen möglich ist, wofür die linearen Matrizen direkt auf der Oberfläche synthetisiert werden können. / In vitro mRNA synthesis and in vitro translation are of great interest for biochemical and molecular biological basic research, and also for biotechnology and other applications. Solid phase coupled synthesis is very useful for the development of high throughput procedures to elucidate and manipulate gene products. An artificial gene was constructed combining the T7 promoter and terminator with the EGFP-gene from the plasmid pEGFP. The functionality of the construct was shown by in vitro translation. The gene-construct was immobilised on a planar glass surface. The transcription was performed on the immobilised gene and mRNA was determined by RT-PCR. These results demonstrate that the complete gene is transcribed from the covalently coupled PCR product. Thus, it is possible to transfer a standard transcription technique onto an On-chip reaction. The direct PCR amplification of transcriptionable sequences of EGFP bound on surfaces was successfully used for solid phase transcription. Successful transcriptions were also performed at least to 1 ng of used template. The RNA synthesis was also successful in the second and third reaction on the same slide as observed by signals after RT-PCR. It seems to be possible to transfer the translation of reportergenes in a solid phase coupled synthesis, too. For further integration of cellular procedures on a chip, the cell-free RNA synthesis on immobilised templates is an crucial technical hurdle to conquer. Major advantages of using immobilised templates for transcription are, low risk of contamination occuring in solution, and no necessity of further purification steps for downstream applications of the RNA product.