Choy, Man Fai. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2008. / Includes bibliographical references (leaves 120-123). / Abstracts in English and Chinese. / Title Page --- p.1 / Abstract (English) --- p.2 / Abstract (Chinese) --- p.3 / Acknowledgement --- p.4 / Declaration --- p.5 / Table of Content --- p.6 / Lists of Figures --- p.9 / Lists of Tables --- p.12 / List of Schemes --- p.13 / Chapter Chapter One --- Introduction / Historical perspective and overview of tandem mass spectrometry for structural biochemistry --- p.14 / Electrospray ionization (ESI) --- p.15 / Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS) --- p.18 / Chapter 1.3.1 --- History of FTICR --- p.18 / Chapter 1.3.2 --- Theory of FTICR --- p.21 / Chapter 1.4 --- Sequencing of DNA fragments --- p.26 / Chapter 1.4.1 --- Conventional and mass spectrometric sequencing techniques --- p.26 / Chapter 1.4.2 --- Fragment-ion nomenclature --- p.27 / Chapter 1.4.3 --- Tandem mass spectrometry of oligonucleotide ions --- p.29 / Chapter 1.4.4 --- Electron capture dissociation of oligonucleotide ions --- p.31 / Chapter 1.5 --- Outline of the present work --- p.32 / Chapter Chapter Two --- Instrument and Experimental / Chapter 2.1 --- Instrumentation --- p.35 / Chapter 2.1.1 --- Fourier-transform ion cyclotron resonance mass spectrometer --- p.35 / Chapter 2.1.2 --- Vacuum system --- p.35 / Chapter 2.1.3 --- Nanospray ion source --- p.39 / Chapter 2.1.4 --- Ion Transfer system --- p.41 / Chapter 2.1.5 --- Infinity cell --- p.43 / Chapter 2.1.6 --- Electron emission source --- p.44 / Chapter 2.2 --- Experimental section --- p.47 / Chapter 2.2.1 --- Simple acquisition pulse program --- p.47 / Chapter 2.2.2 --- ECD pulse program --- p.49 / Chapter Chapter Three --- Production of Doubly-prontonated Oligonucleotide ions using Nanospray Ionization / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.52 / Chapter 3.2 --- Experimental and instrumental section --- p.53 / Chapter 3.2.1 --- Materials --- p.53 / Chapter 3.2.2 --- Sample preparation --- p.53 / Chapter 3.2.3 --- Instrumentation --- p.54 / Chapter 3.3 --- Results and discussion --- p.54 / Chapter 3.3.1 --- Effect of the concentration of ammonium formate --- p.54 / Chapter 3.3.2 --- Effects of the anionic pair of the ammonium salts --- p.57 / Chapter 3.3.3 --- Effects of solvent composition --- p.64 / Chapter 3.3.4 --- Effects of analyte concentration --- p.66 / Chapter 3.4 --- Conclusion --- p.68 / Chapter Chapter Four --- Electron Capture Dissociation of Model Oligonucleotides / Chapter 4.1 --- Introduction --- p.69 / Chapter 4.2 --- Experimental and instrumental section --- p.70 / Chapter 4.2.1 --- Materials --- p.70 / Chapter 4.2.2 --- Sample preparation --- p.70 / Chapter 4.2.3 --- Instrumentation --- p.71 / Chapter 4.2.4 --- Method of calculations --- p.71 / Chapter 4.3 --- Results and discussion --- p.72 / Chapter 4.3.1 --- "ECD of d(CCCCC), d(CCAAC), d(CCTTC) and d(CCGGC)" --- p.72 / Chapter 4.3.1.1 --- General features --- p.72 / Chapter 4.3.1.2 --- Protonated nucleobases and nucleoside-like fragments --- p.73 / Chapter 4.3.1.3 --- Doubly-charged fragment ions --- p.79 / Chapter 4.3.2 --- Theoretical calculation of electron capture affinities of common functionalities in oligonucleotides --- p.80 / Chapter 4.3.3 --- Electron capture dissociation of C/T binary-based oligonucleotides --- p.81 / Chapter 4.3.3.1 --- "ECD of d(CTCTC), d(TCCCT) and d(CTTTC)" --- p.84 / Chapter 4.3.3.2 --- ECD of d(CCCCT) and d(TCCCC) --- p.84 / Chapter 4.3.4 --- Mechanistic implications --- p.89 / Chapter 4.4 --- Conclusion --- p.99 / Chapter Chapter Five --- Electron Capture Dissociation of a Series of G/T Binary Base of Oligonucleotides / Chapter 5.1 --- Introduction --- p.100 / Chapter 5.2 --- Experimental and instrumental section --- p.100 / Chapter 5.2.1 --- Materials --- p.100 / Chapter 5.2.2 --- Sample preparation --- p.100 / Chapter 5.2.3 --- Instrumentation --- p.101 / Chapter 5.3 --- Results and discussion --- p.101 / Chapter 5.3.1 --- Electron capture dissociation of d(GGGGG) --- p.101 / Chapter 5.3.2 --- Electron capture dissociation of G/T binary-based oligonucleotides --- p.104 / Chapter 5.3.2.1 --- "ECD of d(GTGTG), d(GTTTG) and d(TGGGT)" --- p.104 / Chapter 5.3.2.2 --- ECD of d(GGGGT) and d(TGGGG) --- p.107 / Chapter 5.3.3 --- Mechanistic implications --- p.110 / Chapter 5.4 --- Conclusion --- p.117 / Chapter Chapter Six --- Conclusion Remarks --- p.118 / References --- p.120 / Appendix A --- p.124 / Appendix B --- p.127

Le traitement et le diagnostic de maladies d'origine génétique suscite un grand intérêt à l'heure actuelle. De par leur spécificité d'appariement avec les acides nucléiques, les oligonucléotides possèdent un grand potentiel dans ce domaine. Ils se heurtent toutefois à des limitations majeures, dont leur faible stabilité en milieu physiologique et la difficulté qu'ils ont à franchir les membranes biologiques. De nombreuses équipes de recherche s'intéressent, afin de pallier ces limitations, à la conception et à la synthèse d'oligonucléotides chimiquement modifiés. Parmi ceux-ci, les Locked Nucleic Acids (LNA), présentant une modification qui consiste en l'insertion d'un pont −O−CH2− entre l'atome C2' et l'atome C4' du sucre, constituent une famille qui semble posséder les propriétés requises. Ils sont considérés comme des candidats très prometteurs en tant qu’agents thérapeutiques et qu’outils de diagnostic du génome. La caractérisation de la stabilité et de la sélectivité d'appariement entre les LNA et les acides nucléiques naturels est, dans ce contexte, important.<p><p>Dans ce travail, nous avons étudié la stabilité, la sélectivité d'appariement ainsi que la dynamique de la structure double brin d'un oligonucléotide hybride LNA-DNA, et nous avons comparé ces propriétés à celles d'un oligonucléotide DNA-DNA de même séquence. Ce dernier est constitué de 11 paires de bases formées par l'appariement du brin 5'-GCGTGTGTGCG-3' avec le brin 3'-CGCACACACGC-5'. Dans le cas de l'hybride, les nucléotides du second brin sont tous remplacés par des LNA.<p><p>La stabilité a été étudiée expérimentalement par différentes techniques :spectroscopie d'absorption UV, calorimétrie différentielle à balayage, résonance magnétique nucléaire et calorimétrie à titrage isotherme. Ces études montrent que la stabilité du duplexe hybride est plus importante que celle du naturel, et que ce phénomène s'explique par un terme entropique plus favorable pour la formation du duplexe LNA-DNA que pour la formation du duplexe DNA-DNA.<p><p>La sélectivité d'appariement a été étudiée en comparant la stabilité des deux oligonucléotides étudiés avec celle d'oligonucléotides présentant un mésappariement dans la séquence. Nos résultats montrent que la sélectivité d'appariement du brin LNA n'est pas significativement différente de celle du brin DNA. Ce résultat ne doit cependant pas être généralisé car nous n'avons testé qu'une position centrale pour le mésappariement.<p><p>L'étude de la dynamique de la structure des oligonucléotides a été effectuée par RMN et porte sur la caractérisation de la cinétique de l'ouverture individuelle des paires de bases. Nous observons que la durée de vie de l'état fermé des paires de bases G-C est supérieure dans l'oligonucléotide LNA-DNA, tandis que l'état fermé des paires A-T semble posséder une durée de vie supérieure dans l'oligonucléotide DNA-DNA.<p><p>Au cours de ce travail de thèse nous avons pu caractériser les facteurs énergétiques à la base de la stabilité accrue des oligonucléotides chimiquement modifiés de type LNA. Nous avons montré que leur sélectivité d’appariement n’est pas toujours supérieure à celle des oligonucléotides naturels et dépend des séquences impliquées. Enfin, nous avons mis en évidence les différences entre la dynamique de la structure d’un oligonucléotide possédant des LNA et celle d’un duplexe DNA. / Doctorat en Sciences de l'ingénieur / info:eu-repo/semantics/nonPublished