University, Habil--Leipzig, 2004. / Enth. 9 Sonderabdr. aus verschiedenen Zeitschr.

Ziel und Inhalt der Untersuchungen war es eine mögliche Verbindung zwischen den Erkrankungen Onchozerkose und Epilepsie in einem Gebiet des Departements Sanaga- Maritime in der Provinz Littoral in Kamerun herzustellen. Eine Fallkontrollstudie wurde mit insgesamt 188 Teilnehmern in einem für Onchozerkose endemischen Gebiet durchgeführt. Dabei wurden 98 Personen mit Krampfanfällen in ihrer Anamnese mit 90 Personen aus der Normalbevölkerung bezüglich typischer Symptome und Befunde der Onchozerkose verglichen. Vergleichspunkte waren anamnestische Angaben (Pruritus, Einschränkung des Sehvermögens), klinische Befunde (Onchozerkose-Knoten, Hautveränderungen) und Laboruntersuchungen (Skin snip, Serumantikörpertiter). Nach Berücksichtigung von Ausschlusskriterien erfolgte die Darstellung der gefundenen Ergebnisse zur Onchozerkose und der Vergleich der Studiengruppen zueinander. Serologisch wurden mittels Indirektem Immunfluoreszenztest Antikörper gegen Onchocerca-Antigen in 2 Testen bei 97,8 % (Test 1) bzw. 100 % (Test 2) aller Probanden nachgewiesen. Ein Nachweis von Mikrofilarien im ―Skin snip― erfolgte bei 86,8 % aller Probanden. Palpatorisch wurden Onchozerose-Knoten bei 43,6 %, inspektorisch typische Hautveränderungen bei 44,3 % aller Probanden nachgewiesen. Anamnestisch berichteten 60,8 % aller Probanden über Pruritus und 28,2 % über Einschränkungen des Sehvermögens. Der Vergleich der beiden Untersuchungsgruppen zeigte teilweise deutliche Differenzen. Bei der ―Skin snip―-Untersuchung hatten Probanden aus der Patientengruppe eine teilweise deutlich höhere Belastung mit Mikrofilarien als Probanden der Kontrollgruppe. In der Patientengruppe wiesen 44,6 %, in der Kontrollgruppe nur 8,9 % aller Probanden mehr als fünf Mikrofilarien pro mikroskopischem Feld auf. Bei etwa zwei Dritteln (66,7 %) aller Probanden der Kontrollgruppe und nur etwa der Hälfte (48,2 %) der Patientengruppe waren bis zu fünf Mikrofilarien pro Feld feststellbar. Insgesamt zeigt sich beim Vergleich der Gruppen A und B ein signifikanter Unterschied für die Anzahl der gefundenen Mikrofilarien (p < 0,001). Auch waren Onchozerkose-Knoten häufiger bei Probanden mit Epilepsie festzustellen als in der Kontrollgruppe. In der Patientengruppe hatten 44,8 % Probanden unter 14 Jahre bereits nachweisbare Knoten, in der Kontrollgruppe waren es 33,3 %. Bei den Probanden zwischen 15 und 24 Jahren hatten 44,1 % aller Probanden mit Epilepsie und nur 24,1 % aus der Kontrollgruppe nachweisbare Knoten. Die Unterschiede waren jedoch nicht signifikant. Auch wurden Hautveränderungen durch Onchozerkose häufiger in der Patientengruppe festgestellt. Bei den Probanden unter 14 Jahre zeigten 43,3 % in der Patientengruppe und 40,7 % aus der Kontrollgruppe Auffälligkeiten der Haut. Im Alter zwischen 15 und 24 Jahren war ein deutlicherer Unterschied feststellbar. 52,6 % der Probanden mit Epilepsie und 20,7 % der Kontrollgruppe zeigten Hautveränderungen. Dieser Unterschied war signifikant (p = 0,01). Ebenfalls besteht ein signifikanter Unterschied für alle Probanden bis 34 Jahre (p = 0,008). Im Antikörpernachweis waren bei beiden Testen im Bereich höherer Antikörpertiter tendenziell mehr Probanden aus der Patientengruppe betroffen. Es lagen jedoch sehr individuelle Schwankungen für diese Parameter vor. Wie bereits in bestehenden Studien geäußert wurde, muss ein Zusammenhang zwischen einer Infektion und Erkrankung an Onchozerkose und der nachfolgenden Entwicklung eines Krampfanfallleidens aufgrund der gefundenen Ergebnisse als sehr wahrscheinlich angenommen werden. Weitere Untersuchungen zu diesem Themenbereich, insbesondere zu pathogenetischen Hintergründen, sind erforderlich um die bisher gesammelten und vorliegenden Erkenntnisse zu ergänzen. / The aim of the study was to examine a possible relationship between the diseases onchocerciasis and epilepsy in a region within the department Sanaga-Maritime in the province Littoral in Cameroon. The case-control study was conducted in the year 2000 with a total of 188 individuals in an area endemic for onchocerciasis. 98 persons with signs of cerebral convulsions in history (patient group) and 90 persons out of the population (control group) were compared in terms of typical symptoms and findings for onchocerciasis, consisting of information in history (pruritus, impaired vision), clinical findings (nodules and skin changes due to onchocerciasis) and laboratory testing (skin snip, antibodies in serum). After consideration of exclusion criteria the results for all persons examined for the disease onchocerciasis and the results in comparing the 2 study groups were presented. In 2 tests in serology (indirect immunofluorescence test) 97,8 % (test 1) and 100 % (test 2) of all persons showed different levels of antibodies against onchocerca-antigen in serum. In the skin snip microfilariae were found in 86,8 % of the persons examined. In clinical examination nodules were detected through palpation in 43,6 % and typical skin changes were visible in 44,3 % of all examined persons. Out of history 60,8 % claimed the symptom of pruritus and 28,2 % of some impairment of vision out of all examined persons. In comparing the 2 groups concerning signs and symptoms of onchocerciasis partly clear differences could be found. In the skin snip persons form the patient group had partially clearly higher numbers of parasites (microfilarial load) than persons of the control group. In the patient group 44,6 % showed a number of more than 5 microfilariae per microscopic field whereas 8,9 % in the control group showed the same result. About two third (66,7 %) of the persons in the control group and about half (48,2 %) of the persons of the patient group showed up to 5 microfilariae per microscopic field. Altogether the results for the skin snip were significantly different for the microfilarial load in comparing the 2 groups (p<0,001). Also nodules were more often found in persons of the patient group than persons of the control group. In the patient group in 44,8 % of the persons under 14 years nodules were detected whereas 33,3 % in the control group. In the age group of persons between 15 and 24 years in 44,1 % of the patient group nodules were found. In the control group only 24,1 % showed the clinical finding. The differences were not significantly different. Typical skin changes for onchocerciasis were more often seen in the patient group. In persons under 14 years 43,3 % out of the patient group and 40,7 % out of the control group showed skin changes. In the age group of 15 to 24 years the difference was more clear. 52,6 % of all persons of the patient group and 20,7 % persons of the control group showed skin changes. The difference was significant (p=0,01). The difference for all persons till 34 years was also significant (p=0,008). In serology persons of the patient group partially showed higher levels of antibodies than persons of the control group. But variation between the individuals was high. Like it was already mentioned in a number of studies and reports a connection between onchocerciasis and epilepsy has to be assumed also after assessment of the data for this study. Further investigation on this subject, especially for a better understanding of pathogenetic factors, have to be done to complete the existing information.

Introduction: This study investigates the role of Wolbachia bacteria in the pathogenesis of O. volvulus keratitis in a mouse model. Wolbachia bacteria are essential symbionts of most filarial nematodes of importance for mankind. Methods: Using a mouse model for river blindness in which soluble extracts of filarial nematodes are injected in the corneal stroma, changes in stromal thickness and haze of the cornea are observed by in vivo confocal microscopy, followed by immunohistochemical staining for neutrophils and PECAM-1, as well as ELISA of corneal chemokines. Reactions to filarial extracts containing Wolbachia are compared to those without the endosymbiont. Results: The approach of characterizing Wolbachia’s role in river blindness in this study is threefold. Firstly, Wolbachia-depleted extracts from doxycycline treated onchocerciasis patients led to a diminished inflammatory response in corneas of C57BL/6 mice compared to untreated, i.e. Wolbachia containing antigen. The decreased cell recruitment observed with doxycycline treated extracts involved neutrophils, but not eosinophils. This finding demonstrated that the presence of Wolbachia increases neutrophil recruitment. Secondly, extracts from Wolbachia-containing B. malayi revealed markedly more pathology than endosymbiont-free A. viteae antigen. This again pointed at the role of Wolbachia in development of disease. Thirdly, Toll-like Receptor 4 (TLR4) dependence was shown to exist for the inflammatory response to Wolbachia harboring O. volvulus antigen by looking at the corneal pathology in TLR4-mutant C3H/HeJ mice, compared to the wild-type C3H/HeN strain. Investigating further Wolbachia mediated mechanisms of neutrophil recruitment to the cornea, this study also showed that expression of the adhesion molecule PECAM-1 in limbal vessels, as well as upregulation of the CXC chemokines KC and MIP-2 were dependent on the presence of functional TLR4 and Wolbachia respectively. Conclusions: This study indicates that the innate immune system and Wolbachia endobacteria play an important role in the inflammatory response associated with the pathogenesis of onchocerca keratitis, suggesting a complete alteration in our understanding of the immunopathology of filariasis. / Einleitung: Diese Arbeit untersucht die Rolle des Bakteriums Wolbachia in der Pathogenese der Onchozerka volvulus Keratitis anhand eines Mausmodels. Wolbachia sind essentielle endosymbiontische Bakterien, die in den meisten Filariosen, die für die Menschheit von Bedeutung sind, existieren. Methoden: Mit Hilfe eines Mausmodels für die Flußblindheit, in dem lösliche Filarienextrakte in das korneale Stroma von Mäusen injiziert werden, lassen sich Veränderungen in der Stromadicke und –durchsichtigkeit mit in vivo konfokaler Mikroskopie beobachten, gefolgt von immunhistochemischer Färbung von Neutrophilen und PECAM-1, wie auch ELISA von kornealen Chemokinen. Dabei werden Entzündungsreaktionen nach Injektion von Filarienmaterial mit oder ohne Wolbachia verglichen. Resultate: Die Untersuchung von Wolbachia's Rolle in der Flußblindheit erfolgte in drei Schritten. Zunächst führte Antigenmaterial von Wolbachia-freien, mit Doxyzyklin behandelten Onchozerkosepatienten zu geringerer Entzündungsreaktion in der Kornea von C57BL/6 Mäusen verglichen mit Wolbachia-enthaltendem Material. Die verminderte Enzündungszellzahl bei Doxyzyklin-behandelten Extrakten umfasste Neutrophile, aber nicht Eosinophile Granulozyten. Die Anwesenheit von Wolbachia führt daher zu verstärkter Neutrophileneinwanderung. Zweitens erwiesen Wolbachia-enthaltende B. malayi Extrakte eine signifikant verstärkte korneale Pathologie verglichen mit Endosymbiont-freiem A. viteae Antigen. Dieses Ergebnis deutete erneut auf die Rolle von Wolbachia in der Krankheitsentstehung. Drittens wurde anhand von Toll-like Rezeptor 4 (TLR4) mutanten C3H/HeJ Mäusen gezeigt, dass die Entzündungsreaktion, die von Wolbachia-enthaltenden O. volvulus Extrakten hervorgerufen wird, von TLR4 abhängig ist. Weitere Untersuchungen Wolbachia-abhängiger Mechanismen der Neutrophileneinwanderung in die Kornea erwiesen, dass die Expression des Adhäsionsmoleküls PECAM-1 in limbischen Gefäßen, wie auch die Hochregulation der CXC Chemokine KC und MIP-2 von TLR4 und der Anwesenheit von Wolbachia abhängig sind. Konklusion: Diese Arbeit zeigt, dass das angeborene Immunsystem und Wolbachia eine wichtige Rolle in der Pathogenese der O. volvulus Keratitis spielen, was auf eine neue Verstehensweise der Filariosenimmunpathologie hinweist.

Onchocerciasis, the world's second-leading infectious cause of blindness in humans –prevalent in Sub-Saharan Africa – is caused by Onchocerca volvulus (O. volvulus), an obligatory human parasitic filarial worm. Commonly known as river blindness, onchocerciasis is being targeted for elimination through ivermectin-based mass drug administration programs. However, ivermectin does not kill adult parasites, which can live and reproduce for more than 15 years within the human host. These impediments heighten the need for a deeper understanding of parasite biology and parasite-human host interactions, coupled with research into the development of new tools – macrofilaricidal drugs, diagnostics, and vaccines. Humans are the only definitive host for O. volvulus. Hence, no small-animal models exist for propagating the full life cycle of O. volvulus, so the adult parasites must be obtained surgically from subcutaneous nodules. A two-dimensional (2D) culture system allows that O. volvulus larvae develop from the vector-derived infective stage larvae (L3) in vitro to the early pre-adult L5 stages. As problematic, the in vitro development of O. volvulus to adult worms has so far proved infeasible. We hypothesized that an increased biological complexity of a three-dimensional (3D) culture system will support the development of O. volvulus larvae in vitro. Thus, we aimed to translate crucial factors of the in vivo environment of the developing worms into a culture system based on human skin. The proposed tissue model should contain 1. skinspecific extracellular matrix, 2. skin-specific cells, and 3. enable a direct contact of larvae and tissue components. For the achievement, a novel adipose tissue model was developed and integrated to a multilayered skin tissue comprised of epidermis, dermis and subcutis. Challenges of the direct culture within a 3D tissue model hindered the application of the three-layered skin tissue. However, the indirect coculture of larvae and skin models supported the growth of fourth stage (L4) larvae in vitro. The direct culture of L4 and adipose tissue strongly improved the larvae survival. Furthermore, the results revealed important cues that might represent the initial encapsulation of the developing worm within nodular tissue. These results demonstrate that tissue engineered 3D tissues represent an appropriate in vitro environment for the maintenance and examination of O. volvulus larvae. / Onchozerkose, die weltweit zweithäufigste infektionsbedingte Ursache für Erblindung von Menschen, wird durch Onchocerca volvulus (O. volvulus) verursacht, ein parasitärer Fadenwurm. Die allgemein als Flussblindheit bekannte Onchozerkose wird mit dem Medikament Ivermectin bekämpft, das jedoch nicht die adulten Parasiten tötet, die im Menschen mehr als 15 Jahre lang leben und sich vermehren. Ein tieferes Verständnis der Biologie des Parasiten und dessen Interaktionen im menschlichen Wirt ist für die Erforschung und Entwicklung neuer Instrumente – makrofilarizide Medikamente, Diagnostika und Impfstoffe – erforderlich. Da der Mensch der einzige Endwirt für O. volvulus ist, gibt es keine Tiermodelle für dessen Vermehrung. Zu Forschungszwecken werden adulte Würmer daher chirurgisch aus subkutanen Knoten erkrankter Individuen gewonnen. Ein zweidimensionales (2D) Kultursystem ermöglicht die Entwicklung von aus dem Vektor isolierten infektiösen O. volvulus-Larven (L3) bis zu einem frühen präadulten Stadium. Als problematisch erwies sich bisher die in vitro Entwicklung von O. volvulus bis zum adulten Wurm. Unsere Hypothese ist, dass eine erhöhte biologische Komplexität des Kultursystems die Entwicklung von O. volvulus-Larven in vitro unterstützt. Daher wurden entscheidende Faktoren der in vivo-Umgebung entwickelnder Larven – die menschliche Haut – auf ein dreidimensionales (3D) Kultursystem übertragen. Dieses Kultursystem sollte 1. Haut-spezifische extrazelluläre Matrix enthalten, 2. hautspezifische Zellen und 3. einen direkten Kontakt zwischen Larven und Gewebekomponenten ermöglichen. Dafür wurde ein neuartiges Fettgewebemodell entwickelt, das in ein mehrschichtiges Hautgewebe integriert wurde – bestehend aus Epidermis, Dermis und subkutanem Fettgewebe. Die Anwendung des dreischichtigen Hautgewebes als direktes Kultursystem wurde durch technische Herausforderungen verhindert. Jedoch unterstützte die indirekte Ko-Kultur von Hautmodellen das Wachstum der Larven (L4) in vitro. Die direkte Kultur mit dem Fettgewebemodell verbesserte die Viabilität der Larven signifikant. Darüber hinaus konnten Anzeichen für eine beginnende Verkapselung der Larven durch humane Zellen und Matrix gezeigt werden kann. Die Ergebnisse demonstrieren, dass humane Gewebemodelle eine angemessene in vitro-Umgebung für die Kultur und die Erforschung von O. volvulus darstellen.