Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / 1. Resumo Diversos mecanismos moleculares estão associados a resistência a antifúngicos em fungos patogénicos mais propriamente, Candida albicans: sobre-expressão dos genes CDR1, CDR2 e MDR1 que codificam para bombas de efluxo; alterações no nível de expressão ou mutações pontuais no gene ERG11, que codifica para a proteína alvo dos antifúngicos azoles, lanosterol 14 -desmetilase, envolvida na via biossintetica do ergosterol. Com o presente trabalho pretendeu-se esclarecer o(s) mecanismo(s) de resistência associados a um grupo alargado de estirpes clínicas de C. albicans procedendo a estudos fenotípicos e de expressão génica. Foram utilizadas 5 estirpes controlo e 62 estirpes clínicas de C. albicans (isoladas de diferentes produtos biológicos). Procedeu-se à determinação do fenótipo das estirpes controlo e clínicas, através do protocolo padrão do CLSI M27-A2, estabelecendo-se a concentração inibitória mínima para os antifúngicos fluconazole, itraconazole e voriconazole, na presença e ausência do ibuprofeno (100µg/ml). Para além disto, foi testada a hipótese de reversão de resistência devido a efluxo, por citometria de fluxo, usando o marcador fluoresecente FUN-1, descrito como marcador de efluxo. Em seguida, procedeu-se à optimização dos protocolos para a detecção e quantificação da expressão dos genes alvo CDR1, CDR2, MDR1 e ERG11, por PCR em Tempo Real. Diferentes parâmetros de reacção foram ensaiados para obtenção de curvas padrão, com valores de eficiência e erro dentro dos limites de referência, para assegurar a fiabilidade dos ensaios realizados. O gene ACT1 que codifica para a actina foi usado como gene normalizador dos níveis de expressão. A maioria das estirpes clínicas de C. albicans, resistentes a múltiplos azoles apresentaram uma sobre-expressão significativa dos genes CDR1 e principalmente CDR2, quando comparados com o gene ERG11; nestas o ibuprofeno induziu a reversão de resistência, aumentando a coloração pelo FUN-1. Nas 2 estirpes em que não ocorreu reversão do fenótipo resistente, o ibuprofeno não aumentou a fluorescência das células marcadas com FUN-1; para além disso, o aumento da expressão dos genes não se limitou ao CDR1 e CDR2 mas foi também significativa para o gene ERG11. De referir que a estirpe controlo 12-99 com múltiplos mecanismos de resistência descritos, não reverteu o seu fenótipo resistente na presença do ibuprofeno. Não foi detectada expressão do gene MDR1 em qualquer uma das estirpes clínicas resistentes. Estirpes com múltiplos mecanismos de resistência não reverteram pelo que o ibuprofeno parece ser um potencial bloqueador de efluxo de antifúngicos. A técnica de PCR em Tempo Real é um método prático e sensível em estudos de expressão génica, assim como o uso de SYBR Green é fiável, apesar de ser um marcador inespecífico, quando se insere em cada ensaio uma curva de fusão. / 2. Abstract Several resistance mechanisms are associated to antifungal resistance in pathogenic fungi, namely C. albicans: over-expression of CDR1, CDR2 and MDR1 genes encoding for eflux pumps; alterations in gene expression levels or point mutations in ERG11 gene, encoding for the azoles target enzyme lanosterol 14 - demethylase, associated to ergosterol biosynthesis. The aim of the present work was to uncover the resistance mechanisms in a large group of clinical C. albicans strains, performing phenotypic and gene expression studies. Five control strains and 62 clinical strains of C. albicans were used. Standard protocol from CLSI M27-A2 was used to determine the susceptibility phenotype calculating minimal inhibitory concentration for the antifungals fluconazole, itraconazole and voriconazole, with and without ibuprofen (100µg/ml). Also, reversion by efflux hypothesis was tested by flow cytometry, using as fluorescent marker FUN-1, known as an efflux marker. Next, real time PCR protocols for detection and quantification of the target genes CDR1, CDR2, MDR1 e ERG11, were optimized. Different reaction parameters were tested, to achieve values of efficiency and error obtained from standard curves, according to reference values, to ensure accuracy. ACT1 gene, which encodes for actin was used as normalizing gene for the gene expression levels. Most clinical strains resistant to all tested azoles showed a significant over-expression of CDR1 and specially CDR2 when compared to ERG11; in these strains ibuprofen induced the reversion of resistance and an increase in FUN-1 fluorescence. The 2 strains that did not revert their phenotype, ibuprofen did not increase the fluorescence of cells stained with FUN-1 and gene over-expression was not only for CDR1 and CDR2 but mostly for ERG11 gene. It should be stressed that C. albicans control strain 12-99 with known multiple resistance mechanisms did not revert the resistance phenotype in the presence of ibuprofen. MDR1 expression was not detected in none of the C. albicans clinical strains. Strains with multiple resistance mechanisms did not revert, wich might indicate that ibuprofen could be a potential antifungal efflux blocker. Real Time PCR is easily available and a sensitive method for gene expression studies, and also SYBR Green is acceptable, although being an unspecific marker, when a melting curve is added in each assay.

Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / CLASPs são proteínas altamente conservadas que participam na segregação dos cromossomas através do seu papel fundamental na interface cinetocoro-microtúbulo durante a mitose. Em levedura, Drosophila, e Xenopus, um único ortólogo da CLASP está presente, o qual é necessário para a formação do fuso mitótico através da regulação da dinâmica dos microtúbulos a nível do cinetocoro. Em mamíferos, no entanto, somente a CLASP1 tem sido implicada na divisão celular, apesar da existência de um segundo parólogo, CLASP2. Neste estudo descrevemos a localização mitótica da CLASP2 humana em células HeLa e mostramos que a sua localização nos cinetocoros, centrossomas, e fuso durante toda a mitose é notavelmente semelhante à CLASP1. A análise de fibroblastos embrionários de ratinho KO para a Clasp2 revelou que a localização da CLASP1 no cinetocoro e a resposta do checkpoint da Mad2 não estão comprometidos pela ausência de CLASP2. Para melhor compreender as funções das CLASPs em mitose, nomeadamente para determinar potenciais funções redundantes, nós realizamos a depleção de cada CLASP por RNAi. Notavelmente, a depleção isolada de cada CLASP não induziu qualquer erro significativo na mitose; a redução dos níveis de ambas as CLASPs por RNAi causou severos defeitos mitóticos a nível do fuso (principalmente células com fusos multipolares), e conteúdo anormal de DNA (aneuploidia). No geral, estes resultados sugerem que CLASP1 e CLASP2 possuem papéis sobreponíveis durante a mitose. A fim de compreender os mecanismos moleculares subjacentes à função das CLASPs humanas durante a mitose, nós realizamos um estudo proteómico para a identificação das proteínas interactoras da CLASP1 durante a mitose através de espectrometria de massa. Os nossos resultados confirmaram as interações entre CLASP1 - CLIP-170 e LL5ß, ambos descritas em interfase. Além disso, novas interacções foram encontradas como CENP-E, Astrin, GCC185, CENP-J/CPAP, MARK2 e a nova proteína KIAA0802. Em células interfásicas, as CLASPs acumulam-se no aparelho de Golgi e esta acumulação está relacionada com a presença de microtúbulos estabilizados. No entanto, há pouca informação a respeito da função de Golgi durante a mitose. A análise da distribuição mitótica da GCC185 mostrou que em estadios precoces a GCC185 localiza-se em torno dos centrossomas, e dispersa-se em metafase e anafase. Em telofase, a GCC185 relocaliza-se na região perinuclear e nos centrossomas. De notar que nós encontramos um co-localização extensiva entre a GCC185 e a CLASP1 (especialmente em profase, prometafase e telofase). A interacção entre a GCC185 e a CLASP1 foi também confirmada em extractos celulares interfásicos. Finalmente, muitas +TIPs como o APC, CLIP-170/Restin e EB1 têm sido implicadas em processos de aneuploidia e tumorigénese, formando uma complexa rede proteica com as CLASPs. Para determinar as implicações da CLASP1 nos mecanismos de tumorigénese, realizamos uma pesquisa mutacional numa linha celular humana derivada do carcinoma do cérvix (células HeLa). Na nossa análise mutacional encontramos três deleções: duas correspondem a isoformas da CLASP1 resultantes de splicing alternativo (737 1538 e 1125 1164), e a terceira deriva da perda parcial do exão 21 (673 679). Estas mutações podem estar relacionadas à instabilidade dos cromossomas que conduz a mutações aleatórias, ou podem reflectir que o gene CLASP1 é um alvo principal para mutações. Estes resultados incentivam a um exame maior para mutações da CLASP noutras linhas celulares tumorais e tumores primários. No geral, nós encontramos que a CLASP1 e CLASP2 possuem papéis redundantes durante a mitose, cuja ausência pode originar diversos defeitos mitóticos, conduzindo em último efeito à aneuploidia. Adicionalmente, descobrimos novas interacções moleculares com importantes proteínas mitóticas e fornecemos a ligação molecular entre a função da CLASP e o papel desconhecido do aparelho de Golgi durante a mitose. / CLASPs are well-conserved microtubule plus-end-tracking proteins that participate in chromosome segregation through their key role at the kinetochore-microtubule interface. In yeast, Drosophila, and Xenopus, a single CLASP orthologue is present, which is required for mitotic spindle assembly by regulating microtubule dynamics at the kinetochore. In mammals, however, only CLASP1 has been directly implicated in cell division, despite the existence of a second paralogue, CLASP2. Here we describe the mitotic localization of human CLASP2 in HeLa cells and show that its localization at kinetochores, centrosomes, and spindle throughout mitosis is remarkably similar to CLASP1. Analysis of Clasp2 KO mouse embryonic fibroblasts revealed that CLASP1 kinetochore localization and Mad2 checkpoint response is not compromised in the absence of CLASP2. To further understand CLASP roles in mitosis, namely to rule out potential redundant functions, we performed single CLASP depletion by RNAi. Remarkably, single CLASP depletion caused no significant impairment of mitosis, while reducing the levels of both CLASPs by RNAi caused severe mitotic spindle defects (mainly cells with multipolar spindles), and abnormal DNA content (aneuploidy). Overall, these results suggest that CLASP1 and CLASP2 play overlapping roles during mitosis. In order to understand the molecular mechanisms underlying the function of human CLASPs during mitosis, next we performed a proteomic study for the identification of CLASP1 interacting proteins during mitosis by mass-spectrometry. Our results confirmed the interactions between CLASP1 CLIP-170 and LL5ß, both described in interphase. Moreover, new interactors were found such as CENP-E, Astrin, GCC185, CENP-J/CPAP, MARK2 and the novel protein KIAA0802. In interphase cells, CLASPs accumulate at the Golgi apparatus and this accumulation is related to the presence of stabilized microtubules. However, there is little information concerning Golgi function during mitosis. Analysis of GCC185 mitotic distribution showed that in early stages GCC185 localizes around centrosomes, and disperses in metaphase and anaphase. In telophase, GCC185 re-localizes to the perinuclear region and centrosomes. Noteworthy, we found an extensive co-localization between GCC185 and CLASP1 (especially in prophase, prometaphase and telophase). The interaction between GCC185 and CLASP1 was also confirmed in interphase cell extracts. Finally, many +TIPs like APC, CLIP-170/Restin and EB1 have previously been implicated in aneuploidy and tumourigenesis, forming a complex protein network with CLASPs. To determine the implications of CLASP1 for the mechanisms of tumourigenesis, we performed a mutational screening in a human cell line derived from cervix carcinoma (HeLa cells). In our mutational analysis we found three deletions: two of them correspond to CLASP1 alternative spliced isoforms (737 1538 and 1125 1164), and the third derives from the partial loss of exon 21 (673 679). These mutations could be related to chromosomal instability leading to random mutations, or may reflect that CLASP1 gene is a main target for mutations. These results encourage a larger survey for CLASP mutations in other tumour cell lines and primary tumours. Overall, we found that CLASP1 and CLASP2 play redundant roles during mitosis, whose absence can originate several mitotic defects, and ultimately lead to aneuploidy. Additionally, we uncovered new molecular interactions with important and novel mitotic proteins and provided the molecular linkage between CLASP function and the still mysterious role of the Golgi apparatus during mitosis.

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Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / O sistema Fas/FasL é uma das vias de apoptose mais importantes, sendo essencial na regulação da proliferação celular e do crescimento tumoral. Polimorfismos funcionais nos promotores dos genes do receptor Fas (FAS 670A/G) e no seu ligando (FASL 844T/C) parecem alterar a transcrição destes genes. Ainda não foi estudado o papel dos polimorfismos FAS 670A/G e FASL 844T/C no cancro da próstata. Recorrendo à técnica de PCR RFLP foram analisadas amostras de DNA de 936 indivíduos do sexo masculino: 657 dos quais pacientes com carcinoma da próstata e 247 dadores sem doença oncológica. Os resultados deste estudo mostram um efeito protector nos portadores dos genótipos AG e GG do polimorfismo FAS 670 para invasão extra-capsular. Os indivíduos portadores do alelo G possuem uma protecção de 72% para doença avançada. Foi também demonstrada uma associação estatisticamente significativa entre o genótipo CC do polimorfismo FASL 844 e níveis de PSA elevados. Estes resultados sugerem que o alelo G do polimorfismo FAS 670 poderá reduzir os níveis de sFAS, que resulta de splicing alternativo do gene FAS, evitando assim o efeito inibidor da apoptose desta forma solúvel. Por outro lado, o genótipo CC do polimorfismo FASL 844 parece aumentar a apoptose das células tumorais de carcinoma da próstata, reduzindo os níveis de PSA. Assim, os polimorfismos dos genes FAS e FASL poderão estar envolvidos no desenvolvimento do carcinoma da próstata. / The Fas/FasL system is one of the major pathways in apoptosis and is important in the regulation of cell proliferation and tumor cell growth. Functional promoter polymorphisms on Fas receptor gene (FAS 670A/G) and in its ligand (FASL 844T/C) alter their transcriptional activity. The role of FAS and FASL polymorphisms in prostate cancer has not been studied. Using the PCR-based restriction fragment-length polymorphism methodology, FAS gene locus -670 and FASL gene locus -844 genotypes were evaluated in DNA samples from 936 men: 674 prostate cancer patients and 262 healthy controls. It was found that FAS 670 AG and GG genotypes represent a significantly protection for extra-capsular invasion. Taken together, these data show a significantly 72% protection was found for G allele carriers. A protective association between FASL 844 CC genotype for higher PSA levels was also found. It is well known that FAS 670 G allele reduces the transcriptional activity of FAS gene and FASL 844 CC genotype is associated with higher expression of FasL. It can be suggested that FAS 670 G allele may reduce sFas levels, which derive from FAS gene by alternative splicing, preventing the apoptotic inhibition caused by the soluble form. On the other hand, FASL 844 CC genotype appears to enhance apoptosis of prostate cancer cells reducing PSA levels. Therefore, FAS and FASL polymorphisms might be involved in prostate cancer development.

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Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / Os tumores mamários espontâneos são as neoplasias mais frequentes na cadela, possuindo uma elevada heterogeneidade biológica e histomorfológica. Aproximadamente metade de todos os tumores mamários em cães são malignos, apresentando um elevado potencial de metastização para nódulos linfáticos ou outros órgãos, como, por exemplo, o pulmão. A transformação maligna está associada a uma glicosilação anormal, o que resulta na síntese e expressão alterada de determinantes de carbohidratos. Grande parte da investigação em humanos sobre cancro da mama é efectuada em linhas celulares estabelecidas de carcinoma da mama, como modelos in vitro, uma vez que têm a capacidade de proliferar indefinidamente. Contudo, tendo em conta que a interacção entre o tumor e o organismo deve ser considerada, subsiste a necessidade de confirmação dos resultados em modelos animais. De forma a aprofundar o conhecimento da biologia dos tumores da mama de cadela, foram estabelecidos dois modelos experimentais, um in vitro e outro in vivo. Na primeira parte do trabalho, foram estabelecidas três linhas celulares de tumores mamários caninos um adenoma e dois carcinomas complexos partindo de fragmentos de tumores colhidos, no acto da cirurgia. Observou-se a presença de células do tipo epitelial e mioepitelial, após imunomarcação in vitro para os filamentos intermediários. Após a heterotransplantação destas linhas celulares em ratinhos nude, verificou-se que elas não eram tumorigénicas. Numa segunda parte do trabalho, foi feita a caracterização in vitro e in vivo de uma linha celular previamente estabelecida, derivada de um carcinoma ductal infiltrativo de mama de cadela. As células aderem ao fundo do frasco como uma fina monocamada, possuem um tempo de duplicação de 32,6±1,4 horas e, quando crescem em agar, formam um agregado único e volumoso. Os ensaios de mobilidade celular mostraram que estas células conservam a sua arquitectura tipo célula epitelial e têm a capacidade de se mover entre as duas margens de uma lesão artificial de forma compacta e unidireccional. Estas células apresentam imunoreactividade para a E-caderina e um índice de proliferação elevado. Um painel de anticorpos para os filamentos intermediários foi usado para determinar a origem da linha celular, observando-se uma intensa imunoreactividade para a citoqueratina AE1/AE3, característica das células epiteliais. A CK14 é expressa em 25-50% das células e a vimentina também apresenta um elevado nível de expressão, que se encontra descrito como normal em células em cultura. Estas células têm também imunomarcação para os carbohidratos sLex, Lex e Lea, podendo esta expressão aberrante ter um papel fundamental nos mecanismos de metastização à distância, facilitando a interacção positiva com o órgão alvo e mostrar-se relevante como marcador tumoral de prognóstico. Ensaios in vivo demonstraram que estas células cresciam quando inoculadas subcutaneamente no panículo da glândula mamária de ratinhos nude fêmeas. As massas tumorais eram histologicamente idênticas às lesões tumorais da mama de onde derivavam e, quando os tumores heterotransplantados foram colocados em cultura, a expressão dos filamentos intermediários e dos carbohidratos não se alteraram. De forma a identificar os tecidos metastáticos alvo, foi feita a injecção endovenosa na veia caudal dos ratinhos, observando-se metastização para os nódulos linfáticos, pulmão, coração, baço, rim e fígado. A tumorigenicidade e metastização observada nos ratinhos nude, bem como a mobilidade da linha celular in vitro, propõem um fenótipo agressivo para estas células. De uma forma geral, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que os tumores mamários caninos constituem um excelente modelo para o estudo do cancro da mama humano. / Spontaneous mammary tumors are the most common neoplasia in the female dog and have a high biological and histomorphological heterogeneity. Approximately one-half of all mammary tumors in dogs are malignant and have a great potential to metastasize to the regional lymph nodes or other organs such as the lungs. Malignant transformation is associated with abnormal glycosylation, resulting in the synthesis and expression of altered carbohydrates determinants. In humans, the majority of breast cancer research is conducted using established breast cancer cell lines as in vitro models because they have the ability to proliferate indefinitely. However, the interaction between the tumor and the host organism must be taken into consideration, so the results need to be confirmed using animal models. In order to have an in depth view of the biology of canine mammary tumors, two experimental models, one in vitro and another in vivo, were established. In the first part of this work, three canine mammary carcinoma cell lines were established - one complex adenoma and two complex carcinomas - using fragments of tumors excised during a surgical procedure performed on a female dog. After the in vitro immunostaining for intermediate filaments, the presence of epithelial and mioepithelial cells was determined. When these cell lines were heterotlansplanted in nude mice it was noted that they were not tumorigenic. In the second part of the work an in vitro and in vivo characterization of a previously established cell line was made, derived from a canine mammary ductular carcinoma. These cells adhered to the bottom of the flask as a compact thin monolayer, had a doubling time of 32,6±1,4 hours and when they were grown in agar they formed a unique large aggregate. Cell motility assay showed that these cells conserved an epithelial-like architecture and had the ability to move between the edges of an artificial wound in a compact front of migration, with the cells moving unidirectionally. These cells had immunoreactivity for E-cadherin and showed a high proliferative index. A panel of antibodies for intermediate filaments was used to evaluate the origin of the cell line and it showed intense immunoreactivity for AE1/AE3 keratin which is a characteristic feature of epithelial cells. CK14 was expressed in 25-50% of the cells and vimentin also showed a high level of expression, which can be normal in culture tissues. These cells also immunostained for the carbohydrates sLex, Lex and Lea, and this aberrant expression may also play a fundamental role in the molecular mechanisms of metastization to distant organs, facilitate positive interactions within the target organ and could be useful as a prognostic tumour marker. In vivo assays showed that these cells grew when inoculated subcutaneously in the mammary fat pad of female nude mice. Tumour masses were histologically identical to the mammary tumour lesions they derived from, and when heterotransplanted tumours were cultured, the expression of intermediate filaments and carbohydrates was not altered. To look for metastatic target tissues we performed an intravenous injection in the tail vein of the mice. These cells metastasized to lymph nodes, lungs, heart, spleen, kidney and liver. The tumorigenicity and metastization observed in nude mice, as well as the motility of this cell line in vitro are suggestive of an aggressive phenotype for these cells. On the whole, the results obtained from this work suggest that canine mammary tumours are good models for the study of human breast cancer.

Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular / Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine / Chronic hepatitis C (HC) is a major public health problem because of the number of infected persons (3% of the world population and about 150000 Portuguese individuals) and the potencial to cause cirrhosis, end-stage liver disease, and hepatocelular carcinoma in many of those infected. The most effective treatment (pegylated interferon and ribavirin) has variable response rates, between 45 e 80%, and major side effects. Treatment duration depends on viral genotype and virological response after the first 12 weeks on therapy. Genotype and viral load are independent factors of response. However, the question is why hosts infected with same genotype and similar viral loads have different treatment response rates. Genotype 1, high viral load, higher quasispecies diversity, NS5A interferon determining sensitivity domain variations was associated with lower responses. Others identified host factors for therapy response such as race, gene expression, HLA-DRB and class I alleles and cytokine gene polymorphisms as interferon- , TNF- , interferon response genes. Gene expression analysis by microarrays found 8 genes as response discriminants. Pre-treatment cytokine and supressors of cytokine levels may also correlate with treatment response. Our aim was to analyse if host genetic polymorphisms related to Th1 immune response polarization, hepatic lesion mechanisms and signaling after TCR activation or IFN signaling - OPN, TNF- , ACP1 respectivelly could explain different treatment responses. We also analysed healthy individuals and correlated OPN plasma levels and OPN genotypes. Patients with HCV genotype 1 and 4 were included. Matherial: 95 patients treated with pegylated interferon and ribavirin were selected. Control group included healthy blood donors. HC group was classified according to treatment response type: non responders (NR); end of treatment response and relapse (RR); Sustained response (SR). Absence of SR (NSR) = NR+RR. Methods: Blood was collected for DNA and plasma extraction. Genetic polymorphisms were performed by PCR-RFLP: 8090 OPN (C/T), -308 TNF- (A/G), ACP1 (A/B/C). Plasma OPN concentrations measured by ELISA commercial Kit. Statistical analysis: SPSS vs13. Results: OPN and ACP1 genotype distribution was signifficantly different in subjects with HC in comparison with those of control group. OPN TT genotype, TNF- GG, ACP1 AA and AB are more frequent in HC group. OR for HC was : 2,22 if OPN TT genotype, 1,57 if TNF- AA or AG, and 9,99 if ACP1 with lower phosphatasic activity. 87 CHC patients were infected by genotype 1 virus and 8 by genotype 4. According to treatment response HC subgroups are: 43 NR, 16 RR, 36 SR and 59 NSR. No significant differences were observed between those groups concerning age, sex, viral load, histological activity and fibrosis stages. OPN TT allele carriers predominate in NSR and CC predominate in SR. OR for SR versus NSR is 3,32 if one T allele is present and 0,29 if one C allele is present. TNF- and ACP1 genotypes were not significantly different is those treatment response subgroups. NSR has lower median plasma OPN levels. Also TT genotypes had lower levels. RR patients had the lowest levels plasma OPN levels. Conclusions: our results suggest that both OPN and ACP1 genotypes are related to HC susceptibility. OPN genotype is a host factor related to treatment response and that there is a trend toward higher median plasma OPN levels in responders.