La primera part d'aquest treball s´ha centrat en la caracterització i optimització del procés d'activació de l´onconasa recombinant per tal d'obtenir l´enzim igual a la forma nativa. Per això, les reaccions d'eliminació de la Met-1 i la ciclació de la Glu1, necessàries per generar el piroglutamic han estat seguides per MALDI-TOF MS. La segona part d´aquest treball s´ha centrat en l´estudi de la contribució del pont disulfur 30-75 de l´onconasa a les seves propietats biològiques. Els resultats suggereixen que el potencial redox del citosol cel·lular podria reduir el pont disulfur 30-75 de l´onconasa salvatge afectant la unió onconasa -inhibidor proteic de ribonucleases. La tercera part ha consistit en la construcció de variants de l´HP-RNasa i onconasa amb activitat bactericida. Per això, s´ha introduït el determinant bactericida (YRWR) descrit per la proteïna catiònica d'eosinòfils en els dos enzims. Els resultats obtinguts han evidenciat que les dues ribonucleases amb el determinant bactericida presenten activitat citotòxica contra bacteris gram-negatius preferentment. / The first part of this work has been focused on the characterization and optimization of the activation process of the recombinant onconase to get an enzyme analogous to the native form. For this, Met-1 removal and Glu1 cyclization have been followed by MALDI-TOF MS. The second part of this work is focused on the study of the contribution of the 30-75 disulfide bond of onconase to its biological properties. The results suggest that the redox potential of the cytosol could reduce the disulfide bond 30-75 affecting the binding of onconase-ribonuclease inhibitor. The third part has been focused on the construction of HP-RNase and onconase variants endowed with bactericidal activity. For this, we have introduced a bactericidal (YRWR) determinant described for eosinophil cationic protein onto both enzymes. The resulting variants have bactericidal activity against gram-negative bacteria.

En aquesta tesi s'han estudiat les propietats antitumorals d'una variant de la ribonucleasa pancreàtica humana anomenada PE5 que incorpora un senyal de localització nuclear. Aquest estudi mostra que PE5 indueix l'apoptosi de les cèl·lules tractades i que aquesta mort és independent de l'activitat de p53. A més, l'efecte citotòxic no es veu afectat per un fenotip de resistència a múltiples drogues. Les dades també mostren que l'activitat citotòxica de PE5 és selectiva per a cèl·lules tumorals in vitro i que la capacitat citotòxica de les dues ribonucleases és semblant. S'ha estudiat l'efecte d'aquestes dues ribonucleases sobre el cicle cel·lular, l'activació de diferents caspases i l'expressió de proteïnes relacionades amb l'apoptosi i el cicle cel·lular. Els resultats indiquen que PE5 i l'onconasa maten les cèl·lules a través de mecanismes diferents. A més, PE5 però no l'onconasa, redueix l'acumulació de glicoproteïna-P en dues línies cel·lulars resistents a múltiples drogues. / In this thesis the antitumor properties of PE5, a variant of human pancreatic ribonuclease carrying a nuclear localization signal, have been investigated. This study shows that the cytotoxicity of PE5 is produced through apoptosis and that this ribonuclease does not require the activity of p53 to trigger the cell death. In addition, the cytotoxic effect is not prevented by a multiple drug resistance phenotype. The data also show that in vitro PE5 is selective for tumor cells and that PE5 and onconase induce cell death to the same extent. Effects of both ribonucleases on the cell cycle, on the activation of different caspases and on the expression of different apoptosis- and cell cycle-related proteins have been investigated. The results show that PE5 and onconase kill the cells through mechanisms with significant differences. In addition, PE5 but not onconase, reduces the accumulation of P-glycoprotein in two different multidrug-resistant cell lines.