L'evolució clínica de la leucèmia limfocitària crònica (LLC) és amb freqüència indolent, però és una malaltia que roman incurable. Els pacients simptomàtics tenen una supervivència entre 1-7 anys, fins i tot utilitzant les millors opcions terapèutiques. Encara que han estat avaluades tot una sèrie de combinacions terapèutiques en pacients amb recaiguda o refractaris als tractaments, cap alternativa ha demostrat ser superior. Per tant, és evident la necessitat de trobar alternatives terapèutiques per aquests pacients. Diferents estudis en fase II han mostrat que l'associació del rituximab a la quimioteràpia ha millorat el percentatge de resposta i el període lliure de malaltia. No obstant, tots els pacients a la llarga experimenten una progressió de la malaltia. Un dels principals mecanismes d'acció del rituximab és la citotoxicitat cel·lular depenent d'anticossos. Les principals cèl·lules efectores implicades en aquest mecanisme d'acció són les cèl·lules portadores de receptors Fcγ, i dintre d'aquest grup les que juguen un paper primordial són les cèl·lules NK. La hipòtesi general va ser l'anàlisi de molècules potenciadores de la capacitat citotòxica de les cèl·lules NK i de l'ADCC, per poder ser utilitzades associades al rituximab com a adjuvants en el tractament de les leucèmies limfàtiques cròniques. Entre aquestes molècules es va estudiar el CpG ODN A per mimetitzar l'activitat estimuladora del DNA bacterià, a través del TLR9 i provocar una forta activació i síntesi d'IFNγ per cèl·lules NK. L'altre molècula va ser l'IL-15 per estar estretament relacionada en la supervivència, proliferació i activació de les cèl·lules NK. Es va observar que la IL-15 i el CpG ODN A eren 2 molècules estimuladores que potenciaven significativament la capacitat citotòxica de PBMCs, en presència o absència de rituximab, quan s'enfrontaven tant a una línia cel·lular de limfoma B humà com a cèl·lules leucèmiques de LLC-B. La principal població efectora responsable d'aquesta potenciació citotòxica van ser les cèl·lules NK. No obstant el mecanisme d'acció responsable va ser diferent. Mentre que la IL-15 incrementava la capacitat citotòxica de la cèl·lula NK tant directament com indirectament, el CpG ODN A ho feia només indirectament requerint de senyals addicionals presents a les PBMCs. Quan les PBMCs es van enfrontar a cèl·lules de limfoma B de la línia cel·lular Raji va resultar que els dos estímuls es comportaven igual. Però quan van ser cèl·lules leucèmiques de LLC-B, la IL-15 es va comportar com un estímul significativament més potent que el CpG ODN A incrementant la citotoxicitat natural i l'ADCC. La IL-15 en aquest sentit va actuar incrementant l'expressió de receptors relacionats amb cèl·lules NK en desgranulació (CD16, CD69 i NKG2D) i del receptor LFA-1 implicat en la senyalització de la citotoxicitat (adhesió cel·lular). Així com produint un augment significatiu d'IFN-γ. En presència de TGF-β, citocina immunosupressora que disminueix de manera significativa la citotoxicitat natural i l'ADCC de PBMCs enfrontades a cèl·lules leucèmiques de LLC, la IL-15 va poder contrarestar aquest efecte supressor. De la mateixa manera en presència d'IL-15, la disminució que provoca el TGF-β en la producció d'IFN-γ, va ser menor i més variable no sent significativa. / The clinical course of chronic lymphocytic leukemia is often insidious, but it is a disease that remains not treatable. Even using the best therapeutic options, symptomatic patients have a survival between 1-7 years. Several series of therapeutic combinations have been evaluated for patients with relapses and refractory to treatment, but none has been demonstrated to be superior. Therefore, it is notable the need to find therapeutic alternatives for these patients. Different studies in phase II have shown that the addition of rituximab to chemotherapy has improved the percentage of response and the disease free period. However, all patients suffer progression of the disease at long term. One of the main mechanisms of action of rituximab is the antibody mediated cytotoxicity. The most important effector cells involved in this mechanism of action are Fcγ receptors cells, specifically NK cells. The general hypothesis is the analysis of molecules enhancing the cytotoxic capacity of NK cells and ADCC, for them to be used in addition to rituximab as adjuvant in the treatment of chronic lymphocytic leukemia. Amongst these molecules, CpG ODN A was studied because its capacity to mimetise the stimulating activity of bacterial DNA through TLR9 and to induce a strong activation and synthesis of IFNγ by NK cells. The other molecule was IL-15, due to its involvement in survival, proliferation and activation of NK cells. It was observed that IL-15 and CpG ODN A were two stimulating molecules than significantly enhanced the cytotoxic capacity of PBMCs, in the presence or absence of rituximab, when they were confronted to cells from B lymphoma Raji line and to leukemic cells from CLL-B. The major effector population responsible for this cytotoxic enhancement are the NK cells. However, the mechanism of action is different. Whereas IL-15 increased the cytotoxic capacity of the NK cell directly as much as indirectly, CpG ODN A did it only indirectly, requiring of additional signals present in PBMCs. When PBMCs were confronted to Raji cells from B cell lymphoma, the two stimuli had a similar behavior. However, when PBMCs were confronted to leukemic cells from CLL-B, Il-15 was a stronger stimulus than CpG ODN A, enhancing the natural cytotoxicity and ADCC. In this way, IL-15 worked increasing the expression of receptors related to degranulating NK cells (CD16, CD69 and NKG2D) and of LFA-1 receptor, implied in the cytotoxicity signaling (cellular adhesion), and increasing significantly IFNγ production. In the presence of TGF-β, immunosupressor cytokine that decrease significantly the natural cytotoxicity and ADCC of PBMCs confronted to leukemic cells from CLL, IL-15 is able to counteract this suppressive effect. In the same way, the reduction caused in IFN-γ production is going to be smaller and more variable in the presence of IL-15, although not significantly.

S'han estudiat els efectes de dos fàrmacs intercalants al DNA, Daunorubicina (usat com antitumoral) i Criptolepina (amb elevada citotoxicitat i usat com antimalàric), en el llevat "S.cerevisiae".Ambdues molècules s'uneixen al DNA però amb diferent preferència de seqüència: mentre que la Daunorubicina reconeix preferentment regions 5'(A/T)CG3', la Criptolepina s'uneix a 5'GG3'. S'han descrit nombroses regions reguladores riques en aquest tipu de seqüències, pel que ambdós fàrmacs podrien competir amb factors de transcripció nuclears, modificant l'expressió gènica.Els principals objectius del nostre estudi foren:1.Determinar l'efecte citotòxic dels dos fàrmacs en diferents soques de S.cerevisiae: BY4741, BY4741-delta-erg6 (soca amb major permeabilitat de la membrana plasmàtica als fàrmacs), BY4741-delta-rad52 (soca amb un gen de la maquinària de reparació delecionat):- En primer lloc, s'analitzaren els efectes sobre el creixement cel·lular de les soques tractades amb diferents concentracions de cada molècula, tant amb glucosa com galactosa com a fonts de carboni. Els nostres resultats. Els nostres resultats demostren que la permeabilitat de la membrana és necessària per aconseguir la concentració de Daunorubicina que desencadena el seu efecte citotòxic. En canvi, la maquinària de reparació del dany al DNA pot ser una diana potencial de la Criptolepina.- Mitjançant una anàlisi semiquantitativa de l'expressió d'alguns dels principals gens del metabolisme de la galactosa, es va observar un efecte diferencial dels fàrmacs, ja que el factor regulador dels gens de la galactosa presenta en la seva seqüència consens, la diana per a la Daunorubicina i no per a la Criptolepina. Aquest solapament de seqüència explica el patró repressor induït per la Daunorubicina, però no per a la Criptolepina, resultat que està d'acord amb el major efecte citotòxic de la Daunorubicina en cèl·lules crescudes en galactosa.2.Avaluar la resposta transcripcional a nivell global de cada intercalant en la soca BY4741-delta-erg6, utilitzant la glucosa com a font de carboni.- Mitjançant l'ús de microarrays, es va identificar els perfils d'expressió gènica diferencial per a cadascun dels tractaments (Daunorubicina o Criptolepina), en funció de la concentració i del temps. A partir d'aquests experiments es va confirmar que l'efecte de la Daunorubicina sobre la transcripció és pronunciat, mentre que els canvis observats per a la criptolepina són lleus.- A partir dels resultats obtinguts, es van classificar els gens en diferents categories funcionals i es varen validar els resultats obtinguts per RT-PCR a temps real. Es va observar que tot i que la Daunorubicina reprimeix l'expressió dels gens glicolítics, la criptolepina està associada principalment a la inducció dels gens de resposta a estrès. D'una manera menys significativa, la Criptolepina altera també la transcripció de gens implicats en el transport del ferro i de gens mitocondrials.- Mitjançant un estudi in silico, es va confirmar que les variacions en els perfils d'expressió gènica es deuen a un efecte directe dels fàrmacs sobre els factors de transcripció que regulen aquests gens, degut a que competeixen per les mateixes dianes d'unió al DNA.A partir de la identificació dels mecanismes d'acció de cada fàrmac en S.cerevisiae, els nostres resultats plantegen noves vies en el disseny de nous fàrmacs antitumorals i antiparasitaris. / The main objective of this thesis is to analyse the effects of two DNA interacting drugs, Daunorubicin (used as antitumoral) and Cryptolepine (with elevated cytotoxicity and used as an antimalarian) in Saccharomyces cerevisiae. Both drugs intercalate in CG rich regions, the preferent sequence for Daunorubicin being 5'(A/T)CG3' and for Cryptolepine being 5'GG3'. These sites are common in consensus sequences of transcription factors and the competition of drugs for those sites can alter gene expresion.First, we evaluated the effects in cellular proliferation in yeast strains of different genetic backgrounds (related to membrane permeability and DNA lesion repair), in glucose and galactose as carbon source. We observed that permeability of plasma membrane is necessary in order to reach a citotoxic concentration of Daunorubicin. On the other hand, the DNA repair machinery seems to be a potential target of Cryptolepine. By a semiquantitative analysis of expression of GAL genes, we observed a differential effect of both drugs. Daunorubicin caused a decrease in GAL genes expression while Cryptolepine did not. This can be due to the fact that the main regulatory protein of galactose metabolism has the preferent binding site for Daunorubicin in the consensus sequences.The effect of Daunorubicin and Cryptolepine on yeast transcriptome was studied in the most permeable yeast strain using glucose as carbon source. Using microarrays, we identified different gene expression patterns for each drug. Genome wide results were grouped into functional categories and confirmed by real time RT-PCR. We observed that Daunorubicin downregulates glycolytic genes and Cryptolepine induces a stress response and decreases the transcriptional levels of specific genes related to iron transport (siderophores) and mitochondrial genes. We used in silico assays to correlate the expression patterns induced by both drugs with a direct effect in the regulatory proteins involved in the transcription of these genes. Results confirm different action mechanisms for each intercalating drug tested. Daunorubicin may alter the regulatory complex Gcr1p-Gcr2p responsible of upregulation of glycolytic genes, and Cryptolepine may induce a pleiotropic effect.Overall, these results can raise new approaches in the development of new antitumour and antiparasit drugs.

La primera part d'aquest treball s´ha centrat en la caracterització i optimització del procés d'activació de l´onconasa recombinant per tal d'obtenir l´enzim igual a la forma nativa. Per això, les reaccions d'eliminació de la Met-1 i la ciclació de la Glu1, necessàries per generar el piroglutamic han estat seguides per MALDI-TOF MS. La segona part d´aquest treball s´ha centrat en l´estudi de la contribució del pont disulfur 30-75 de l´onconasa a les seves propietats biològiques. Els resultats suggereixen que el potencial redox del citosol cel·lular podria reduir el pont disulfur 30-75 de l´onconasa salvatge afectant la unió onconasa -inhibidor proteic de ribonucleases. La tercera part ha consistit en la construcció de variants de l´HP-RNasa i onconasa amb activitat bactericida. Per això, s´ha introduït el determinant bactericida (YRWR) descrit per la proteïna catiònica d'eosinòfils en els dos enzims. Els resultats obtinguts han evidenciat que les dues ribonucleases amb el determinant bactericida presenten activitat citotòxica contra bacteris gram-negatius preferentment. / The first part of this work has been focused on the characterization and optimization of the activation process of the recombinant onconase to get an enzyme analogous to the native form. For this, Met-1 removal and Glu1 cyclization have been followed by MALDI-TOF MS. The second part of this work is focused on the study of the contribution of the 30-75 disulfide bond of onconase to its biological properties. The results suggest that the redox potential of the cytosol could reduce the disulfide bond 30-75 affecting the binding of onconase-ribonuclease inhibitor. The third part has been focused on the construction of HP-RNase and onconase variants endowed with bactericidal activity. For this, we have introduced a bactericidal (YRWR) determinant described for eosinophil cationic protein onto both enzymes. The resulting variants have bactericidal activity against gram-negative bacteria.

Les propietats insecticides d’una sèrie d’esters d’al•lil va ésser avaluada en diferents insectes mitjançant diferents modes d’aplicació. L’acció per aplicació tòpica va variar en funció de l’ester d’al•lil aplicat. El cinamat i el naftoat d’al•lil van ser els compostos més actius front a ous i larves neonates de C. pomonella, G. molesta i L. botrana, mentre que el salicilat d’al•lil no va produir mortalitat a la major dosi assajada (10 mg/mL). El cinamat d’al•lil va ser l’únic ester actiu per aplicació tòpica en adults de A. pisum, mentre que tots els esters d’al•lil testatsvan ser actius en adults de T. castaneum. Els esters d’al•lil assajats van produir una pèrdua de la viabilitat cel•lular en les línees cel•lulars d’insectes quan va èsser mesurda mitjançant dos metodologies diferents (MTT i Blau de tripà), degut a una disrupció de les membranes cel•lulars. El cinamat d’al•lil va ser el compost més actiu i les cèl•lules procedents de l’aparell digestiu de Choristoneura fumiferana (Lepidòpter) les més sensibles. L’acció insecticida per ingestió va ser confirmada en larves de S. littoralis i C. pomonella, i en nimfes de A. pisum, senyalant l’aparell digestiu com a principal punt d’acció dels esters d’al•lil. Els corresponents àcids i dicloropropilesters van mostrar una menor o igual acció insecticida que els corresponents esters d’al•lil, deguda també, a una acció en la membrana cel•lular. Les diferències en l’acció dels compostos seria deguda a diferències en les propietats lipofíliques dels compostos i la seva interacció amb les membranes cel•lulars. Pel que fa a l’efecte dels esters d’al•lil en la comunicació química dels insectes, aquesta va tenir lloc en T. castaneum però no en A. pisum, el que es podria utilitzar per a mantenir els productes enmagatzemats lliures de T. castaneum. Pel que fa a C. pomonella i a L. botrana, tots els esters d’al•lil assajats van produir una resposta en les antenes dels mascles de C. pomonella, però tan sols el cinamat d’al•lil la va provocar en les femelles de C. pomonella i en mascles i femelles de L. botrana. Aquesta acció no es va veure reflexada en un increment de l’atracció de mascles cap a fonts amb l’ester d’al•lil i feromona en assajos en túnel de vent, però si en l’atracció de femelles. Aquest fet podria utilitzar-se per a incrementar el nombre de captures de femelles en trampes de feromona. Aquests resultats suggereixen un paper dels esters d’al•lil en el control de plagues, especialment del cinamat d’al•lil. / La acción insecticida de varios esteres de alilo fue testada en diversos insectos y mediante distintos modos de aplicación. La actividad por aplicación tópica varió en función del éster de alilo. El cinamato de alilo y el naftoato de alilo fueros los compuestos más activos en huevos y larvas neonatas de C. pomonella, G. molesta y L. botrana, mientras que el salicilato de alilo no produjo mortalidad a la dosis más alta testada (10 mg/mL). El cinamato de alilo fue el único éster activo por aplicación tópica en A. pisum mientras que todos los esteres testados lo fueron para T. castaneum. Los esteres de alilo estudiados produjeron pérdida de viabilidad celular en todas las líneas celulares de insectos cuando dicha viabilidad fue analizada mediante dos metodologías distintas (MTT y Azul de Tripano), y siendo ésta debida a la disrupción de la membrana celular. El cinamato de alilo fue el producto más activo, y las células del aparato digestivo de Choristoneura fumiferana (Lepidoptera) las más sensibles. La acción insecticida por ingestión en larvas de S. littoralis y C. pomonella, y en ninfas de A. pisum, fue confirmada y el aparato digestivo fue señalado como principal punto de acción de los esteres de alilo. Los correspondientes ácidos y dicloropropilesteres presentaron una menor o igual acción insecticida que los esteres de alilo siendo dicha acción también debida a un efecto en la membrana celular. Las diferencias en la acción de los distintos compuestos podrían ser debidas a diferencias en las propiedades lipofílicas de los compuestos y su interacción con las membranas celulares. Los esteres de alilo produjeron un efecto en la comunicación química de T. castaneum pero no en A. pisum, lo que podría utilizarse para mantener los productos almacenados libres de T. castaneum. En cuanto a C. pomonella y L. botrana, todos los esteres de alilo probados produjeron una respuesta en las antenas de los machos de C. pomonella, mientras que tan solo el cinamato de alilo la produjo en las antenas de hembras de C. pomonella y en machos y hembras de L. botrana. Esta respuesta no se tradujo en un aumento de la atracción de machos hacia cebos con mezclas de ester de alilo y feromona en ensayos de túnel de viento, pero si aumentó el número de hembras atraídas. Este hecho podría utilizarse par incrementar el número de hembras capturadas en trampas de feromona. Estos resultados, sugieren el papel de los esteres de alilo en el control de plagas, especialmente del cinamato de alilo.

En aquesta tesi s'ha caracteritzat la ruta d'internalització de l'onconasa, una RNasa citotòxica. Els resultats indiquen que l'onconasa entra a les cèl·lules per la via dependent de clatrina i del complex AP-2. Seguidament es dirigeix als endosomes de reciclatge i es a través d'aquesta ruta que la proteïna exerceix la citotoxicitat. Per altra banda, els resultats d'aquest treball demostren que PE5, una variant citotòxica de la ribonucleasa pancreàtica humana (HP-RNasa), interacciona amb la importina  mitjançant diferents residus que tot i que no són seqüencials, es troben propers en l'estructura tridimensional d'aquesta proteïna. PM8 és una HP-RNasa amb estructura cristal·logràfica dimèrica constituïda per intercanvi de dominis N-terminals. En aquesta tesi s'han establert les condicions per estabilitzar aquest dimer en solució i també es proposa un mecanisme per la dimerització. / In this thesis it has been characterized the internalization pathway of onconase, which is a cytotoxic ribonuclease. The results show that onconase enters cells using AP-2/clathrin mediated pathway and then is routed to the recycling endosomes. In addition, the results show that this is the route used by onconase to perform its cytotoxicity. On the other hand, the results indicate that PE5, a cytotoxic human pancreatic ribonuclease (HP-RNase), interacts with importin α using different residues that although they are scattered along the sequence, they are close in the three-dimensional structure of the protein. PM8 constitutes a crystallographic dimer by the exchange of the N-terminal domains. In this thesis it has been investigated the solution conditions that favour the dimeric form and it is proposed a dimerization process of this variant. Finally, the pattern of substrate cleavage is studied by HP-RNase.

Amb la finalitat d'aprofundir en les bases moleculars de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, es van construir variants derivades de l'HP-RNasa seguint dues estratègies. En la primera, es van generar variants de l'enzim resistents a l'acció de l'inhibidor proteic de les ribonucleases (hRI), substituint residus implicats en la interfície de contacte entre la ribonucleasa i l'hRI. En la segona, es va addicionar el motiu RGD en regions de superfície de la proteïna implicades en la formació del complex amb l'hRI, a fi de promoure la seva interacció amb la membrana plasmàtica de les cèl·lules i a la vegada disminuir l'afinitat de les variants per l'hRI. Es va comprovar que només les variants portadores de substitucions múltiples adquirien la capacitat de resistència a l'hRI.L'estudi del percentatge d'inhibició de la síntesi proteica en cèl·lules incubades amb cadascuna de les variants va mostrar que només dues de les variants construïdes havien adquirit propietats citotòxiques. La citotoxicitat més elevada la va presentar una variant que no era resistent a l'hRI, amb valors que eren només entre 5 i 15 vegades inferiors als de l'onconasa. Aquest resultat demostrà que la sensibilitat a l'hRI no és necessàriament un paràmetre limitant per a la citotoxicitat de les ribonucleases. Cap de les variants que incorporava un motiu RGD presentà citotoxicitat, evidenciant que aquest motiu no és efectiu a fi de dotar les ribonucleases pancreàtiques de propietats citotòxiques.Es van estudiar les bases moleculars de la citotoxicitat de la variant més citotòxica. En primer lloc, l'anàlisi de la internalització per marcatge radioactiu d'aquesta variant en relació amb l'onconasa i amb altres variants de l'HP-RNasa no citotòxiques, va posar en evidència que només l'onconasa era internalitzada eficientment. Es descartava així la possibilitat que l'acció citotòxica de l'enzim estudiat fos conseqüència d'una major eficiència d'endocitosi. També es va comprovar que l'addició del motiu RGD no era capaç de promoure la internalització de les proteïnes amb més eficàcia. Per microscòpia confocal de fluorescència, les variants humanes només es van començar a detectar a l'interior de la cèl·lula a partir de les 24 h d'incubació.Totes les variants generades van presentar una eficiència catalítica superior al 50 % de l'activitat de la seva proteïna parental, PM5, indicant que probablement l'estructura del centre actiu no havia estat afectada de manera dràstica per les substitucions introduïdes. No obstant, en tots els casos es va produir una disminució en la termoestabilitat respecte a PM5. Aquest resultat indicà que la correlació descrita a la bibliografia entre l'increment de termoestabilitat i l'increment de citotoxicitat per les ribonucleases no sempre es compleix. Per microscòpia confocal es va comprovar que tant la proteïna més citotòxica, com una variant no citotòxica resistent a l'hRI, així com la proteïna parental, seguien la via de degradació lisosomal. Aquesta ruta de trànsit no va ser afectada per l'addició de drogues que alteren les vies de trànsit retrògrad (monensina i brefeldina A), però sí per l'addició de la bafilomicina A1, una droga que neutralitza el pH endosomal i que va actuar alentint el trànsit de les proteïnes als lisosomes. D'acord amb aquests resultats, els valors de citotoxicitat de les variants es van incrementar de manera significativa només en presència de bafilomicina A1, suggerint que les ribonucleases transloquen al citoplasma a partir d'algun punt de la via de trànsit endosomal.Es va comprovar que l'acció de la variant més citotòxica era deguda a que l'addició d'un segon motiu de tres Arg en PE5 dota a aquesta proteïna amb un senyal de transport nuclear. La fracció d'enzim que aconsegueix translocar al citoplasma a partir d'algun punt de la via endosomal previ als lisosomes, és conduït ràpidament al nucli de la cèl·lula per mitjà del mecanisme clàssic de transport actiu. Per la seva afinitat amb l'rRNA, l'enzim es concentra en el nuclèol, on probablement duu a terme la seva activitat catalítica. La interacció d'aquesta variant amb els receptors nucleocitoplasmàtics, les importines, impediria per altra banda el bloqueig de l'enzim per part de l'hRI.Els resultats obtinguts presenten una nova estratègia de disseny de ribonucleases citotòxiques, basada en l'addició de segments NLS a fi de promoure el transport nuclear dels enzims. Aquesta estratègia podria permetre superar limitacions que fins al moment han estat descrites com a limitants de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, com la sensibilitat a l'hRI o la baixa eficiència d'internalització. / The main objective of this thesis is to study the molecular bases of the cytotoxicity of certain ribonucleases. With the final aim to obtain cytotoxic variants derived from human pancreatic ribonuclease. For this purpose, we created variants derived from HP-RNase by using two different strategies. In the first, variants of the enzyme that were resistant to the action of the protein inhibitor of the ribonuclease (RI) were generated, replacing residues involved in the contact interfase between the ribonuclease and RI. In the second, RGD motifs were added to the surface of the proteins involved in the formation of the RI complex, with the aim of promoting their interaction with the cell plasmatic membrane, whilst at the same time decreasing the variant's affinity for RI. We showed that only variants carrying multiple substitutions acquired the capacity to resist the RI.The study of the percentage of inhibition of protein synthesis in incubated cells using each of the variants showed that only two variants had acquired cytotoxic properties. The highest level of cytotoxicity found in a non-resistant variant to RI had a value that was only 5 and 25 times lower than those registered by Onconase®. This result shows that RI sensitivity is not a limiting factor for the cytotoxicity of the ribonuclease. None of the variants which contained RGD motifs showed any sign of toxicity, suggesting that for this reason it is not effective in giving pancreatic ribonuclease cytotoxic properties.The cytotoxic molecular bases of the most cytotoxic variant were studied. Firstly by the analysis of the internalisation of this particular variant by radioactive marking in relation to Onconase and other non-cytotoxic variants of HP-RNase, which showed that only Onconase was effectively internalised. Thus the possibility that the cytotoxic action of the enzyme under observation was a result of a more efficient endocytosis was ruled out. It was also shown that the addition of the RGD motif was unable to encourage the internalisation of the proteins more effectively. Using confocal microscopy, the human variants only began to be noted inside the cell after 24 hours incubation.All the variants that were created retained a catalytic efficiency that was never less than 50 % of the catalytic activity achieved by the parent protein PM5. This suggests that the structure within the active centre had not been affected in any serious way by the introduction of the substitutions. However a decrease in thermostabilty was noted across the board with regards to PM5. This result indicates that the correlation mentioned in the bibliography between the increase of thermostability and the increase of cytotoxicity of the ribonuclease does not always exist.Using a confocal microscope, we confirmed that both the most cytotoxic protein, such as a non-cytotoxic variant resistant to RI, and the parent protein, followed the same lysosomal pathway of degradation. This outcome was unaffected by the addition of drugs which can change retrograde transit pathways (monensine and brefeldine A), but was effected by the addition of bafilomicine A1 a drug which neutralises endosomal pH and which in this case acted by slowing down the movement of proteins to lysosomes. In accordance with these results, the cytotoxicity values of the variants were significantly increased only by the presence bafilomicine A1 suggesting that the ribonuclease translocate into the cytoplasm starting from a point somewhere along the endosomal transit pathway.We confirmed that the behaviour of the most cytotoxic variant was due to the fact that the addition of a second motif of 3 Arg in PE5 endowed the protein with a nuclear transport signal. The division of the enzyme that translocates into the cytoplasm (from somewhere along the endosomal transit path before the lysosomes) is rapidly moved towards the core of the cell via the conventional mechanism for nucleus transport. Due to its affinity for rRNA, the enzyme gathers in the nucleolus, where it probably carries out its catalytic activity. On the other hand, the interaction of this variant with nucleocytoplasmatic receptors will prevent the RI from inhibiting the enzyme.These results offer a new strategy for the design of cytotoxic ribonuclease, based on the addition of NLS motifs, with the aim of encouraging the nuclear transport of enzymes. This strategy could allow one to overcome limitations that up until now have been the down-side to the cytotoxicity of pancreatic ribonuclease, such as a sensitivity for RI or the limited efficiency of internalisation.