S'han estudiat els efectes de dos fàrmacs intercalants al DNA, Daunorubicina (usat com antitumoral) i Criptolepina (amb elevada citotoxicitat i usat com antimalàric), en el llevat "S.cerevisiae".Ambdues molècules s'uneixen al DNA però amb diferent preferència de seqüència: mentre que la Daunorubicina reconeix preferentment regions 5'(A/T)CG3', la Criptolepina s'uneix a 5'GG3'. S'han descrit nombroses regions reguladores riques en aquest tipu de seqüències, pel que ambdós fàrmacs podrien competir amb factors de transcripció nuclears, modificant l'expressió gènica.Els principals objectius del nostre estudi foren:1.Determinar l'efecte citotòxic dels dos fàrmacs en diferents soques de S.cerevisiae: BY4741, BY4741-delta-erg6 (soca amb major permeabilitat de la membrana plasmàtica als fàrmacs), BY4741-delta-rad52 (soca amb un gen de la maquinària de reparació delecionat):- En primer lloc, s'analitzaren els efectes sobre el creixement cel·lular de les soques tractades amb diferents concentracions de cada molècula, tant amb glucosa com galactosa com a fonts de carboni. Els nostres resultats. Els nostres resultats demostren que la permeabilitat de la membrana és necessària per aconseguir la concentració de Daunorubicina que desencadena el seu efecte citotòxic. En canvi, la maquinària de reparació del dany al DNA pot ser una diana potencial de la Criptolepina.- Mitjançant una anàlisi semiquantitativa de l'expressió d'alguns dels principals gens del metabolisme de la galactosa, es va observar un efecte diferencial dels fàrmacs, ja que el factor regulador dels gens de la galactosa presenta en la seva seqüència consens, la diana per a la Daunorubicina i no per a la Criptolepina. Aquest solapament de seqüència explica el patró repressor induït per la Daunorubicina, però no per a la Criptolepina, resultat que està d'acord amb el major efecte citotòxic de la Daunorubicina en cèl·lules crescudes en galactosa.2.Avaluar la resposta transcripcional a nivell global de cada intercalant en la soca BY4741-delta-erg6, utilitzant la glucosa com a font de carboni.- Mitjançant l'ús de microarrays, es va identificar els perfils d'expressió gènica diferencial per a cadascun dels tractaments (Daunorubicina o Criptolepina), en funció de la concentració i del temps. A partir d'aquests experiments es va confirmar que l'efecte de la Daunorubicina sobre la transcripció és pronunciat, mentre que els canvis observats per a la criptolepina són lleus.- A partir dels resultats obtinguts, es van classificar els gens en diferents categories funcionals i es varen validar els resultats obtinguts per RT-PCR a temps real. Es va observar que tot i que la Daunorubicina reprimeix l'expressió dels gens glicolítics, la criptolepina està associada principalment a la inducció dels gens de resposta a estrès. D'una manera menys significativa, la Criptolepina altera també la transcripció de gens implicats en el transport del ferro i de gens mitocondrials.- Mitjançant un estudi in silico, es va confirmar que les variacions en els perfils d'expressió gènica es deuen a un efecte directe dels fàrmacs sobre els factors de transcripció que regulen aquests gens, degut a que competeixen per les mateixes dianes d'unió al DNA.A partir de la identificació dels mecanismes d'acció de cada fàrmac en S.cerevisiae, els nostres resultats plantegen noves vies en el disseny de nous fàrmacs antitumorals i antiparasitaris. / The main objective of this thesis is to analyse the effects of two DNA interacting drugs, Daunorubicin (used as antitumoral) and Cryptolepine (with elevated cytotoxicity and used as an antimalarian) in Saccharomyces cerevisiae. Both drugs intercalate in CG rich regions, the preferent sequence for Daunorubicin being 5'(A/T)CG3' and for Cryptolepine being 5'GG3'. These sites are common in consensus sequences of transcription factors and the competition of drugs for those sites can alter gene expresion.First, we evaluated the effects in cellular proliferation in yeast strains of different genetic backgrounds (related to membrane permeability and DNA lesion repair), in glucose and galactose as carbon source. We observed that permeability of plasma membrane is necessary in order to reach a citotoxic concentration of Daunorubicin. On the other hand, the DNA repair machinery seems to be a potential target of Cryptolepine. By a semiquantitative analysis of expression of GAL genes, we observed a differential effect of both drugs. Daunorubicin caused a decrease in GAL genes expression while Cryptolepine did not. This can be due to the fact that the main regulatory protein of galactose metabolism has the preferent binding site for Daunorubicin in the consensus sequences.The effect of Daunorubicin and Cryptolepine on yeast transcriptome was studied in the most permeable yeast strain using glucose as carbon source. Using microarrays, we identified different gene expression patterns for each drug. Genome wide results were grouped into functional categories and confirmed by real time RT-PCR. We observed that Daunorubicin downregulates glycolytic genes and Cryptolepine induces a stress response and decreases the transcriptional levels of specific genes related to iron transport (siderophores) and mitochondrial genes. We used in silico assays to correlate the expression patterns induced by both drugs with a direct effect in the regulatory proteins involved in the transcription of these genes. Results confirm different action mechanisms for each intercalating drug tested. Daunorubicin may alter the regulatory complex Gcr1p-Gcr2p responsible of upregulation of glycolytic genes, and Cryptolepine may induce a pleiotropic effect.Overall, these results can raise new approaches in the development of new antitumour and antiparasit drugs.

Submitted by Juliana Tregnago (julianatregnago@gmail.com) on 2018-06-25T15:23:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) EFETIVIDADE DA ELIPTICINA E ARTEMISININA-atual.pdf: 1595775 bytes, checksum: b76659782dbf4751e7f12e9f356c42fe (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-06-26T13:39:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) EFETIVIDADE DA ELIPTICINA E ARTEMISININA-atual.pdf: 1595775 bytes, checksum: b76659782dbf4751e7f12e9f356c42fe (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-06-26T14:11:28Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) EFETIVIDADE DA ELIPTICINA E ARTEMISININA-atual.pdf: 1595775 bytes, checksum: b76659782dbf4751e7f12e9f356c42fe (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-26T14:11:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) EFETIVIDADE DA ELIPTICINA E ARTEMISININA-atual.pdf: 1595775 bytes, checksum: b76659782dbf4751e7f12e9f356c42fe (MD5) Previous issue date: 2018-02-27 / Parasite resistance to commercially available antimalarial drugs is a reality, which makes it possible to search for new drugs and to develop researches with plants that have pharmacological properties. Numerous discussions on rapidlyreleasing antimalarial drugs have been gaining strength and adherence, as it has advantages related to its efficacy, specificity and patient tolerance in therapy. In this way, nanotechnology offers important tools for the development of new drugs and nanoparticles can contribute to a more specific therapy of selective action in the distribution and absorption of drugs. According to the Amazonian biodiversity, the active principle, ellipticina involved in research as antimalarial was isolated from Aspidosperma vargasii, whose popular name is Amarelão or Carapanaúba branca. Ellipticin exhibits antiplasmodial activity that has been demonstrated in in vitro test because it inhibited the growth of heme crystal that occurs in the digestive vacuole of Plasmodium ssp. and is associated with parasite growth. Another active principle, which is extracted from Artemisia annua L. is artemisinin. It is considered essential in the treatment of malaria, by its potency and its rapid action. Interventions of artemisinin-based combination therapy have reduced morbidity and mortality associated with malaria in several parts of the world. The combinations of artemeter-lumifantrine, artesunate-mefloquine and artesunateamodiaquine, are related to artoisinin's gametocytocidal properties that inhibit the transmission of parasites to probably reduce the development of antimalarial resistance. Recent studies show that artesunate may be a good alternative for the treatment of some types of cancer by the antiangiogenic mechanism. Its low toxicity represents a promising chemotherapeutic. It is important to note that artesunate is not carried by P-glycoproteins, so it is not involved in multidrug resistance. In the fight against these pathologies, several inconveniences are pointed out for the patient as some adverse effects and dosing schedule. Thus, it considers that the evaluation of new drug release systems can improve the therapeutic efficacy of future nanoformulations for antimalarial and antitumor drugs. In this sense, this work aims to develop, characterize and evaluate nanoparticles in their physico-chemical and cytotoxic aspect by means of bioassays against Plasmodium falciparum and antitumor cells. The substances used in the synthesis of the nanospheres were sodium tetrachloropalladium and ellipticine hydrochloride. The substances involved in the synthesis of nanofibers were artemisinin hydrochloride, polyvinylpyrrolidone and polybutylene. / A resistência parasitária aos fármacos antimaláricos comercialmente disponível é uma realidade, o que possibilita a busca por novas drogas e o desenvolvimento de pesquisas com plantas que possuem propriedades farmacológicas. As inúmeras discussões sobre as drogas antimaláricas de liberação rápida, vem ganhando força e adesão, pois apresenta vantagens relacionadas a sua eficácia, especificidade e tolerância por parte do paciente na terapia. Desta forma, a nanotecnologia oferece ferramentas importantes para o desenvolvimento de novos fármacos e as nanopartículas podem contribuir para uma terapia mais específica de ação seletiva na distribuição e absorção das drogas. De acordo com a biodiversidade Amazônica, o príncipio ativo, elipticina envolvida em pesquisas como antimalárico foi isolado da Aspidosperma vargasii, cujo nome popular é Amarelão ou Carapanaúba branca. A elipticina apresenta atividade antiplasmodial que foi demonstrado em teste in vitro, pois inibiu o crescimento do cristal de heme que ocorre no vacúolo digestivo do Plasmodium ssp. e está associado ao crescimento do parasito. Outro princípio ativo, que é extraído da Artemisia annua L. é a artemisinina. É considerada fundamental no tratamento da malária, por sua potência e sua rápida ação. As intervenções da terapia combinada baseada em artemisinina, diminuíram a morbidade e a mortalidade associadas a malária em várias partes do mundo. As combinações de artemeter-lumifantrine, artesunato-mefloquina e artesunato-amodiaquina, está relacionado a propriedades gametocitócidas da artemisinina que inibe a transmissão de parasitas para provavelmente reduzir o desenvolvimento de resistência antipalúdica. Recentes estudos mostram que o artesunato pode ser uma boa alternativa para o tratamento de alguns tipos de câncer, pelo mecanismo antiangiogênico. A sua baixa toxicidade representa um quimioterápico promissor. É importante salientar que o artesunato não é transportado por P-glicoproteínas, portanto não está envolvido em resistência a multidrogas. Na luta contra essas patologias, são apontados vários inconvenientes para o paciente como alguns efeitos adversos e horário de dosagens. Assim, considera que a avaliação de novos sistemas de liberação de medicamentos podem melhorar a eficácia terapêutica de futuras nanoformulações para fármacos antimaláricos e antitumorais. Neste sentido, este trabalho tem por objetivo desenvolver, caracterizar e avaliar as nanopartículas no seu aspecto físico-químico e citotóxico por meio de bioensaios contra Plasmodium falciparum e células antitumorais. As substâncias utilizadas na síntese das nanoesferas foram sódio tetracloropaládio e cloridrato de elipticina. As substâncias envolvidas na síntese das nanofibras foram o cloridrato de artemisinina, polyvinilpirrolidona e polibutileno.

La medicina personalitzada i les teràpies dirigides són, avui dia, estratègies emergents en les companyies farmacèutiques. L’objectiu global, a llarg termini, és desenvolupar tractaments dirigits cap a mecanismes moleculars desregulats únicament en les cèl•lules afectades, reduint així els problemes de toxicitat d’aquests compostos. Aquest procés és llarg i costós però la introducció de les tècniques de disseny racional de fàrmacs ha permès reduir de manera considerable el temps d’identificació de molècules actives, agilitzant així les etapes inicials. Les teràpies antitumorals dirigides a promoure l’apoptosi i/o a controlar el procés de proliferació cel•lular es troben avui dia en ple desenvolupament. A més, les oportunitats d’intervenció terapèutiques en aquesta línia s’incrementen a mesura que augmenta el coneixement de les proteïnes involucrades en aquests processos. Avui dia els principals problemes dels compostos identificats radiquen però en la seva selectivitat i el gran nombre d’efectes secundaris que presenten, pel que el disseny del molècules selectives és un camp de recerca molt actiu. El present projecte es basa en la cerca de nous fàrmacs anticancerígens mitjançant la modelització molecular. D’una banda es tracta d’identificar inhibidors per a les proteïnes de la família Bcl-2 per a restablir els nivells normals d’apoptosi i, de l’altra, per a les proteïnes CDK4 i CDK6, importants reguladores del cicle cel•lular. L’objectiu plantejat a llarg termini en aquesta tesi és identificar compostos actius amb potència i selectivitat cap a aquestes proteïnes per tal de convertir-los en caps de sèrie que finalment puguin arribar a ser fàrmacs comercials. La utilització de compostos mimètics del domini BH3 per inhibir la funció dels membres antiapoptòtics de la família Bcl-2 és una de les estratègies més emprades per al control de l’apoptosi. En aquest marc, en funció de la selectivitat que presenten envers els pèptids BH3, podem trobar dues subfamílies de proteïnes antiapoptòtiques: Bcl-2, Bcl-xL i Bcl-w d’una banda i Mcl-1 i A-1 de l’altra. Diferents estudis suggereixen que per a produir la mort cel•lular és necessari intervenir al menys un membre de cadascuna de les subfamílies. Per tant, sota aquesta premissa, es van analitzar les interaccions establertes entre les proteïnes antiapoptòtiques i dominis BH3 tant pel cas de pèptids que s’uneixen amb igual afinitat a tota la família, com per a pèptids selectius de cadascun dels subgrups. Nombrosos estudis apunten a que la helicitat en els pèptids mimètics dels domini BH3 incrementa notablement l’afinitat d’enllaç. Sota aquesta premissa s’ha tractat de dissenyar pèptids derivats de la proteïna proapoptòtica Bak substituint alguns dels residus prescindibles per l’aminoàcid no natural Aib, inductor de conformacions helicoïdals. Actualment tots els inhibidors coneguts per a les CDKs, actuen sobre el lloc d’unió de l’ATP. Donat que existeix una gran quantitat de dades experimentals sobre aquests compostos es va decidir avaluar diferents algoritmes de docking i predicció d’afinitats experimentals amb cinc inhibidors coneguts de CDK6. Finalment, s’ha proposat també un desenvolupament metodològic que enfoca el problema del disseny de fàrmacs des d’una perspectiva més amplia: la quimiogenòmica. Amb la seqüenciació del genoma humà s’ha pres consciència de que resulta inviable avaluar el gran número de compostos químics coneguts actualment sobre totes les possibles dianes terapèutiques identificades en el genoma humà. Per aquest motiu és imprescindible desenvolupar mètodes teòrics més senzills per a la caracterització i comparació de molècules que permetin predir la seva activitat biològica. Així doncs, amb la realització d’aquesta tesi, queda patent que l’aplicació de mètodes teòrics pot contribuir de manera eficient al disseny de fàrmacs. D’aquesta manera es possible reduir el cost i temps necessari per al descobriment de compostos actius. / Nowadays, personalized medicine and directed therapies have emerged as appealing strategies for pharmaceutical companies. The long-term goal is developing new treatments to target molecular pathways altered only in affected cells, thus reducing undesired side effects and toxicity problems. This is a tedious and long process although the incorporation in its framework of rational drug design techniques has reduced the time needed to identify new active molecules. The knowledge of molecular mechanisms involved in a given pathology allows finding a point of the process that can be targeted, usually a protein, restoring the normal cell behavior. Once identified the therapeutic target it is possible to find compounds that reproduce interactions between this protein and the corresponding natural regulations by means of molecular modeling techniques. In principle, these compounds are expected to mimic the biological effect of the natural regulators. Antitumoral therapies oriented to promote apopotosis or control the cell proliferation process are gaining importance nowadays. In addition, opportunities for therapeutic intervention in this context are growing with the discovery of new proteins involved in these pathways. In fact, the drawback of compounds known at date relies on selectivity problems and, thus, the huge number of undesired side effects of these treatments. Hence, development of selective treatments is a very active research field. The goal of the present PhD project is to identify new anticancer agents using molecular modeling techniques. On the one hand, it has been tried to identify inhibitors of the Bcl-2 protein family in order to restore normal apoptosis levels in tumoral cells and, on the other hand, for the CDK4 and CDK6 proteins, key regulators of eukaryotic cell cycle. All these proteins are deregulated in many types of cancer and thus, are presented as interesting targets for the cancer treatment. The identification of compounds with potency and selectivity for these proteins that can be used as lead compounds that finally will become commercial drugs is seeked.