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Développements de microscopies optiques pour l’imagerie super-résolue de nanocristaux de diamant fluorescents comme rapporteurs d’anomalies fonctionnelles du neurone / Development of optical microscopes for super resolution imaging of fluorescent diamond nanocrystals as probes of functional anomalies of neuronsAdam, Marie-Pierre 28 October 2013 (has links)
Les microscopies optiques super-résolues aident à mieux comprendre certains mécanismes biomoléculaires, notamment au sein des neurones. Nous avons construit un tel microscope de type STED (STimulated Emission Depletion) pour observer des défauts azote-lacune (NV) fluorescents dans le diamant, et avons atteint une résolution de 50 nm. À plus long terme, cet instrument permettra d’étudier l’organisation macromoléculaire de protéines impliquées dans la plasticité synaptique, et marquées avec des nanodiamants (ND) fluorescents. Dans cette perspective, nous avons étudié la limite de résolution du STED pour des ND de tailles sub-longueur d’onde. Nos expériences, menées avec l’équipe de Stefan Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) ont montré que la taille du spot STED d’un NV dans un ND pouvait atteindre 10 nm, performance similaire à celle obtenue dans un diamant macroscopique. Nous pouvons aussi résoudre plusieurs centres NV dans un ND séparés de seulement ~15 nm. Ces résultats sont en accord avec les simulations numériques faites par l’équipe de Jean-Jacques Greffet (Laboratoire Charles Fabry). En parallèle, nous avons démontré l’internalisation spontanée de ND fluorescents dans des neurones corticaux d’embryons de souris en culture primaire, et étudié leur colocalisation avec des vésicules du réseau trans-Golgi. Enfin, nous avons débuté l’étude du trafic des vésicules contenant les ND et montré qu’il dépend du réseau de microtubules. Les paramètres du mouvement sont compatibles avec ceux des moteurs moléculaires, mais nous nous attendons à ce qu’ils soient différents dans le cas de la surexpression de protéines impliquées dans le trafic (travail en cours). / Super resolution microscopy techniques are a useful tool to understand some biomolecular mechanisms, particularly in neurons. We have built such a STED (STimulated Emission Depletion) microscope for observing Nitrogen-Vacancy (NV) fluorescent defect in diamond, and have reached a resolution of 50 nm. In the longer term, this instrument will study the macromolecular organization of proteins involved in synaptic plasticity and marked with fluorescent nanodiamonds (ND). In this context, we studied the resolution limit of STED for ND of subwavelength size. Our experiments, conducted with the team of Stefan Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) showed that the STED spot size of an NV in ND could reach 10 nm, which is similar to performances obtained in a macroscopic diamond. We can also resolve several NV centers, which are separated from only ~15 nm in the same ND. These results are in agreement with numerical simulations carried out by the team of Jean-Jacques Greffet (Laboratoire Charles Fabry). In parallel, we have demonstrated the spontaneous internalization of fluorescent ND in primary culture of cortical neurons from mouse embryos, and studied their colocalization with vesicles of the trans-Golgi network. Finally, we started the study of trafficking vesicles containing ND and showed that it depends on the microtubule network. The motion parameters are compatible with those of molecular motors, but we expect them to be different in the case of overexpression of proteins involved in traffic (work in progress).
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Development and application of quantitative imaging to study cerebral blood flow in a mouse model of obesity / Développement et application de l'imagerie quantitative du débit sanguin cérébral pour l'étude de modèles de l'obésitéSoleimanzad, Haleh 19 December 2018 (has links)
Selon l’organisation mondiale de la santé, dans les pays en développement, la proportion de personnes obèses a presque triplé depuis 1980 et presque doublé dans les pays à revenu élevé. Parmi ces statistiques, en France, 16,8% des hommes et 17,4% des femmes sont obèses. Les taux mondiaux d'obésité devraient monter au cours de la prochaine décennie pour atteindre un cinquième des adultes en 2025. L'obésité est due à de multiples facteurs, dont la consommation excessive d’aliments riches en gras et en sucres, ainsi que des facteurs génétiques, psychosociaux et environnementaux. L'incidence de maladies telles que le cancer, le diabète et les maladies cardiovasculaires est supérieure chez les personnes obèses. L’obésité a également un impact néfaste sur le fonctionnement du cerveau, ce qui entraîne davantage d’accidents vasculaires cérébraux et des maladies neurodégénératives chez les personnes obèses. Une activité cérébrale normale impose des besoins énergétiques dynamiques qui sont satisfaits par le flux sanguin cérébral (Cerebral Blood Flow, CBF). La perfusion adéquate des tissus cérébraux au bon moment et au bon endroit parmi les quelques 160 milliards de cellules qui composent le cerveau adulte humain est vital. Malgré des données obtenues sur des tranches de cerveau concernant les problèmes de barrière hémato-encéphalique chez les personnes obèses, le devenir du CBF au cours de l'obésité n'a pas encore été étudié. Une des raisons à cela est la difficulté à enregistrer le CBF in vivo et de le suivre dans le temps, pendant une activation cérébrale et sur une large échelle avec une résolution spatio-temporelle appropriée. Afin d'évaluer l'influence de l'obésité sur le CBF, au repos et pendant la stimulation sensorielle, nous avons développé une technique optique appelée l'imagerie de contraste laser par exposition multiple (MESI). La technique repose sur le calcul du contraste de speckle, qui est lié à la vitesse des diffuseurs (globules rouges). Il permet une imagerie superficielle à large champ des variations relatives de flux sanguin dans le cortex de la souris. Nous avons caractérisé les performances du système en utilisant des fantômes microfluidiques. L’acquisition du contraste pour différentes durées d’exposition permet de discriminer les diffuseurs statiques et dynamiques (en mouvement) et donc d’obtenir une image quantitative des variations du CBF. Nous avons étudié l'activation cérébrale en utilisant la stimulation olfactive par des flux d'odeurs contrôlés présentés à la souris anesthésiée. Le bulbe olfactif est une structure sensorielle essentielle des mammifères pour le codage des odeurs et il est bien adapté à l'imagerie optique car l’activité neuronale et vasculaire est détectée dans les régions superficielles de cette structure. Nous avons observé une diminution significative du CBF évoqué par stimulation odorante chez les souris obèses (sous régime hyperlipidique) par rapport aux souris témoins (sous régime standard). Chez les souris contrôles, les variations de CBF sont élevées dans les vaisseaux sanguins de grand diamètre et diminuent dans les vaisseaux sanguins de petit calibre. Cette variation dépendant du diamètre est perdue chez les souris obèses qui présentent même un CBF significativement réduit au repos, au cours d'une activité vasculaire spontanée. De plus, afin de mieux comprendre la morphologie du système vasculaire, nous avons commencé l’étude par iDISCO de la densité et la distribution des vaisseaux dans l’ensemble du cerveau in vitro chez des souris obèses comparées aux contrôles. En conclusion, les résultats obtenus sur le CBF chez les souris obèses par la mise au point d’une technique d’imagerie optique à large champ MESI, indiquent que l'obésité impacte le fonctionnement vasculaire en dérégulant le débit sanguin cérébral. / Obesity is a global health threat. Since 1980 the proportion of obese or overweight individuals tripled in developing countries and doubled in high-income countries. In France 16.8% of men and 17.4% of women are obese. In the actual tendency persists, one-fifth of adults worldwide will be obese by 2025. Obesity is characterized by exaggerated weight gain and accumulation of fat tissue and is due to multiple factors including excessive consumption of high fat-sweet food and genetic, psychosocial and environmental factors. It is linked to an increase in the incidence of diseases such as cancer, diabetes and cardiovascular disease. Obesity has also a detrimental impact on brain function leading to higher rate of stroke and neurodegenerative diseases. Normal brain activity imposes dynamic energy requirements. Energy needs are fulfilled by Cerebral Blood Flow (CBF) to perfuse the brain tissue at the right time and the right place among the hundred of billons of cells that compose the human adult brain. Although dysfunction of the blood brain barrier was observed in brain slices, the fate of CBF during obesity in vivo is unknown. One reason for this is the difficulty to record CBF over time in vivo and to follow the time course of activation of large populations of cells with an appropriate spatiotemporal resolution. In order to evaluate the influence of obesity on CBF, at rest and during sensory stimulation, we have developed an optical technique termed multi-exposure speckle contrast imaging (MESI). In the last years, MESI has been validated for imaging relative changes in CBF at the surface of the rodent brain in vivo, the standard mammalian model for brain studies. The technique relies on the calculation of the spatial speckle contrast, which is related to the velocity of scatterers (red blood cells), and allows wide-field imaging of CBF at the mesoscopic level. We have characterized the performances of the system using microfluidic phantoms. We further demonstrated the ability of our MESI system to discriminate the moving and static diffusers contribution and therefore to provide accurate estimate of CBF changes in vivo. The olfactory bulb is a major hub for the processing of olfactory information in the brain of all mammals. It is well suited for optical imaging of brain activation since neuronal and vascular activities are detected very superficial at the surface of this structure. Using MESI, we have studied brain activation in control and obese mice. We have performed olfactory activation by delivering controlled odorants fluxes to anesthetized mice. We observed a significant decrease in odor-evoked CBF with a loss of diameter-dependent regulation of CBF in obese mice (high fat diet) compared to control lean mice (standard diet). We showed that CBF regulation was lost in obese mice even at rest without any stimulation. Furthermore, to gain insights into the morphology of the vascular network, we started the study of the vessels density and distribution in the entire brain using an in vitro iDISCO approach in obese mice compared to control mice. Overall, these findings indicate that obesity can adversely affect CBF at rest and in response to neuronal activation in vivo.
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