Les particules issues de la pollution sont responsables de millions de morts prématurées. Les nanoparticules (au diamètre inférieur à 100 nm) atteignent les alvéoles où elles rencontrent la barrière alvéolo-capillaire. Cette barrière est composée d'un épithélium alvéolaire et d'un endothélium, dos à dos contre une membrane ultrafine (environ 0.2 µM), soumis à une stimulation constante exercée par l'inflation cyclique des alvéoles et par le cisaillement dû à la circulation sanguine. Nous nous sommes appliqués à développer un modèle in vitro innovant de cette barrière alvéolo-capillaire afin d'observer les interactions des nanoparticules avec cette barrière. Dans un premier temps, nous avons développé un substrat micro-fabriqué qui reproduit les propriétés géométriques et physiques de la membrane alvéolo-capillaire. Sur cette membrane, nous avons mis en place une co-culture de cellules épithéliales alvéolaires (A549) et endothéliales (HUVEC). Grâce à une étude de microscopie confocale, nous avons observé le comportement de ce modèle en termes d'étanchéité et de fonctions biologiques. Finalement nous avons observé les interactions entre des nanoparticules de silice et notre modèle en termes de toxicité, d'internalisation et de translocation. Dans une seconde partie, nous avons développé une puce microfluidique à deux chambres qui permet de reproduire autour de notre modèle de co-culture le microenvironnement spécifique des alvéoles pulmonaires. Des études de conception mécanique et l'optimisation de méthodes de microfabrication nous ont permis de générer une puce réversible compatible avec de la culture à long-terme et de l'observation en live par microscopie confocale. Dans une troisième partie, nous avons commencé un travail préliminaire visant à intégrer des cellules pluripotentes induites différenciées dans notre modèle in vitro. Nous avons travaillé à optimiser deux protocoles de différentiation sur une lignée commerciale: vers un endothélium et vers un épithélium alvéolaire. Finalement, nous proposons ici un modèle in vitro offrant de nombreux avantages: une importante communication intercellulaire via leur co-culture sur une membrane ultrafine, une culture long-terme observable au quotidien, la reproduction des stimuli dynamiques de l'environnement alvéolo-capillaire in vivo et la possibilité d'effectuer des tests d'interaction et de translocation de nanoparticules. / Pollutions particles are responsible for millions of premature death. Nanoparticles (with a diameter below 100 nm) reach the alveolar sacs where they encounter the alveolar capillary barrier. This barrier is constituted of an alveolar epithelium and an endothelium back to back on an ultra-thin membrane (about 0.2 µm), submitted to constant stimuli due to cyclic alveolar inflation and blood flow shear stress. We focused here on developing an innovative in vitro model of the alveolar capillary barrier to study the interactions of the nanoparticles with this barrier. Firstly, we have developed a micro-engineered substrate reproducing the geometrical and physical properties of the alveolar capillary membrane. We implemented the co-culture of an alveolar epithelium (A549) and an endothelium (HUVEC) on this membrane. We used confocal microscopy to observe the behavior of our model regarding barrier integrity and specific phenotypes. Finally, we observed the interactions between Silica nanoparticles and our model in terms of toxicity, internalization and translocation. Secondly, we developed a two-chamber microfluidic chip reproducing the specific microenvironment of the alveoli around our co-culture model. Studies of mechanical design and fabrication processes optimization allowed for the generation of a reversible chip compatible with long-term culture and live observation with a confocal microscope. Thirdly, we launched preliminary experiments aiming at the integration of differentiated induced pluripotent stem cells in our in vitro model. We worked on optimizing two directed differentiation protocols: towards an endothelium and towards an alveolar epithelium.Finally, we present here an in vitro model with numerous features: a close-contact co-culture on an ultra-thin membrane enabling important intercellular communication, a long-term culture allowing for live monitoring, mimicking the in vivo dynamic stimuli of the alveolar capillary barrier microenvironment and the possibility for nanoparticles interaction and translocation studies.

Les matériaux à structure tridimensionnelle laissent entrevoir de nombreuses applications prometteuses dans le domaine de l'ingénierie tissulaire et de la médecine régénérative en fournissant un micro-environnement approprié pour l'incorporation de cellules ou de facteurs de croissance afin de régénérer des tissus ou organes endommagés. Dans ce contexte, une membrane a été élaborée à partir d'un mélange de poly (ε-caprolactone) PCL / chitosan CHT à partir d'une technique d'inversion de phase permettant un apport localisé de non solvent. La technique permet d'obtenir une double morphologie poreuse : (i) des macrovides en surface (gros pores) facilement accessibles pour l'invasion et la viabilité des cellules; (ii) un réseau macroporeux interconnecté (petits pores) pour transférer les nutriments, l'oxygène, le facteur de croissance à travers le matériau. Les propriétés physico-chimiques (taille des pores, chimie de surface et biodégradabilité) des matériaux ont été caractérisées. Il est montré comment il est possible d'ajuster les propriétés de la membrane en modifiant le rapport PCL / CHT. Des cultures de cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) ont été réalisées sur la membrane. La viabilité et la prolifération cellulaires ont été étudiées par des essais de test au MTT et de taux d'absorption d'oxygène. Les expériences démontrent que la membrane est biocompatible et peut être colonisée par les cellules. La microscopie confocale montre que les cellules sont capables de pénétrer à l'intérieur des macrovides de la membrane. La prolifération cellulaire de CSM dans ce matériau pourrait être utile pour augmenter la longévité d'autres cellules primaires en modifiant les CSM pour produire des facteurs de croissance. Pour tester le comportement dynamique des cellules sur la membrane, un dispositif d'organe sur puce a été développé avec des cellules endothéliales ombilicales humaines ensemencées sur la membrane. Les résistances hydrauliques de la barrière cellulaire sur la membrane ont été quantifiées en temps réel pour une pression trans-endothéliale (PTE), 20 cm H2O à 37 ° C et avec des cellules vivantes après 1 jour et 3 jours après l'ensemencement. Les résultats suggèrent que ce type d'échafaudages polymères peut être utile à l'avenir comme patch in vivo pour réparer des vaisseaux endommagés. / Over the last decades, three-dimensional (3D) scaffolds are unfolding many promising applications in tissue engineering and regenerative medicine field by providing suitable microenvironment for the incorporation of cells or growth factors to regenerate damaged tissues or organs. The three-dimensional polymeric porous scaffolds with higher porosities having homogeneous interconnected pore network are highly useful for tissue engineering. In this context, a poly (ε- caprolactone) PCL/chitosan CHT blend membrane with a double porous morphology was developed by modified liquid induced phase inversion technique. The membrane shows: (i) surface macrovoids (big pores) which could be easily accessible for cells invasion and viability; (ii) interconnected microporous (small pores) network to transfer essential nutrients, oxygen, growth factors between the macrovoids and throughout the scaffolds. The physico-chemical properties (pore size, surface chemistry and biodegradability) of the materials have been characterized. This study shows how it is possible to tune the membrane properties by changing the PCL/CHT ratio. Human mesenchymal stem cell (hMSCs) culture was performed on the membranes and the cell viability and proliferation was investigated by MTT assay and oxygen uptake rate experiments. The experiments demonstrate that the membranes are biocompatible and can be colonized by the cells at micron scale. Confocal microscopy images show that the cells are able to adhere and penetrate inside the macrovoids of the membranes. Both cell proliferation and oxygen uptake increase with time especially on membranes with lower chitosan concentration. The presence of chitosan in the blend produces an increase of porosity that affect the entrapment of the cells inside the porous bulk of the membranes. Successful cellular proliferation of hMSCs could be useful to enhance longevity of other primary cells by production of corresponding growth factors. To test the dynamic behavior of cells on the membranes, an organ-on-chip (OOC) device has been developed with human umbilical endothelial cells (HUVECs) seeded on the membrane. The hydraulic resistance of the cellular barrier on the membrane has been quantified for real time trans-endothelial pressure (TEP) 20 cmH2O at 37 degree C and with living cells after 1 day and 3 day of post seeding. Results suggests this kind of polymeric scaffolds can be useful in future as an in vivo patch to repair disrupted vessels.