Die organischen Kationentransporter der SLC22-Familie spielen eine Schlüsselrolle bei der Aufnahme, Ausscheidung und Verteilung vieler kationischer Medikamente und endogener Substanzen. Der erste klonierte organische Kationentransporter rOCT1 (OCT1 aus der Ratte) wurde bisher eingehend funktionell charakterisiert. rOCT1 ist elektrogen, transportiert organische Kationen unterschiedlicher Struktur wie z.B. Cholin, Tetraethylammonium (TEA) oder das Neurotoxin 1 Methyl-4-Phenylpyridinium (MPP) und wird durch verschiedene Substanzen wie beispielsweise Tetrabutylammonium (TBuA) inhibiert. Für die Entwicklung und Optimierung von Medikamenten ist ein besseres Verständnis der strukturellen Grundlage der polyspezifischen Substraterkennung und des Transportprozesses von entscheidender Bedeutung. Durch modellgestützte Mutagenese konnte für rOCT1 ein großer Spalt identifiziert werden, der von acht Transmembranhelices (TMHs) geformt wird und die putative Substratbindungstasche mit überlappenden Bindungsdomänen beinhaltet. Mittels der „Voltage-Clamp-Fluorometrie“ können Konformationsänderungen von rOCT1 während des Transportzyklus sichtbar gemacht werden. Unter Verwendung dieser Methode wurden spannungsabhängige Fluoreszenzänderungen in den Positionen 260, 380 und 483 der TMHs 5, 8 und 11 nachgewiesen. Interaktionen mit den Substraten Cholin und MPP sowie dem nicht transportierten Inhibitor TBuA von außen wirkten sich unterschiedlich auf die Bewegungen in den drei Positionen aus. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass rOCT1 spannungsabhängige Konformationen einnimmt, bei deren Änderungen sich mindestens drei Transmembrandomänen (TMH 5, TMH 8 und TMH 11) bewegen und dass in Gegenwart von organischen Kationen die Spannungsabhängigkeit der Transporterkonformation beeinflusst wird. Des Weiteren wurde eine kritische Position innerhalb oder nahe der Substratbindungstasche von rOCT1 identifiziert, mit deren Hilfe der Transportweg irreversibel blockiert werden kann. In Position 478 wurde das Glycin durch ein Cystein ersetzt, das mittels des SH Gruppenreagenzes [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonat Bromid (MTSET) kovalent modifiziert werden konnte. Diese Modifikation bewirkte eine starke Hemmung des Transports verschiedener Substrate wie z.B. Cholin, TEA oder MPP. Anhand von Bindungsstudien konnte gezeigt werden, dass die Bindung von MPP durch die MTSET Modifizierung in der nach außen gerichteten Konformation verhindert wurde. Die Einführung des Cysteins in Position 478 erhöhte die Affinität von TBuA und beeinflusste außerdem die substrat- und spannungsabhängigen Konformationsänderungen. Hierbei zeigte sich, dass in zwei der drei Positionen (260 und 483) die Fluoreszenzantwort des leeren Transporters verändert wurde. Neben den Fluoreszenzen im Gleichgewichtszustand wurden auch die Zeitkonstanten der Fluoreszenzantworten durch die Position 478 beeinflusst. Durch die Einführung eines Serins oder Threonins in diese Position konnten die Effekte des Cysteins 478 in Position 483 nachgeahmt werden. Die Blockierung des Transportwegs durch MTSET veränderte die Bewegungen des leeren Transporters in Position 260 und 483 kaum, während in Position 380 eine deutliche Reduktion der Fluoreszenzantwort gemessen wurde. Auch die substratabhängigen Fluoreszenzänderungen wurden in der Position 483 deutlich reduziert. Insgesamt weisen diese Daten darauf hin, dass rOCT1 Konformationsänderungen durchläuft, die spannungs- und substratabhängig sind und durch die Position 478 beeinflusst werden. / Organic cation transporters of the SLC22-family play a pivotal role in the absorption, elimination and distribution of many cationic drugs and endogenous compounds. The first cloned organic cation transporter rOCT1 (rat OCT1) was extensively characterized. rOCT1 is electrogenic and transports a variety of organic cations with very different structures e.g. choline, tetraethylammonium (TEA) and the neurotoxin 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP). In addition rOCT1 is inhibited by various compounds such as tetrabutylammonium (TBuA). For the development and optimization of drugs it is fundamental to understand the structural basics of polyspecific substrate binding and of the transport process. By using model-based mutagenesis, a large cleft of rOCT1 was identified, which is formed by eight transmembrane helices (TMH) and contains the putative substrate binding pocket with overlapping binding domains. Conformational changes of rOCT1 during the transport cycle can be identified by using the “voltage-clamp-fluorometry” technique. Employing this method, potential-dependent fluorescence changes were identified in the positions 260, 380 and 483 in the TMHs 5, 8 and 11. Interactions of the substrates choline and MPP as well as the non-transported inhibitor TBuA acting from the outside, had an individual influence on the movements at these three positions. The results demonstrate that rOCT1 adopts different potential-dependent conformations and that at least three different transmembrane domains (TMH 5, TMH 8 and TMH 11) move during the conformational changes. Additionally, the results suggest that the potential-dependence of the transporter’s conformations is influenced by the presence of organic cations. Furthermore, a critical position was identified within or close to the substrate binding pocket of rOCT1. By modification of this position the transport pathway could be blocked. The replacement of glycine 478 with cysteine allows a covalent modification of this cysteine with an SH-group reagent [2-(Trimethylammonium)ethyl] methanethiosulfonate bromide (MTSET). This modification inhibited the transport of several substrates such as choline, TEA or MPP. With the help of binding studies, we could show that the binding of MPP in the outward facing conformation was prevented by the modification with MTSET. The introduction of cysteine in position 478 increased the affinity of TBuA and also influenced the substrate- and potential-dependent conformational changes. Specifically, it was found that the fluorescence response of the empty transporter changed in two of three positions (260 and 483). Apart from the fluorescence in the state of equilibrium, the time constants of the fluorescence responses were also influenced by the position 478. The effects of cysteine 478 could be mimicked in position 483 by the introduction of a serine or threonine in position 478. The blockage of the transport pathway by MTSET hardly changed the movement of the empty transporter in positions 260 and 483, whereas a clear reduction of the fluorescence response was measured in position 380. Additionally, the substrate-dependent fluorescence changes were reduced clearly in position 483. In conclusion, the data indicate that rOCT1 undergoes conformational changes, which are substrate- and potential-dependent and are influenced by the position 478.

Polyspezifische organische Kationentransporter (OCTs) der SLC22 Familie transportieren organische Kationen entlang eines elektrochemischen Gradienten und spielen eine entscheidende Rolle bei der Ausscheidung und Gewebeverteilung von endogenen organischen Kationen und bei der Aufnahme, Ausscheidung und Verteilung von kationischen Medikamenten und Toxinen. Zu den endogenen transportierten Substanzen gehört auch der Neurotransmitter Acetylcholin (ACh), der unter anderem in der menschlichen Haut eine wichtige Rolle in der Zelldifferenzierung und –proliferation spielt. Die dermatologischen Antiinfektiva Gentianaviolett (GV) und Brillantgrün (BG) aus der Gruppe der Triphenylmethanfarbstoffe werden in der Behandlung lokaler Wundinfektionen verwendet und zeigen im klinischen Gebrauch Nebenwirkungen wie Wundheilungsstörungen. Es konnte gezeigt werden, dass die Farbstoffe die OCTs konzentrationsabhängig hemmen und es wurden die Werte der halbmaximalen Hemmkonzentration ermittelt. Dabei zeigte sich, dass GV und BG zu den Hemmstoffen mit der höchsten Affinität zu den OCTs gehören. Ein Transport der Farbstoffe durch die OCTs konnte nicht nachgewiesen werden, die toxische Wirkung auf Keratinozyten in in-vitro Versuchen mit menschlichen Zellreihen wurde bestätigt. Ein Zusammenhang zwischen den beobachteten Wundheilungsstörungen unter der Therapie mit Triphenylmethanfarbstoffen und der Hemmung des ACh-Transportes durch die OCTs konnte nicht bestätigt werden. / Polyspecific organic cation transporters (OCTs) of the SLC22 family mediate downhill transport of organic cations and play an essential role in excretion and distribution of endogenous organic cations and for the uptake, elimination and distribution of cationic drugs and toxins. One of these endogenous transported substances is the neurotransmitter Acetylcholin (ACh), which plays an important role in the differentiation and proliferation of human skin cells. The triphenylmethane dyes gentian violet (GV) and brilliant green (BG), that are used in dermatology for the local treatment of infected wounds show side effects such as disruption of the healing of wounds. It could be shown, that the dyes inhibit the OCTs in a concentration-dependent manner and the IC50-values could be determined. The transport of the dyes through the OCTs could not be shown however the toxicity on human keratinocytes could be confirmed in in-vitro essays with human cell lines. A connection between the disruption of wound-healing under therapy with triphenylmethane dyes and the inhibition of the ACh-transport mediated by the OCTs could not be confirmed.