Th. 3e cycle--Sci. agron.--Toulouse--I.N.P., 1983. N°: 168.

L’androgenèse est une biotechnologie végétale utilisée pour fixer le bagage génétique des plantes en une seule génération. Elle repose sur la capacité d’un grain de pollen immature, la microspore, à restaurer sa totipotence cellulaire végétale et se dédifférencier puis s’engager dans la voie de l’embryogenèse. Or, on observe que la capacité de la microspore à s’engager dans l’embryogenèse est génétiquement variable. En dépit des nombreux avantages qu’elle présente, l’androgenèse entraîne souvent une conséquence indésirable, soit une distorsion de la ségrégation (DS) chez les populations issues de cette biotechnologie. Ma thèse porte sur l’étude (i) du transcriptome de la microspore en transition entre la voie de développement du grain de pollen et celle de l’androgenèse et (ii) de la DS pour déterminer quand la DS survient dans le processus et où elle affecte le génome. J’ai utilisé l’orge comme espèce modèle pour mon étude. L’analyse transcriptomique a été réalisée sur la microspore isolée de l’anthère à trois stades, soit avant (jour 0) et immédiatement après (jours 2 et 5) l'application d'un traitement de stress visant à induire la voie de l’androgenèse. Je me suis intéressé à deux catégories de gènes; soit les gènes exprimés exclusivement à un stade précis et les gènes exprimés différemment lors de l’initiation de l’androgenèse. J’ai pu identifier des gènes exprimés exclusivement dans la microspore au jour 0 (11), 2 (34) ou 5 (367). Au jour 5, j’ai constaté l’induction de nombreux gènes codant pour des FT et des gènes impliqués dans la synthèse ou la transduction du signal de nombreux régulateurs de croissance. L’analyse des gènes exprimés différemment m’a permis d’identifier certains processus métaboliques qui sont activés/réprimés lors du passage de la microspore du jour 0 au jour 2 et du jour 2 au jour 5. Les gènes exprimés exclusivement à un stade précis du développement pourraient servir de marqueurs moléculaires indicateurs de la performance en androgenèse pour optimiser les protocoles de culture. Ensuite, la DS a été étudiée par une approche de génotypage à l’échelle génomique. J’ai d’abord développé une méthodologie d’analyse génotypique novatrice, reproductible et précise pour étudier la fréquence allélique sur un échantillon en composite. Cette méthode m’a permis d’étudier la fréquence allélique chez 1) des échantillons de microspores (avant et après l’application d’un stress), 2) des embryons et 3) des plantes régénérées. J’ai montré que la DS survenait à la fois lors du développement des embryons et la régénération des plantes. Aucune DS n’a été observée chez les échantillons de microspores. Mes résultats montrent que la sélection engendrant la DS s’opère au cours de la culture in vitro. Toujours à l’aide de cette méthode de génotypage en composite, j’ai identifié et comparé la fréquence et l’étendue de la DS chez 12 populations de lignées haploïdes doublées (HD). Dans cette seule étude, un plus grand nombre de populations de lignées HD (12) ont été caractérisées que ce qui avait été fait dans la somme de toutes les études antérieures dans la littérature scientifique. Nous avons montré que les régions de distorsion de ségrégation différaient beaucoup quant à leur position, leur étendue et l’amplitude de la distorsion d’un croisement à l’autre. La connaissance de ces allèles permettrait de prédire le potentiel androgénique des génotypes dans un programme de sélection. Mes travaux de thèse élèvent à l’ère des «omics» la recherche chez la microspore d’orge dans le système de l’androgenèse. À une échelle sans précédent, mon étude transcriptomique explore et décrit les changements d’expression génique au cours de la transition développementale de la microspore. Mon étude génomique identifie quand s’exerce la sélection engendrant la distorsion de la ségrégation des allèles dans ce système et décrit quelles régions chromosomiques sont affectées par cette distorsion. À la lumière de mes résultats, dans le dernier chapitre, je propose certaines pistes de recherche pour poursuivre l’étude des mécanismes moléculaires dirigeant la transition développementale de la microspore en androgenèse et pour développer des outils de génotypage afin d’utiliser la DS comme un outil d’amélioration génétique. / Androgenesis is a plant biotechnology used to fix the genetic background of plants in a single generation. This is based on the ability of an immature pollen grain, the microspore, to restore its totipotency, to dedifferentiate and then to engage in the path of embryogenesis. However, it is observed that the ability of the microspore to engage in embryogenesis is genetically variable. Despite the many desirable attributes of androgenesis, an undesirable side - effect is the segregation distortion (SD) encountered in populations resulting from this biotechnology. My thesis focuses on (i) the study of the transcriptome of microspores undergoing a developmental transition from the pollen - grain pathway towards embryogenesis and (ii) to identify when SD arises in the process and in which genomic regions it occurs. I used barley as a model species for my studies. Transcriptomic analysis was performed on microspores isolated from anthers at three stages corresponding to the microspore before (day 0) and immediately after (days 2 and 5) the application of a stress treatment aimed at inducing embryogenesis. I was interested in two categories of genes: those expressed exclusively at a specific stage of microspore development and those that were differentially expressed during the initiation of androgenesis. I was able to identify genes expressed exclusively in the microspore on day 0 (11), 2 (34) or 5 (367). On day 5, I found the induction of many genes encoding transcription factors (T Fs) in addition to genes involved in the synthesis or signal transduction of many growth regulators. The analysis of differentially expressed genes allowed me to identify certain metabolic processes that were activated/repressed during microspore development from day 0 to 2 and from day 2 to 5. Genes expressed exclusively at a specific stage of development could serve as molecular markers indicative of the performance in androgenesis to optimize isolated microspore culture protocols. Then, SD was studied using a whole - genome genotyping approach. I first developed an innovative, reproducible and accurate genotypic analysis methodology to determine allelic frequency on pooled samples. This method was then used to estimate allelic frequencies in samples of microspores (before and after the application of stress), embryos and regenerated plants. I showed that SD arises during both the development of embryos and the regeneration of plants. No SD was observed in samples of microspores. My results show that the selective forces promoting SD act during in vitro culture. Still using the same genotyping method performed on pooled samples, I identified and compared the frequency and extent of SD in 12 populations of doubled haploid lines (DH). A greater number of DH (12) populations were characterized in my study alone than the sum of all previous studies in barley. I showed that segregation distortion regions greatly differ in their position, extent, and magnitude in different DH populations. Knowledge of these alleles would be useful to predict the androgenic potential of a genotype in a breeding program. My dissertation has allowed research into barley microspores, or more widely androgenesis, to enter into the “omics” era. On an unprecedented scale, my transcriptomic study explores and describes the gene expression changes that occur during the developmental transition that the microspore undergoes in the course of androgenesis. My genomic study identifies when the selection (producing SD) arises in this system and describes which chromosomal regions are affected by this distortion. In light of my findings, in the final chapter I propose some lines of research to further study the molecular mechanisms driving the developmental transition from microspores to embryos and to develop genotyping tools to use SD as a genetic improvement tool.

L’émergence du génotypage à haut débit et le développement de méthodes statistiques reliant le génotype au phénotype ont donné lieu à des approches pangénomiques, c’est-à-dire à l’échelle du génome entier, exploitables en sélection des plantes. Ces approches ont d’abord permis d’examiner l'association entre génotype et phénotype via des analyses d'association pangénomique (GWAS en anglais) afin d’identifier des loci de caractères quantitatifs (« quantitative trait loci », QTL) utiles en sélection assistée par marqueurs (SAM). Plus récemment, ces approches ont été explorées pour la prédiction génomique, laquelle vise, d’une part, à identifier les croisements les plus prometteurs (la sélection des croisements), et d’autre part, à identifier les individus les plus prometteurs au sein d’une descendance (la sélection génomique). Dans les deux cas, ces prédictions reposent sur un modèle statistique reliant le génotype et le phénotype au sein d’une population de référence. Ces approches pangénomiques offrent un grand potentiel, mais sont encore émergentes et de nombreuses questions se posent encore chez l’orge. Notre étude s’intéresse à certaines de ces interrogations et elle est divisée en quatre volets de recherche. Les approches pangénomiques nécessitent un nombre important de marqueurs moléculaires de type SNP (« single nucleotide polymorphism »). Ainsi dans le premier volet nous avons optimisé le protocole de génotypage par séquençage. Ce volet détaille tout le processus, de la préparation des librairies de séquençage jusqu’à la production d’un catalogue de SNP de haute qualité. À titre d’illustration, nous avons généré un catalogue de 30 000 SNP ayant une distribution chromosomique intéressante et une grande exactitude des génotypes. Dans le deuxième volet, en utilisant les données phénotypiques et génotypiques d’une population d’amélioration, nous avons comparé l’efficacité de trois approches GWAS (Uni-SNP, Multi-SNP et Haplotypique) pour détecter des QTL pour des caractères agronomiques importants. Les approches Multi-SNP et Haplotypique ont identifié plus de QTL que l’approche Uni-SNP. Le chevauchement entre les approches était limité, chaque approche découvrant un sous-ensemble différent de QTL. / Dans le cadre du troisième volet, nous avons étudié l’impact de trois facteurs sur la justesse de la sélection génomique : (1) la performance de différents modèles statistiques (incluant ou non l’épistasie), (2) le nombre de marqueurs employés ainsi que (3) leur localisation (génique/nongénique). Le modèle qui intègre les effets additifs et épistatiques a montré les meilleures performances même si les différences entre les modèles étaient modestes. Jusqu’à 2K SNP, la justesse de la sélection génomique est restée comparable à celle basée sur le catalogue entier (35K), mais une diminution significative été observée à 500 SNP. Dans la plupart des cas, l’utilisation de SNP présents dans les régions géniques, voire codantes, n’a pas apporté une amélioration significative. Enfin, dans le quatrième volet, nous avons exploré la sélection génomique et la sélection des croisements. En premier lieu, nous avons constitué une population de référence pour bâtir un modèle de sélection génomique et prédire les performances de 350 descendants développés dans un programme d’amélioration. A partir des prédictions, 35 lignées ont été sélectionnées et testées au champ afin d’examiner la corrélation entre les performances prédites et observées. Les corrélations étaient satisfaisantes pour la résistance à la fusariose et le rendement. Ensuite, sur la base de ce modèle, nous avons prédit la moyenne (μ) ela variance génétique (Vg) de chacune des descendances simulées issues de tous les croisements possibles (30 000). La validation de ces prédictions a été réalisée rétrospectivement sur un sous-ensemble de croisements précédemment réalisés, en examinant leur persistance dans le processus de sélection. Tel qu’attendu les croisements les plus persistants (>F9) ont présenté des μ supérieures, mais des Vg modérées. Même si la résistance à la fusariose et le rendement sont corrélés défavorablement, nous avons pu identifier des croisements (650) où cette corrélation était rompue. Parmi ces croisements, certains (40) auraient un réel potentiel avec des performances égales ou supérieures à des lignées témoins performantes. Au terme de ce projet, nous avons démontré l'efficacité d'une procédure GWAS combinant des approches uni- et multi-locus à disséquer des caractères complexes et à détecter des QTL clés utilisables en SAM. Nous avons aussi démontré que la prédiction génomique peut être optimisée et efficacement intégrée en sélection génétique chez l’orge à six rangs pour identifier les meilleurs descendants, mais surtout pour identifier des croisements prometteurs. / Finally, in the fourth part, we explored genomic selection and genomic mating in a breeding program. First, we established a training population to build a genomic selection model and to predict the performance of 350 progeny developed in a breeding program. Based on these predictions, 35 lines were selected and tested in the field to examine the correlation between predicted and observed performances. The correlations were satisfactory for Fusarium head blight (FHB) resistance and yield. Then, based on this model, we predicted the mean (μ) and the genetic variance (VG) of each simulated progeny from all possible crosses (n = 30,000) between lines of the training population. The validation of these predictions was carried out retrospectively on a subset of previously performed crosses by examining their persistence in the selection process. As expected, the most persistent crosses (> F9) displayed high μ but moderate VG. Although resistance to FHB and yield are unfavorably correlated, we could identify crosses (650) where this correlation was weakened. Among these crosses, some (40) are predicted to offer equal or better performance than current checks. Through this project, we demonstrated the efficiency of a GWAS procedure combining single- and multi-locus approaches to dissect complex characters and to detect key QTLs that can be used in MAS. We also demonstrated that genomic prediction can be optimized and efficiently integrated in genetic improvement of six-row barley to identify the best progeny but also to identify promising crosses. / The emergence of high-throughput genotyping and the development of statistical methods linking genotype to phenotype have led to pangenomic approaches, performed on a genome-wide scale, exploitable in plant breeding. First, these approaches were used to examine the association between genotype and phenotype in genome-wide association studies (GWAS) in order to identify quantitative trait loci (QTLs) useful in marker-assisted selection (MAS). More recently, these approaches have been explored in genomic prediction which aims, on the one hand, to identify the most promising crosses (genomic mating), and on the other hand, to identify the most promising lines within a set of progeny (genomic selection). In both cases, these predictions are based on a statistical model linking genotype to phenotype in a training population. These genome-wide approaches offer great potential but are still emerging and many questions remain unanswered in barley. Our study focuses on some of these questions and is divided into four areas of research. Genome-wide approaches require a large number of single nucleotide polymorphism (SNP) markers. Thus, in the first part of this project, we optimized the protocol of genotyping by sequencing (GBS). This part details the entire process, from the preparation of GBS libraries until the production of a high-quality SNP catalog. As an illustration, we generated a catalog of 30,000 SNPs with a broad chromosome distribution and high genotype accuracy. In the second part, using phenotypic and genotypic data from a breeding population, we compared the effectiveness of three GWAS approaches (Single-SNP, Multi-SNP and Haplotype-based) to detect QTLs for important agronomic traits. The Multi-SNP and Haplotype-based approaches identified more QTLs than the Single-SNP approach. The overlap between the approaches was limited, as each approach uncovered a different subset of previously validated QTLs. In the third part we studied the impact of three factors on the accuracy of genomic selection: (1) the performance of different statistical models (including epistasis or not), (2) the number of SNP markers included in the model as well as (3) their localization (genic/non-genic regions). The model that incorporates both the additive and epistatic effects of SNPs showed the best performance even though the differences between the models were modest. With as few as 2K SNP, the accuracy of genomic selection remained comparable to that based on the entire catalog (35K), while a significant decrease in accuracy was observed at 500 SNPs. In most cases, the use of SNPs located in genic regions, even coding regions, did not provide a significant improvement.

Reproduction de : Thèse doctorat : Biologie et physiologie végétales : Reims : 2007. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. p. 106-139.

Thesis--Helsinki. / Includes bibliographical references.

La diversité génétique de 92 cultivars d'orges canadiennes a été mesurée en utilisant deux types des marqueurs moléculaires (SSR et DArT) et le pedigree. Au total, 368 alleles ont été identifiés aux 50 locus SSR et utilisés pour créer une matrice de distance génétique. Le nombre d'allèles par locus variait de 2 à 13 (x = 7,36) et l'indice PIC variait entre 0,34 et 0,86 (x = 0,69). Pour les marqueurs bialléliques DArT, la matrice de distance génétique s'est basée sur 971 marqueurs dont les indices PIC variaient entre 0,06 et 0,50 (x = 0,39). Une troisième matrice de distance a été calculée basée sur le coefficient de parenté. Un groupement des génotypes a été effectué basé sur les trois matrices de distances génétiques et les dendrogrammes obtenus ont montré des relations génétiques parmi les cultivars d'orge. Une comparaison de la similarité topologique des trois dendrogrammes réalisée en utilisant l'indice de congruence a montré une très bonne concordance entre les trois dendrogrammes. Des analyses statistiques ont par ailleurs montré une corrélation fortement significative entre les matrices SSR et DArT (r = 0,80, p< 0,002) mais une plus faible corrélation positive du pedigree avec les deux types de marqueur (r = 0,46, p<0,002; r = 0,52, p< 0,002). Ces informations comparant les résultats de différentes méthodes d'estimation de la diversité génétique seront utiles pour l'amélioration et la conservation des ressources génétiques d'orge.

Huit régimes hormonaux ont été comparés en culture d’anthères chez deux génotypes d’orge de printemps à six rangs. Quatre paramètres ont été notés : le nombre de cals, d’embryons, de plantes vertes et d’albinos. L’analyse de la variance a montré que les génotypes (G), les traitements (T), le rang de récolte des épis (R) et l’interaction R x G avaient des impacts significatifs sur les paramètres à l’étude. Le génotype Altona s’est montré beaucoup plus prolifique que le génotype C97-21-38-3 (19,6 vs 1,3 plantes vertes par 100 anthères). Les traitements 3 (0,1 mg/L de BAP ; 0,1mg/L de 2,4-D) et 6 (0,3 mg/L de BAP ; 0,3 mg/L de 2,4-D) ont permis d’obtenir entre 2 et 3 fois plus de plantes vertes que les traitements témoins. Finalement, chez Altona, les deuxième et troisième épis ont produit significativement plus de plantes vertes, alors que chez C97-21-38-3 aucune différence n’a été observée. / Eight hormonal regimes were compared in anther culture on two genotypes of six-row spring barley. Observations were made on four parameters: the number of calli, embryos, green plants and albinos. An analysis of variance showed that the genotype (G), the treatment (T), the harvest rank of the spike (R) and the R X G interaction all had significant impacts on the studied parameters. Altona proved much more productive in anther culture than C97-21-38-3 (19.6 vs 1.3 green plants per 100 anthers). Treatments 3 (0.1 mg/L BAP; 0.1mg/L 2,4-D) and 6 (0.3 mg/L BAP; 0.3 mg/L 2,4-D) yielded between 2 and 3-fold more green plants than the control treatments. Finally, whereas the second and third spikes produced significantly more green plants than the first spike with Altona, no such difference was observed with C97-21-38-3.

Texte remanié de: Thesis--Manchester university.

Un enjeu actuel en biotechnologie est d'obtenir des plantes haploïdes doublées par la technique de la culture de microspores isolées (CMI). Pourtant, la CMI génère parfois une proportion importante de plantes albinos, laquelle peut atteindre 100 % chez certains cultivars. Des travaux antérieurs ont indiqué que des remaniements du génome chloroplastique seraient à l'origine de cet albinisme. Afin de mieux comprendre ce processus menant à l'albinisme, nous avons entrepris d'étudier l'intégrité du génome chloroplastique au sein de microspores d'orge et de plantes albinos via une approche de séquençage à grande échelle. L'ADN total extrait de microspores à un stade précoce de la CMI, d'une feuille de la plante-mère (témoin), et de feuilles albinos, a été séquencé et les séquences chloroplastiques ont été analysées. Ceci nous a permis de documenter pour la première fois une diminution de l'ADN chloroplastique chez les microspores. De plus une étude de variations structurales a démontré un abaissement généralisé de la quantité de génomes chloroplastiques chez les microspores. Enfin, d'importants remaniements du génome chloroplastique ont été observés chez les plantes albinos, révélant une forte abondance de génomes chloroplastiques altérés de forme linéaire.

L'analyse de 169 lignées canadiennes d'orge avec 883 marqueurs DArT a permis de mettre en évidence 15 régions génomiques qui affichent un déséquilibre de liaison (DL) avec le gène Vrsl. Dans un premier volet, 13 des 15 régions en DL ont été testées à l'aide de marqueurs SSR afin de vérifier si l'une des régions détermine la densité des épis, un caractère co-sélectionné avec le gène Vrsl. Aucun des marqueurs n'a présenté une association avec la densité de l'épi. Dans un second volet, nous avons tenté de déterminer l'emplacement chromosomique du gène DEP1, un gène récemment clone chez l'orge et soupçonné de contribuer au contrôle génétique de la densité de l'épi. Les produits d'amplification des quatre introns du gène DEP1 ont été séquences et comparés entre deux cultivars d'orge afin de découvrir des polymorphismes mononucléotidiques. Une absence totale de polymorphismes entre ces cultivars a rendu impossible la cartographie du gène DEP1 chez l'orge.