Memoria para optar el título de Bioquímico / El hongo filamentoso Fusarium konzum pertenece al complejo taxonómico Gibberella fujikuroi formado por 9 especies biológicas que se han aislado desde distintas plantas y que sintetizan diversos metabolitos secundarios. Dos especies del complejo, F. fujikuroi y F. konzum, producen giberelinas (GAs), diterpenos activos como fitohormonas. Las demás especies no producen GAs aunque contienen los genes respectivos o parte de ellos. En este trabajo se caracterizó la biosíntesis de GAs en la cepa I3 de F. konzum tanto a nivel de las reacciones químicas como de las enzimas que las catalizan y se comparó con la especie bien estudiada, F. fujikuroi. El análisis de GAs endógenas en distintas cepas de F. konzum indicó que el producto principal de la vía metabólica es la lactona 3,13-dihidroxilada GA1. También se encontró ácido giberélico (GA3) aunque en menor cantidad. Mediante la administración de precursores marcados con 14C a los cultivos líquidos, se determinó la secuencia biosintética para GA1 en la que participan como intermediarios el ácido entkaurenoico, el GA12 aldehído, y las giberelinas 3b-hidroxiladas GA14 (C20) y GA4 (C19). La vía 3b-hidroxilada es la principal y la vía no hidroxilada es menor. La reacción de hidroxilación en C13 ocurre al final de la secuencia, sobre el GA4 en cambio la hidroxilación en C3b ocurre en una etapa temprana, a nivel del GA12 aldehído. En las incubaciones con ácido ent-14C-kaurenoico se acumularon los intermediarios 14C-GA14 y 14C-GA4 en tanto que a partir del precursor 14C-GA12 se formó el C20 alcohol (14C-GA15) y el C20 aldehído (14C-GA24) además del producto lactónico 14C-GA9. Esto sugiere que las oxidasas de GAs presentan eficiencias reducidas en F. konzum lo que se confirmó determinando en los cultivos las velocidades de las reacciones respectivas. Se encontró que en la cepa I3 de F. konzum la GA14 sintasa oxida al ácido ent-14C-kaurenoico con una velocidad 397 veces menor que en la cepa ACC917 de F. fujikuroi mientras que la C20 oxidasa metaboliza el 14C-GA12 con una velocidad reducida en un factor de 216. La reacción final de la secuencia, la 13-hidroxilación, es la etapa limitante de la biosíntesis de GA1 y presentó en F. konzum, una velocidad 48 veces menor que en F. fujikuroi. Utilizando fracciones microsomales obtenidas del micelio de la cepa I3 de F. konzum se demostró que la fuente de electrones para las reacciones de hidroxilación en 3b y oxidación en C7 del GA12 aldehído es exclusivamente el NADPH, lo que sugiere que la citocromo P450 reductasa sería la proteína transportadora de electrones asociada a la GA14 sintasa en este organismo y probablemente también estaría asociada a las demás monooxigenasas de GAs. Tanto la C20 oxidasa como la 13-hidroxilasa de F. konzum presentaron eficiencias similares en presencia y en ausencia de NH4NO3 lo que sugiere que en esta especie de Fusarium el mecanismo de regulación por nitrógeno descrito en F. fujikuroi no es funcional o presenta una baja eficiencia. Esto generaría una baja expresión de los genes de la biosíntesis de GAs explicando la velocidad reducida de las reacciones estudiadas. La secuencia de biosíntesis de giberelinas desde el ácido ent-kaurenoico hasta GA1 y GA3 en F. konzum es similar a la de F. fujikuroi pero ambos sistemas difieren en la eficiencia de las oxidasas y en el mecanismo de inducción lo que explicaría la generación de distintos productos finales y la acumulación de intermediarios en F. konzum / The filamentous fungus Fusarium konzum belongs to the taxonomic complex Gibberella fujikuroi formed by nine biological species isolated from different plants which synthesize various secondary metabolites. Two species of the complex, F. fujikuroi and F. kozum produce gibberellins (GAs), diterpene metabolites active as phytohormones. The other species do not produce GAs even when they contain all or some of the GA-biosynthetic genes. In this work gibberellin biosynthesis was characterized in F. konzum at the level of the chemical reactions as well as of the respective enzymes and was compared to the well known GA-producing species F. fujikuroi. Endogenous GAs analysis indicated that the main product was the 3,13-dihydroxylated lactone GA1. Gibberellic acid (3,13-dihydroxylated, D1,2; GA3) was also found in the cultures although at a lower level. The metabolic sequence for GA1 biosynthesis was determined by adding 14C-labelled precursors into liquid cultures of I3 F. konzum strain which showed that ent-kaurenoic acid, GA12 aldehyde, GA14 (C20) and GA4 (C19) are intermediates of the sequence. The 3b-hydroxylated pathway is the major pathway while the non-hydroxylated is a minor pathway. Hydroxylation at C13 occurs in a late step of the sequence over GA4 or GA7 in contrast to 3b- hydroxylation that occurs over GA12 aldehyde at an early step. In incubations with ent-14C-kaurenoic acid, the 3b-hydroxylated products 14C-GA14 and 14C-GA4 accumulated while the C20 alcohol (14C-GA15) and the C20 aldehyde (14C-GA24) were formed from 14C-GA12 besides the lactonic product 14CGA9. This result suggests that GA oxidases would have reduced catalytic efficiencies in F. konzum which was confirmed by determining the rates of the respective reactions in cultures of the strain I3. In this strain GA14 synthase oxidized ent-14C-kaurenoic acid with a rate 397 times lower than in F. fujikuroi (ACC917 strain) while C20 oxidase metabolized 14C-GA12 with a rate reduced by a factor of 216. The last reaction of the sequence, 13-hydroxylation is the limiting step of GA biosynthesis and showed in F. konzum a rate 48 times lower than in F. fujikuroi. Microsomal fractions obtained from the mycelia of F. konzum catalyzed 3b- hydroxylation and C7-oxidation of GA12 aldehyde exclusively in the presence of NADPH. This suggests that cytochorome P450 reductase would be the electron transport protein associated to GA14 synthase and probably to the other GA monooxygenases in this Fusarium species. Gibberellin C20 oxidase as well as 13- hydroxylase have similar catalytic efficiencies in cultures containing ammonium nitrate or without this compound which suggests that nitrogen regulation of GA biosynthesis is not functional in F. konzum or has a low efficiency. This would explain the reduced rates found for the reactions catalyzed by GA monooxygenases in I3. The biosynthetic sequence from ent-kaurenoic acid to GA1 or to GA3 is similar in F. konzum and in F. fujikuroi although both systems differ in the efficiency of the GA oxidases and in the effect ammonium nitrate which would result in different final products in both systems as well as in accumulation of intermediates in F. konzum

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magister en Bioquímica área de especialización en Bioquímica Ambiental y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / Memoria de título de bioquímico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo / El hongo filamentoso Fusarium fujikuroi produce diversos metabolitos secundarios entre los que se encuentran las giberelinas (GAs), diterpenoides tetracíclicos derivados del ácido mevalónico de interés agronómico debido al efecto regulador que presentan sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas. El interés comercial de estas moléculas y la alta eficiencia del sistema fúngico han llevado a caracterizar su biosíntesis a nivel de las reacciones químicas, las enzimas y los genes implicados en el proceso. La secuencia biosintética consiste principalmente en reacciones de oxidación, las que son catalizadas por monooxigenasas (MO) P450 codificadas por genes agrupados en un cluster. En este hongo la biosíntesis de GAs se induce en condiciones de carencia de compuestos nitrogenados y es inhibida por amonio o glutamina debido a la represión de los genes. Este mecanismo de regulación está mediado principalmente por el regulador global AREA, un factor de transcripción cuya actividad depende de los niveles de nitrógeno, aunque también podrían participar otros elementos regulatorios específicos para esta vía metabólica. Con el objeto de contribuir a la comprensión de los mecanismos de regulación de la biosíntesis de las GAs fúngicas, en este trabajo de Tesis se investigó si los genes de GAs de F. fujikuroi se expresan como proteínas activas en tres especies de hongos filogenéticamente relacionadas a F. fujikuroi: Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum y Aspergillus nidulans. Estos hongos no poseen los genes de la biosíntesis de GAs pero contienen el regulador global AREA. Interesó determinar si la complementación con el cluster de genes de F. fujikuroi es suficiente para generar la capacidad de biosintetizar GAs en estas especies y si las transformantes presentan el mecanismo de represión por amonio. Se caracterizó la producción de GAs en cultivos líquidos mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS) y las actividades de las distintas oxidasas de GAs se ensayaron mediante sustratos marcados con [14C] e identificando los productos por cromatografía en capa fina y cromatografía líquida de alta resolución. Se encontró que las transformantes T6, T11 y T1 de F. oxysporum así como la transformante T2 de F. graminearum presentan la capacidad de biosintetizar GAs en un medio líquido carente de compuestos nitrogenados. Principalmente sintetizan GAs 3β-hidroxiladas y 19-γ10-lactónicas (19C) como GA4, GA7 y GA3, además algunas GAs no hidroxiladas (GA9, GA24, GA25) y entkaurenoides, que son productos laterales de la vía biosintética. Este patrón de productos corresponde al que presenta la cepa silvestre IMI28589 de F. fujikuroi, sistema fúngico que sintetiza GA3 como producto final a partir de intermediarios 3β-hidroxilados. Estos resultados indican que los genes de la biosíntesis de GAs de F. fujikuroi se expresan y generan enzimas activas tanto en F. oxysporum como en F. graminearum. En particular, la metabolización del ácido ent-[14C]kaurenoico hasta [14C]GA14 y posteriormente hasta [14C]GA3 demostró que la MO P450-1 (GA14 sintasa) presenta las actividades de 7-oxidasa y de 3β-hidroxilasa, como en F. fujikuroi. Por otra parte, la MO P450-2 (GA20 oxidasa) forma el producto lactónico [14C]GA9 y su derivado [14C]GA40, a partir del sustrato [14C]GA12. En estos ensayos también se detectaron las actividades de 13-hidroxilasa y de desaturasa aunque con diferentes proporciones en las distintas transformantes, en concordancia con el análisis de GAs endógenas. El efecto represor del nitrato de amonio se determinó a través de la actividad de la GA20 oxidasa en la transformante de F. graminearum T2, donde se encontró que la velocidad de utilización de [14C]GA12 fue 5 veces menor en un medio con nitrato de amonio 4,8 g/L que en un medio sin amonio, en forma similar a la cepa silvestre IMI28589 de F. fujikuroi (siete veces menor en presencia de amonio). Esto sugiere que estaría operativo en F. graminearum el mecanismo de represión por compuestos nitrogenados. Para la transformante T6 de F.oxysporum el resultado fue menos claro, ya que se obtuvieron productos en presencia de amonio que no corresponden a la lactona [14C]GA9 o a su derivado [14C]GA40 (los principales productos de la GA20 oxidasa). La identificación de los productos por GC-MS permitirá confirmar si corresponden a la actividad de oxidasas inespecíficas y si la represión por nitrato de amonio está presente en esta especie. A diferencia de las transformantes de F. oxysporum y de F. graminearum, en cultivos de la transformante de A. nidulans no se detectó actividad de ninguna de las oxidasas de GAs en los ensayos con los sustratos marcados con [14C]. Esto sugiere que los genes de F. fujikuroi no se expresarían en A. nidulans, una especie filogenéticamente más alejada de F. fujikuroi que F. oxysporum y F. graminearum, a pesar de que AREA está presente en esta especie. En conclusión, los resultados obtenidos sugieren que las dos especies de Fusarium investigadas, F. oxysporum y F. graminearum, contienen los elementos regulatorios (AREA y/u otros) requeridos para la expresión de los genes de la biosíntesis de GAs en condiciones de carencia de nitrógeno. Estos factores no serían específicos para esta vía, ya que se encontraron en dos especies fúngicas que no contienen genes de la biosíntesis de GAs y no sintetizan estos diterpenos. / The filamentous fungus Fusarium fujikuroi synthesizes several secondary metabolites including gibberellins (GAs), tetracyclic diterpenoids derived from mevalonic acid that have an agronomic interest since they are plant growth regulators. Because of the high efficiency of the fungal system and its commercial interest GA biosynthesis has been characterized at the level of chemical reactions, enzymes and genes. The fungal GA biosynthetic pathway is based on oxidative reactions catalyzed by P450 monooxygenases (MO) codified by a gene cluster. GA biosynthesis is induced in the absence of nitrogenated compounds and inhibited by ammonia or glutamine due to repression of gene expression. The global regulator AREA, a transcription factor dependent on nitrogen levels, mediates this effect, together with other possible specific regulatory elements. In order to contribute to the understanding of GA biosynthesis regulation in F. fujikuroi in this work we investigated if the F. fujikuroi GA biosynthesis genes are expressed as active enzymes in three fungal species phylogenetically related to F. fujikuroi: Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum and Aspergillus nidulans. These species do not contain the GA biosynthesis genes but contain the global regulator AREA. It was investigated if complementation with the F. fujikuroi gene cluster is enough to restore GA biosynthesis in these fungal species and if the transformants present ammonium repression of the GA genes as in F. fujikuroi. GA biosynthesis was determined in liquid cultures by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) and the activities of GA oxidases were assayed with [14C]-labelled substrates by identifying the respective products by thin layer chromatography or high performance liquid chromatography. F. oxysporum transformants T6, T11 and T1 as well as F. graminearum T2 synthesized GAs in liquid cultures that do not contain nitrogenated compounds. These were mainly 19-γ10-lactonic, 3β-hydroxylated GAs (C19; GA4, GA7 and GA3) together with non-hydroxylated GAs (GA9, GA24,GA25) and ent-kaurenoids, lateral products of the GA biosynthetic pathway. This product pattern corresponds to that of the wild-type F. fujikuroi strain IMI28589 that synthesizes GA3 as final product from 3β-hydroxylated intermediates. These results demonstrate that the F. fujikuroi GA biosynthesis genes are expressed as active enzymes in F. oxysporum as well as in F. graminearum. Particularly the conversion of ent-[14C]kaurenoic acid into [14C]GA14 and further into [14C]GA3 demonstrated that in F. oxysporum and F. graminearum GA14 synthase presents 7- oxidase and 3β-hydroxylase activities as in F. fujikuroi. On the other hand, in these transformants GA20 oxidase gave the 19-γ10-lactonic product [14C]GA9 or its derivative [14C]GA40 from [14C]GA12. 13-hydroxylase and desaturase activities were also detected in these assays even when in different proportions in the distinct transformants in agreement with endogenous GA analysis. Ammonium nitrate repressor effect was investigated over GA20 oxidase that was assayed in F. graminearum T2 liquid cultures. The rate of [14C]GA12 conversion was found to be 5 times less in 4,8 g/L ammonium-containing media than in the absence of ammonium, similar to that found for F. fujikuroi IMI28589 cultures (7 times less [14C]GA12 conversion in media containing ammonia). This suggests that the mechanism of repression by nitrogenated compounds would be active in F. graminearum. For F. oxysporum T6 a less clear result was obtained since the products formed in the presence of 4,8 g/L ammonium nitrate do not include [14C]GA9 or [14C]GA40, the main products of GA20 oxidase. GC-MS identification of these products will allow to confirm if they correspond to unspecific oxidation products and if ammonium repression is also present in F. oxysporum. In contrast to F. oxysporum and F. graminearum, the cultures of A. nidulans complemented with the F. fujikuroi GA biosynthesis genes did not present activity of any of the GA oxidases in assays with ent-[14C]kaurenoic acid, [14C]GA12 or [14C]GA4. This suggests that the F. fujikuroi genes would not be expressed in A.nidulans, a species phylogenetically less related to F. fujikuroi, even when it contains AREA. Altogether, the results obtained suggest that the two Fusarium species investigated contain the regulatory elements required for the expression of the GA biosynthesis genes (AREA and/or others) in the absence of nitrogenated compounds. These factors would not be specific for the GA pathway since they are present in two fungal species that do not contain the GA biosynthesis genes and do not synthesize GAs. / Fondecyt

Las giberelinas (GAs) son hormonas vegetales que regulan diversos procesos del desarrollo vegetativo y reproductivo de las plantas. Los niveles de GAs activas están regulados principalmente por enzimas de biosíntesis como las GA 20-oxidasas (GA20ox) y GA 3- oxidasas (GA3ox) y por enzimas de catabolismo como las GA 2-oxidasas (GA2oxs). En tomate (Solanum lycopersicum L.) las GA2oxs están codificadas por una familia multigénica de 5 miembros, SlGA2ox. El objetivo principal de nuestro trabajo es estudiar el papel de los genes SlGA2ox en el desarrollo de tomate. Para determinar como están regulados estos genes estudiamos su patrón de expresión en tejidos vegetativos y reproductivos de tomate y en respuesta a variaciones en los niveles endógenos de GAs. Se observó que los genes SlGA2ox tienen un alto grado de redundancia y que, en plántulas, no son inducibles por GAs. Los genes con mayores niveles de expresión en los tejidos vegetativos resultaron ser los genes SlGA2ox3, - 4 y -5 mientras que los genes SlGA2ox1 y SlGA2ox2 parecen ser importantes en el control del crecimiento del ovario ya que están reprimidos en ovarios polinizados en crecimiento y se inducen en ovarios no fertilizados. Para estudiar la función de estos genes en el desarrollo de la planta se empleó un abordaje de genética reversa usando silenciamiento génico post-transcripcional múltiple y simple. Para el silenciamiento múltiple se usó una construcción de tipo horquilla con una secuencia quimérica homóloga a los cinco genes (shRNA2ox) y para el silenciamiento del gen SlGA2ox1 se usó una construcción de tipo micro-RNA artificial (amiRNA2ox1). Ambas construcciones indujeron el silenciamiento, siendo éste más eficiente cuánto más abundante es el mensajero diana. El silenciamiento múltiple inducido por la construcción 35S::shRNA2ox provocó un incremento significativo de los niveles de la giberelina activa GA4 en ovarios. Además, los ovarios no fertilizados crecían mucho más en las plantas transgénicas que en las plantas silvestres (al menos 30 veces más) y presentaban cierto grado de capacidad partenocárpica que no poseían las plantas silvestres, desarrollando entre un 5 y un 37% de frutos partenocárpicos. Los ovarios polinizados de las plantas transgénicas se desarrollaban algo más rápido inicialmente, pero producían frutos del mismo tamaño a los silvestres. Estos resultados sugieren que el papel de las GAs en el crecimiento del fruto de tomate puede estar mediado, al menos en parte, por las GA 2-oxidasas. En el desarrollo vegetativo de estas plantas no se detectaron los efectos fenotípicos clásicos de la superproducción de GAs, ni se detectó ningún incremento en los niveles de GAs en tallos ni en ápices. Sin embargo se observó una inhibición significativa de la ramificación lateral que parecía deberse a un mayor contenido de GA4 detectado en las yemas axilares. Este fenotipo, no esperado, era suprimido eficientemente cuando se inhibía la síntesis de GAs mediante la aplicación del inhibidor paclobutrazol. Estos resultados sugieren un papel para las GAs como represores de la ramificación y que las GA 2-oxidasas son importantes en el control de la aparición de ramas laterales mediado por GAs. En las plantas 35S::amiRNA2ox1, donde solo se silenció el gen SlGA2ox1, a diferencia de lo que ocurre en las plantas de silenciamiento múltiple, no se detectaron cambios en los niveles de GAs activas, ni alteraciones en la ramificación, ni se mostraron efectos reproducibles sobre la partenocarpia. De estos resultados se deduce que el silenciamiento del gen SlGA2ox1 no es suficiente para inducir cambios significativos en el fenotipo de las plantas de tomate probablemente debido a la redundancia génica. En resumen, las GA 2-oxidasas parecen tener un papel en la regulación de los niveles de GAs en los ovarios y en las yemas axilares de tomate y su silenciamiento génico puede inducir crecimiento partenocárpico de los ovarios e inhibición de la ramificación. / Martínez Bello, L. (2014). Estudio del papel de los enzimas de catabolismo GA 2-oxidasas en el desarrollo de tomate (solanum lycopersicum L.) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/37884

[EN] Abstract Fruit set is the transition from a quiescent ovary of the flower to a developing fruit after pollination. This process is associated with the content of gibberellin (GAs) and auxins in the ovary. Therefore the development of parthenocarpic fruit (seedless fruit) can be induced by applying both kinds of hormones. In tomato it has been described that auxin action during fruit set is mediated by GAs, by inducing different biosynthesis pathway genes, among them SlGA20ox, which codify important enzymes for GAs biosynthesis regulation. The SlGA20ox gene family is composed of 4 genes, and SlGA20ox1 seems to play a key role in fruit set. In order to deepen the understanding of this process, it has been investigated in the ovary of tomato: a) the site of expression of SlGA20ox1 and its regulation; b) the localization of IAA (auxin). For this, we have obtained transgenic lines of the tomato Micro-Tom (MT) cultivar and various hormonal mutants (procera, 35S::CsGA20ox1 Dwarf, entire and dgt) with the transgene pSlGA20ox1::GUS. Transgenic lines do not differ phenotypically from the original lines and they have been used to analyze the expression of SlGA20ox1, using the GUS gene as reporter. Localization of SlGA20ox1 transcripts was also investigated in situ. SlGA20ox1 expression in ovary after pollination was located mainly in the funiculus, placenta and embryo. Auxin and brassinosteroids (BR) increased the expression of SlGA20ox1. On the other hand, auxin location in the ovary was investigated using the transgenic line DR5::GUS (expressing the auxin-response gene DR5), and analyzing directly the IAA content by immunolocalization. In pollinated ovaries, GAs and auxin co-localize in the egg (embryo and embryo-sac) and placenta, supporting the hypothesis that both hormones interact during fruit set. Phenotypic analysis of the mutants used in this work showed that GAs inhibit the development of axillary buds, through the DELLA protein. This inhibitory effect is reversed, at least partially, by BR. Furthermore, the introduction of wild gen Dwarf in MT (normalizing its content of BR) increases plant height, but does not extend its vegetative cycle, nor increases parthenocarpy in MT. / [ES] Resumen La fructificación, paso del ovario en reposo a fruto en crecimiento tras la polinización, asociada al aumento de contenido de giberelinas (GAs) y auxinas en el ovario, es un proceso clave para la producción. Por ello se puede inducir también el desarrollo de frutos partenocárpicos (sin semillas) aplicando ambos tipos de hormonas. En tomate se ha descrito que parte de la acción de las auxinas en la fructificación está mediada por GAs, induciendo distintos genes de la ruta biosintética, entre ellos los que codifican SlGA20ox, enzimas importantes para la regulación de la síntesis de GAs. De los 4 genes que forman la familia, SlGA20ox1 parece ser clave en la fructificación. Con objeto de profundizar en el conocimiento de este proceso, se ha investigado en el ovario de tomate: a) la localización de la expresión de SlGA20ox1 y su regulación; b) la localización de IAA (auxina). Para ello, se han obtenido líneas trangénicas del cultivar Micro-Tom (MT) de tomate y diversos mutantes hormonales (procera, 35S::CsGA20ox1 Dwarf, dgt y entire) con el transgén pSlGA20ox1::GUS. Las líneas transgénicas no difieren fenotípicamente de las líneas originales y se utilizaron para analizar la expresión de SlGA20ox1 con el gen delator GUS. Se investigó además la localización de los transcritos de SlGA20ox1 in situ. La expresión de SlGA20ox1 en el ovario tras la polinización se localizó, principalmente, en el funículo, la placenta y el embrión. Tanto las auxinas como los brasinosteroides (BR) aumentaron la expresión de SlGA20ox1. Por otro lado se investigó la localización de auxinas en el ovario usando una línea transgénica DR5::GUS (que expresa el gen de respuesta a auxinas DR5), y analizando también directamente el contenido de IAA mediante inmunolocalización. En ovarios polinizados, la localización de las GAs y auxinas coincidió en el óvulo (embrión y saco embrionario) y la placenta, apoyando la hipótesis de que ambas hormonas interaccionan durante la fructificación. El análisis fenotípico de los mutantes utilizados mostró que las GAs inhiben el desarrollo de los brotes axilares por GAs, a través de la proteína DELLA. El efecto inhibidor es revertido, al menos parcialmente, por BR. Por otro lado, la introducción del gen silvestre Dwarf en MT (normalizando así su contenido en BR) aumenta la altura de la planta, pero no prolonga su ciclo vegetativo, ni aumenta la capacidad partenocárpica de MT. / [CA] Resum La fructificació, pas de l'ovari en repòs a fruit en creixement després de la pol·linització, associada a l'augment de contingut de giberelines (GAs) i auxines en l'ovari, és un procés clau per a la producció. Per això es pot induir també el desenvolupament de fruits partenocàrpics (sense llavors) aplicant tots dos tipus d'hormones. En el tomàquet s'ha descrit que part de l'acció de les auxines en la fructificació està intervinguda per GAs, induint diferents gens de la ruta biosintètica, entre ells els que codifiquen SlGA20ox, enzims importants per a la regulació de la síntesi de GAs. Dels 4 gens que formen la família, SlGA20ox1 sembla ser clau en la fructificació. A fi d'aprofundir en el coneixement d'aquest procés, s'ha investigat en l'ovari del tomàquet: a) la localització de l'expressió de SlGA20ox1 i la seva regulació; b) la localització de l'IAA (auxina). Per a això, s'han obtingut línies transgèniques de conrear Micro-Tom (MT) de tomàquet i diversos mutants hormonals (procera, 35S::CsGA20ox1 Dwarf, dgt i entire) amb el transgèn pSlGA20ox1::GUS. Les línies transgèniques no difereixen fenotípicamente de les línies originals i es van utilitzar per analitzar l'expressió de SlGA20ox1 amb el gen delator GUS. Es va investigar, a més, la localització dels transcrits de SlGA20ox1 in situ. L'expressió de SlGA20ox1 en l'ovari després de la pol·linització es va localitzar, principalment, en el funicle, la placenta i l'embrió. Tant les auxines com els brasinosteroides (BR) van augmentar l'expressió de SlGA20ox1. D'altra banda es va investigar la localització d'auxines en l'ovari usant una línia transgènica DR5::GUS (que expressa el gen de resposta a auxines DR5) i analitzant també directament el contingut de IAA mitjançant immunolocalització. En ovaris polinitzats, la localització de les GAs i auxines va coincidir en l'òvul (embrió i sac embrionari) i la placenta, refermant la hipòtesi que ambdues hormones interaccionen durant la fructificació. L'anàlisi fenotípic dels mutants utilitzats va mostrar que les GAs inhibeixen el desenvolupament dels brots axil·lars per GAs, a través de la proteïna DELLA. L'efecte inhibidor és revertit, almenys parcialment, per BR. D'altra banda, la introducció del gen silvestre Dwarf en MT (normalitzant així el seu contingut de BR) augmenta l'alçada de la planta, però no perllonga el seu cicle vegetatiu, ni augmenta la capacitat partenocàrpica d'MT. / Gallego García, M. (2016). Papel de la GA 20-oxidasa en la fructificación del tomate [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/61958