Inhibition of disulfide bond formation in Escherichia coli implicates an intricate collaboration of proteins which comprise the glutathione and thioredoxin reducing pathways. Bioengineers have successfully engineered E. coli possessing mutated reducing pathways that promote, rather than inhibit, disulfide bond formation in the cytoplasm. The transcriptome of six such mutant E. coli strains have been characterized using Microarray technology. We find that all mutant strains, exhibit a unique response to oxidative stress, not observed in wild type. Statistical analyses revealed the expression of more than 200 genes that are affected by mutations within the reducing pathways. Significantly up-regulated biological processes include cysteine biosynthesis, histidine biosynthesis, NADH Dehydrogenase I biosynthesis, sugar catabolic processes, and activation of stress responses . The second part of this work describes the construction of an E. coli strain that promotes the complete conversion of glutathione into its seemingly dormant derivative, glutathionylspermidine. This engineered strain can be used in assays designed to evaluate the effectiveness of glutathionylspermidine as a substitute for glutathione and, hopefully, allude to its true metabolic function. / text

Polyglutamine expansion disorders are progressive neurodegenerative diseasesthat are caused by the pathological expansion of polyglutamine repeats. Huntington'sdisease (HD) is a polyglutamine disorder caused by the expansion of an existingpolyglutamine tract in a novel protein, Huntingtin (Htt). Oxidative stress has beenimplicated in the neural dysfunction observed in multiple neurodegenerative conditionsincluding HD. The tumor suppressor p53 is a multifunctional protein that has roles inthe cell cycle, apoptosis and neurodevelopment. The role of p53 in HD-associatedneurodegeneration has been studied but not fully elucidated, nor has the role of p53 inoxidative stress toxicity been fully elucidated.Here I present work that demonstrates polyglutamine expansion inducedalterations to p53 stability, localization, and activity. The transcriptional activity of p53was found to have a role in oxidative stress mediated as well as polyglutaminemediated neurotoxicity in vitro. The expression of p53 was also altered in vivo in amouse model of HD as well as in HD brain.Taken together, these data demonstrate a role for p53 in polyglutamine and oxidativestress toxicity.

Résumé L’objectif de ce travail a été d’évaluer la toxicité du butyrate de sodium (NaBu), un inhibiteur des histones désacétylases (HDACs), et ses mécanismes d’action sur les cellules de cancer du sein humain, les cellules MCF-7 déficientes pour la caspase-3, et lignées dérivées : les cellules MCF- 7/caspase-3, et les cellules VCREMS résistantes à la vincristine, et dans une moindre mesure à la doxorubicine. La contribution de l’apoptose dans la létalité induite par le NaBu a été recherchée dans les cellules MCF-7wt en estimant l’exposition de la phosphatidylsérine ainsi que le clivage de la PARP. La présence de caspase-3, n’a ni amplifié ni accéléré l’apoptose qui a impliqué le rhéostat Bax/Bcl-2 en faveur d’une induction de Bax. La cytostasie du NaBu dans les cellules MCF-7 s’est manifestée par un blocage des cellules en phase G2/M. L’évaluation du niveau d’expression des régulateurs du cycle cellulaire dans les cellules MCF-7wt et MCF-7/caspase-3 a montré une surexpression de p21, de façon indépendante de p53. L’action cytostatique du NaBu a été associée à une accumulation légère et modeste des formes non-phosphorylées de pRB, un facteur dont la phosphorylation par les complexes cycline D/cdk4,6 et cycline E/cdk2 est nécessaire à la transition G1/S. Dans ces conditions, les niveaux de cdk2 et de Cdc25A, une oncoprotéine activatrice de cdk2, sont restés stables. Le NaBu est une molécule à effet pléïotropique, l’utilisation de la trichostatine A, inhibiteur par excellence des HDACs, a permis d’établir la relation de causalité entre l’inhibition des HDACs et la toxicité du NaBu. La plupart des inhibiteurs des HDACs induisent l’apoptose en perturbant le métabolisme oxydatif de la mitochondrie ce qui pourrait modifier le statut redox cellulaire. Nous avons cherché une implication du métabolisme du glutathion (GSH), le thiol anti-oxydant non-protéique majoritaire de la cellule, dans la toxicité induite par le NaBu. Les résultats montrent que le NaBu induit une déplétion du GSH dans les cellules MCF-7wt et dérivées de façon dose-dépendante, corrélée avec la mortalité cellulaire. Devant l’éventualité d’une consommation accrue de GSH par les enzymes associées à son métabolisme, nous avons évalué le niveau des activités des enzymes glutathion peroxydase, glutathion réductase et glutathion S-transférases. Dans les cellules MCF-7, le NaBu a induit de façon significative ces enzymes anti-oxydantes, à l’exception des GSTs, de même que la catalase, une enzyme indépendante de ce système. Les expériences visant à libérer le pool de GSH lié aux protéines ont montré que la déplétion du GSH intracellulaire est parallèle à celle du GSH lié aux protéines. Par conséquent, la consommation du GSH est réellement la cause de la chute du niveau de GSH générant un stress oxydant. La doxorubicine, un inhibiteur des topoisomérases, a une utilisation clinique limitée en raison de ses effets secondaires irréversibles (cardiotoxicité entre autres). Dans le but d’améliorer son efficacité, nous avons expérimenté des combinaisons NaBu/doxorubicine sur les cellules VCREMS et MCF-7, étant donné la capacité du NaBu à induire l’expression des topoisomérases et favoriser la conformation déployée de la chromatine. L’utilisation de la technique isobologramme nous a permis de déterminer les index de combinaison pour une application simultanée ou séquentielle des drogues. Les résultats indiquent que le NaBu sensibilise les cellules VCREMS et MCF-7 à l’action de la doxorubicine. Dans les cellules VCREMS, cet effet s’est produit en dépit de la stimulation des enzymes de détoxication, GSTs et GPX. L’ensemble de ces résultats indique que l’utilisation du NaBu en combinaison avec certains anticancéreux constitue une stratégie très intéressante en cancérothérapie.

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Atherosclerosis is a complex inflammatory disease in which oxidative stress is a major protagonist in the development and progression of the atherosclerotic plaque. All biochemical analysis studies of plaque over the past fifteen years have been carried out on whole plaque with no attempt to localise sites of differing biochemical conditions. This study set out to identify in oxidation levels and inflammatory markers in relation to spatial localisation within the plaque. Advanced plaque samples removed during endarectomy were obtained from the Christchurch Hospital Department of surgery and were dissected into 3-5 mm sections along the longitudinal axis prior to analysis. Samples were analysed for vitamin E, neopterin, total cholesterol and markers of oxidative damage to protein and lipids. Neopterin is a marker of inflammation as it is released by activated macrophages yet it has never been measured in plaques. Initial analysis showed that the acid precipitation method for removing protein from samples prior to HPLC neopterin analysis was causing a significant loss in neopterin. A new acetonitrile based protein removal procedure was developed. Markers of oxidative stress and inflammation where shown to vary across the length of an atherosclerotic plaque. This variation allows for localized incidences of high and low radical flux and microenvironments of depleted antioxidants or areas in which the prooxidative actions of molecular components are favoured. Significant correlations were rarely seen in more then one plaque and trends found in the combined data set generally did not hold true in individual plaques. This reflects upon the complexity of the disease, especially at this advanced stage in which the biochemical morphology of individual plaques is extremely diverse. Separation of the plaques into pre-, post-, and bifurcation areas did produce some trends. These can be related to shear stress variations in the blood flow; further investigations into the biochemical differences between these areas may provide a better understanding of the growth and development of the atherosclerotic plaque.

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