Transposable elements (TEs) are mobile DNA sequences that are a source of mutations and can target specific sites in host genome. Understanding the molecular mechanisms of TE target site preferences is a fundamental challenge in functional and evolutionary genomics. Here we used accurately mapped TE insertions in the Drosophila melanogaster genome, from large-scale gene disruption and resequencing projects, to better understand TE insertion site mechanisms. First we test predictions of the palindromic target site model for DNA transposon insertion using artificially generated P-element insertions. We provide evidence that the P-element targets a 14 bp palindromic motif that can be identified at the primary sequence level that differs significantly from random base composition in the D. melanogaster genome. This sequence also predicts local spacing, hotspots and strand orientation of P-element insertions. Next, we combine artificial P-element insertions with data from genome- wide studies on sequence properties of promoter regions, in an attempt to decode the genomic factors associated with P-element promoter targeting. Our results indicate that the P-element insertions are affected by nucleosome positioning and the presence of chromatin marks made by the Polycomb and trithorax protein groups. We provide the first genome-wide study which shows that core promoter architecture and chromatin structure impact P-element target preferences shedding light on the nuclear processes that influence its pattern of TE insertions across the D. melanogaster genome. In an effort to understand the natural insertion preferences of a wide range of TEs, we then used genome resequencing data to identify insertions sites not present in the reference strain. We found that both Illumina and 454 sequencing platforms showed consistent results in terms of target site duplication (TSD) and target site motif (TSM) discovery. We found that TSMs typically extend the TSD and are palindromic for both DNA and LTR elements with a variable center that depends on the length of the TSD. Additionally, we found that TEs from the same subclass present similar TSDs and TSMs. Finally, by correlating results on P-element insertion sites from natural strains with gene disruption experiments, we show that there is an overlap in target site preferences between artificial and natural insertion events and that P-element targeting of promoter regions of genes is a natural characteristic of this element that is influenced by the same features has the artificially generated insertions. Together, the results presented in this thesis provide important new findings about the target preferences of TEs in one of the best-studied and most important model organisms, and provide a platform for understanding target site preferences of TEs in other species using genomic data.

No description available.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε μια φυλοσύνδετη θερμοευαίσθητη μετάλλαξη, η wiser, η οποία προέκυψε από μια δυσγενική διασταύρωση με το 23.5 hobo MRF στέλεχος και οφείλεται σε ένθεση Ρ στοιχείου στη θέση 7Ε του Χ χρωμοσώματος. Μελέτες βιωσιμότητας έδειξαν ότι τα κρίσιμα στάδια στα οποία η μετάλλαξη επιφέρει το θάνατο των ατόμων είναι της προνύμφης και της νύμφης. Στο στάδιο της νύμφης στους 29οC τα άτομα πεθαίνουν λίγο πριν ή κατά τη διάρκεια της εκκόλαψης των ακμαίων ατόμων. Η Ρ ένθεση εντοπίζεται στην 5’ ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου CG32711. Το γονίδιο CG32711 δίνει δύο μετάγραφα που προκύπτουν από εναλλακτική συρραφή και όχι ένα όπως προβλέπεται στη Flybase. Η προβλεπόμενη μεταφραζόμενη περιοχή είναι κοινή και για τα δύο μετάγραφα. Η ανάλυση κατά Western αποκάλυψε ότι το γονίδιο μεταφράζεται και δίνει δύο πρωτεϊνικές ισομορφές με μοριακό βάρος περίπου 8 και 9 kD. Με βάση τη δομή της πρωτεΐνης, η ισομορφή των 9 kD πρέπει να οφείλεται σε μετα-μεταφραστική τροποποίηση. Στα κανονικά άτομα στα στάδια της προνύμφης εκφράζεται η ισομορφή των 8 kD, της νύμφης και οι δύο και στα ακμαία η ισομορφή των 9 kD. Ο μεταλλαγμένος φαινότυπος στο στέλεχος wiser πρέπει να οφείλεται στην μη σωστή έκφραση της ισομορφής των 9 kD κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Από τα αποτελέσματα της RNA in situ υβριδοποίησης, της ανοσοϊστοχημείας και της εκτοπικής έκφρασης προκύπτει ότι το γονίδιο εμπλέκεται στη γλοιογένεση, την ανάπτυξη του τραχειακού συστήματος, των αιμοκυττάρων, τη μορφογένεση των φτερών, των ποδιών και των ματιών και είναι απαραίτητο για τη βιωσιμότητα των ατόμων. Η πρωτεΐνη CG32711 μπορεί να δρα ως ενδιάμεσο μόριο σε ένα ευρύτερο μονοπάτι ενεργοποίησης άλλων μορίων που επηρεάζουν τις παραπάνω λειτουργίες. Εκτοπική έκφραση της προβλεπόμενης μεταφραζόμενης περιοχής του γονιδίου οδήγησε σε λειτουργική πρωτεΐνη. Εκφραζόμενη υπό τον έλεγχο της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου apmd544 οδήγησε στην εκκόλαψη ακμαίων ατόμων wiser στους 29οC. Υπερέκφραση της προβλεπόμενης μεταφραζόμενης περιοχής του γονιδίου CG32711 υπό τον έλεγχο των ρυθμιστικών περιοχών των αλληλομόρφων των γονιδίων apmd544 και elavC155 οδήγησε σε υπερέχουσες φαινοτυπικές ανωμαλίες στα φτερά, τα πόδια, τα μάτια και το θώρακα. Γεγονός που δείχνει ότι η έκφραση του γονιδίου είναι δοσοευαίσθητη. Τέλος, στην 5΄ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου CG32711 υπάρχουν περιοχές με διαφορετικές ιδιότητες. Δύο άλλες Ρ ενθέσεις (οι PL26 και PL28) σε διαφορετικές θέσεις της οδηγούν σε θανατογόνες μεταλλάξεις με διαφορετικές ιδιότητες ως προς το πρότυπο έκφρασης. / In the present study we describe the genetic, molecular and developmental properties of an X-linked temperature sensitive mutation in Drosophila melanogaster. The mutant flies emerged at 19oC have incised wings, smaller and rough eyes. For this reason we have named the mutation wiser (wings scalloped-eyes rough). At 29oC the mutation is lethal. The lethality occurs at the stage of late pupae, just before or during the eclosion of imago. The mutation occurred from a dysgenic cross with the 23.5 hobo MRF strain and is due to a P element insertion at the locus 7E. Viability studies showed that the mutation causes the death of the mutants also at the stage of 3rd instar larvae at 29oC and acts as semi-lethal. The P insertion is located 490bp upstream the predicted coding region of the gene CG32711. The gene is transcribed in two mRNA, not in one as predicted in Flybase. The two transcripts have shown quantitative differences among the developmental stages that where examined in both the mutant strain wiser and the wild-type Canton-s both in 19oC and 29oC. The longer transcript derives from alternative splicing in 260nt of the first intron. The predicted translated region is identical to both transcripts. Western analysis revealed that the gene is translated in two protein isoforms of 8 kD and 9 kD probably due to post-translational modification. The pattern expression of the two isoforms in the wild-type strain is the following: at the stages of 3rd instar larvae and 1st instar pupae the isoform of 8 kD, at the stages of 2nd and 3rd instar pupae both isoforms and in adults just the protein isoform of 9 kD is expressed. The mutant phenotype and properties are due to the abnormal expression of the protein isoform of 9 kD during the development of the mutants. RNA in situ hybridization, immunohistochemistry and ectoping expression of the predicted translated region of the gene CG32711 revealed that the gene plays a functional role in gliogenesis, tracheal and hemocyte development, wing, eye and leg formation and is essential for the survival of the individuals. Ectoping expression of the predicted translated region of the gene CG32711 revealed that the translated protein is functional and when expressed under control of the regulatory region of the gene apterous rescues the mutant flies at 29oC. The function of the gene CG32711 is also dosage-sensitive due to the fact that many individuals carrying phenotype abnormalities in the wings, thorax, eyes and legs were developed by the ectoping expression. Two other lethal mutations PL26 and PL28 are located at the 5´ regulatory region of the gene CG32711. The differences concerning the pattern expression and the properties of these two mutations in relation to those of the wiser mutation, revealed that the three mutations affect the same gene but in a different way.

Thesis (M.S.)--Miami University, Dept. of Zoology, 2006. / Title from first page of PDF document. Includes bibliographical references (p. 56-61).

No description available.