Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La localisation de l'ARNm est un mécanisme post-transcriptionnel régulant l'expression des gènes qui donne un contrôle précis sur la production spatiale et temporelle des protéines. Des milliers de transcrits dans un large éventail d'organismes ou de types cellulaires se sont avérés localisés dans un compartiment sous-cellulaire spécifique. La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae est l'un des organismes modèle les plus étudiés pour comprendre le processus de localisation de l'ARNm. Plus de trente ARNm sont activement transportés et localisés à l'extrémité du bourgeon de la levure bourgeonnante. Dans cet organisme, la localisation des transcrits à l'extrémité du bourgeon, tels que l'ARNm ASH1, dépend de la protéine de liaison à l'ARN She2, qui interagit directement avec les éléments de localisation dans ces ARNm durant leur transcription. She2 est une protéine liant l’ARN non-canonique, qui s’assemble en tétramère pour pouvoir lier l’ARN. Lorsque le complexe ARNm-She2 est exporté vers le cytoplasme, celui-ci interagit avec la protéine She3 et la myosine Myo4, qui transportent le complexe vers le bourgeon. Une fois qu'un ARNm est correctement localisé, sa traduction est activée pour permettre la synthèse locale de sa protéine. Les mécanismes régulant la localisation des ARNm sont encore très peu connus. Cependant, plusieurs évidences suggèrent que la machinerie de localisation peut être régulée par des modifications post-traductionnelles. Dans notre étude, en utilisant une colonne de purification de phosphoprotéines, nous avons constaté que She2 est une phosphoprotéine. Nous avons utilisé une approche de phosphoprotéomique pour identifier les résidus phosphorylés dans She2 in vivo. Nous avons identifié plusieurs nouveaux phosphosites qui affectent la capacité de She2 à favoriser l'accumulation asymétrique de la protéine Ash1. Fait intéressant, plusieurs phosphosites sont présents aux interfaces de dimérisation et de tétramérisation de She2. En nous concentrant sur la position T109, nous montrons qu'un mutant phosphomimétique T109D inhibe l'interaction She2-She2 et diminue l'interaction de She2 avec ses cofacteurs Srp1, She3 et l’ARNm ASH1. Fait intéressant, la mutation T109D réduit considérablement l'expression de She2 et perturbe la localisation de l'ARNm ASH1. Nos résultats montrent que le contrôle de l'oligomérisation de She2 par phosphorylation représente un mécanisme qui régule la localisation de l'ARNm dans la levure bourgeonnante. Dans le but d’identifier la ou les kinases impliquées dans la phosphorylation de She2, nous avons recherché des motifs de reconnaissance de kinases connues parmi les phosphosites que nous avons identifiés. Nous avons trouvé que les résidus T109, S217 et S224 font partie de sites putatifs de la Caséine kinase II (CKII), suggérant que ces positions seraient susceptibles d'être phosphorylés par cette kinase. Un essai de phosphorylation in vitro a révélé que She2 est phosphorylée par CKII au niveau des résidus S217 et S224, mais pas au résidu T109. Nous avons montré que la phosphorylation de la forme monomérique de She2 par CKII in vitro est augmentée par rapport à la forme sauvage tétramérique. De plus, nous avons observé que le domaine C-terminal de She2, qui contient sa séquence de localisation nucléaire (NLS) est phosphorylé par CKII. Cependant, le rôle de la phosphorylation dans le NLS de She2 demeure inconnu. Dans l'ensemble, nos résultats montrent que les modifications post-traductionnelles sur She2 régulent la localisation de l'ARNm chez la levure. Cette étude permettra d'élucider les mécanismes de contrôle de la localisation de l'ARNm chez la levure et comment des modifications post-traductionnelles sur She2 régulent ce processus. / mRNA localization is a post-transcriptional mechanism regulating gene expression that gives precise control over the spatial and temporal production of proteins. Thousands of transcripts in a wide array of organisms or cell types were shown to localize to specific subcellular compartments. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae serves as one of the best model organisms to study the mechanisms of mRNA localization. Over thirty transcripts are actively transported and localized at the bud tip of the budding yeast. In this organism, localization of transcripts to the bud tip, such as the ASH1 mRNA, depends on the RNA-binding protein She2, which is responsible for recognizing localization elements in these mRNAs during transcription. She2 is a non-canonical RNA-binding protein which assembles as a tetramer in order to bind RNA. When the mRNA-She2 complex is exported to the cytoplasm, the protein She3 and myosin Myo4 join the complex to transport it to the bud. Once an mRNA is properly localized, its translation is generally activated to allow the local synthesis of its protein. The mechanisms regulating the localization of mRNAs are still poorly known. Still, several pieces of evidence suggest that post-translational modifications may regulate the localization machinery. Using a phosphoprotein purification column, we found that She2 is a phosphoprotein. We used a phosphoproteomic analysis to identify the phosphorylated residues in She2 in vivo. We identified several new phosphosites that impact the capacity of She2 to promote the asymmetric accumulation of Ash1. Interestingly, several of these phosphosites are present at the dimerization and tetramerization interfaces of She2. Focusing on T109, we show that a phosphomimetic mutant T109D inhibits She2-She2 interaction and decreases the interaction of She2 with its co-interactors Srp1, She3 and ASH1 mRNA. Interestingly, the T109D mutation significantly reduces the expression of She2 and disrupts ASH1 mRNA localization. Altogether, our results show that the control of She2 oligomerization by phosphorylation represents a mechanism that regulates mRNA localization in budding yeast. In order to identify which kinase(s) are involved in She2 phosphorylation, we searched for known kinases recognition motifs among the identified phosphosites. We found that T109, S217 and S224 are putative Casein kinase II (CKII) sites, suggesting that this kinase may phosphorylate these residues. Indeed, an in vitro phosphorylation assay revealed that She2 is phosphorylated by CKII at S217 and S224 but not at T109. We found that the phosphorylation of a monomeric She2 mutant by CKII in vitro is increased compared to the wild-type tetrameric protein. Furthermore, we found that the C-terminal domain of She2, which contains its nuclear localization signal (NLS), is phosphorylated by CKII. However, the biological function of the phosphorylation in the NLS is still unknown. Altogether, our results show that post-translational modifications in She2 regulate mRNA localization in yeast. This study will help elucidate the mechanisms that control mRNA localization in yeast and how post-translational modifications in She2 regulate this process.

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L'expression génique est régulée à de nombreuses étapes de la vie cellulaire. La synthèse des protéines ou traduction, étape ultime de cette expression, est finement régulée. Elle comporte trois phases: l'initiation, l'élongation et la terminaison. L'initiation commence par l'établissement de la sous-unité ribosomique 40S sur cet ARNm qu'elle balaye ensuite jusqu'au codon initiation. Pour cela, des facteurs canoniques sont impliqués. Parmi eux, le facteur eIF3 interagit directement avec celle-ci. Au cours de mes travaux, j'ai étudié dans une première partie l'interaction putative entre le facteur eIF3 et la petite sous-unité ribosomique 40S. Le ribosome est constitué par deux types d'entités : des protéines ribosomiques et l'ARNr. Le facteur eIF3, contient au moins 13 sous-unités, dont deux possèdent un RRM, et sont potentiellement capables de lier cet ARNr via leur RRM: p44 et p116. eIF3p44 a montré auparavant qu'elle pouvait lier l'ARNr 18S. J'ai effectué un criblage d'une banque de fragments de cet ARNr pour identifier un site de liaison de p44 sur la sous-unité 40S. Les ARNm néo-synthétisés sont transportés et localisés afin de permettre l'expression des protéines au moment opportun et en un lieu précis de la cellule. Dans une deuxième partie, j'ai étudié des interactions impliquées dans le contrôle de l'initiation de la traduction d'un ARNm localisé chez la levure S. cerevisiae pendant son transport : l'ARNm ASH1. Il est régulé par Khd1p, protéine à trois domaines KH, qui lie directement un de ses éléments de localisation. Cette interaction est abolie par la phosphorylation de Khd1p lorsque l'ARNm est correctement localisé.

La localisation des ARNm par transport dirigé joue un rôle dans le développement, la motilité cellulaire, la plasticité synaptique et la division cellulaire asymétrique. Chez la levure Saccharomyces cerevisiæ, la localisation d’ARNm est un phénomène dont les mécanismes de régulation sont conservés auprès de nombreux autres organismes. Lors de la division de la levure, plus d’une trentaine de transcrits sont localisés par transport actif à l’extrémité du bourgeon de la cellule-fille. Parmi ceux-ci, l’ARNm ASH1 est le mieux caractérisé et constitue le modèle utilisé dans cette étude. Pour exercer sa fonction, la protéine Ash1 doit être produite uniquement après la localisation de l’ARNm ASH1. Pour ce faire, les mécanismes de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 empêchent son expression durant le transport. Ce projet de recherche vise à étudier les mécanismes de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 par les répresseurs traductionnels connus, soit Khd1, Puf6 et Loc1. Les études antérieures se sont penchées sur ces facteurs de manière individuelle. Cependant, dans cette étude, nous avons exploré la présence d’une collaboration entre ceux-ci. Ainsi, nous avons voulu déterminer si les répresseurs traductionnels peuvent être intégrés en une seule voie de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1. De plus, nous avons cherché à identifier le mécanisme de recrutement des répresseurs traductionnels sur l’ARNm ASH1, qui correspond au point initial des voies de régulations de l’ARNm ASH1. Nos résultats montrent que les répresseurs traductionnels de l’ARNm ASH1, soit Khd1 et Puf6, font partie d’une même voie de régulation de la traduction. Le rôle du facteur nucléaire Loc1 dans la voie de régulation de la traduction, quant à elle, a été examinée à partir d’expériences permettant l’étude du mécanisme de recrutement des répresseurs traductionnels dans le noyau. Ainsi, nos travaux montrent que Puf6 et Loc1 sont associés de manière ARN-dépendant avec la machinerie de transcription, notamment au facteur d’élongation de la transcription Spt4-Spt5/DSIF. Par ailleurs, notre laboratoire a précédemment montré que la localisation nucléaire de la protéine de liaison à l’ARN She2 est essentielle au recrutement des facteurs Loc1 et Puf6 sur l’ARNm ASH1. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) supportent l’hypothèse que le recrutement de Loc1 est essentiel à celui de Puf6, qui s’effectue ultérieurement. Ainsi, à partir des résultats de cette étude et des résultats publiés précédemment dans notre laboratoire, nous avons élaboré un modèle de recrutement coordonné des facteurs She2, Loc1 et Puf6 sur l’ARNm ASH1 naissant. De manière générale, cette étude a permis d’établir la présence d’une seule voie de régulation de la traduction de l’ARNm ASH1 et une meilleure connaissance du recrutement des facteurs de répression traductionnelle sur celui-ci. / Directed transport mRNA localization play a role in the development, the cell motility, the synaptic plasticity and asymmetric cellular division. In the yeast Saccharomyces cerevisiæ, this regulation mechanism is conserved among many other species. During yeast cell division, around thirty mRNA are actively localized at the bud tip in the daughter cell. ASH1 mRNA is the best known among them and constitutes the model used in this study. In this model, Ash1 expression is possible only after proper localization of its mRNA. In order to do so, ASH1 mRNA translation is repressed by translational repressors during its active transport. This project investigates the mechanism of ASH1 mRNA translational regulation that is carried out by the translational repressors Khd1, Puf6 and Loc1. Previous studies characterized the action of these factors individually. However, in this study, we now explored the possibility of a collaboration between them. Thus, we sought to determine if these translational repressors are part of the same ASH1 mRNA translational regulation pathway. In addition, we tried to identify the mechanisms of recruitment of these translational repressors on ASH1 mRNA, the molecular mechanisms that initiates this process. In this work, we show that the cytoplasmic translational repressors Khd1 and Puf6 are part of the same ASH1 mRNA translational regulation pathway. In this pathway, the role of the nuclear translational factor Loc1 was determined by the analysis of translational factors recruitment on ASH1 in the nucleus. We demonstrate that Puf6 and Loc1 interact in an RNA-dependent manner with the transcription machinery, via the transcription elongation factor Spt4-Spt5/DSIF. Finally, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays support the model that Loc1 recruitment to nascent ASH1 mRNA is essential for the subsequent recruitment of Puf6 to this transcript. With the results of this study and others previously done in the lab, we elaborated a recruitment model for the She2, Loc1 and Puf6 proteins on the nascent ASH1 mRNA. In conclusion, this study has established that the translational repressors Khd1, Puf6 and Loc1 are part of the same ASH1 mRNA translational regulation pathway and allowed a better understanding of the mechanism of recruitment of translational repressors on their target mRNA.

Le transport et la localisation des ARN messagers permettent de réguler l’expression spatiale et temporelle de facteurs spécifiques impliqués dans la détermination du destin cellulaire, la plasticité synaptique, la polarité cellulaire et la division asymétrique des cellules. Chez S.cerevisiæ, plus de trente transcrits sont transportés activement vers le bourgeon cellulaire. Parmi ces transcrits, l’ARNm ASH1 (asymetric synthesis of HO) est localisé à l’extrémité du bourgeon pendant l’anaphase. Ce processus va entrainer une localisation asymétrique de la protéine Ash1p, qui sera importée uniquement dans le noyau de la cellule fille, où elle entraine le changement de type sexuel. La localisation asymétrique de l’ARNm ASH1, et donc de Ash1p, implique la présence de différents facteurs de localisation. Parmi ces facteurs, les protéines She (She1p/Myo4p, She2p et She3p) et les répresseurs traductionnels (Puf6p, Loc1p et Khd1p) participent à ce mécanisme. La protéine navette She2p est capable de lier l’ARNm ASH1 et va entrainer le ciblage de cet ARNm vers l’extrémité du bourgeon en recrutant le complexe She3p-Myo4p. Des répresseurs traductionnels régulent la traduction de cet ARNm et évitent l’expression ectopique de la protéine Ash1p pendant son transport. Alors que la fonction cytoplasmique de She2p sur la localisation des ARNm est connue, sa fonction nucléaire est encore inconnue. Nous avons montré que She2p contient une séquence de localisation nucléaire non classique qui est essentielle à son import nucléaire médié par l’importine α (Srp1p). L’exclusion de She2p du noyau par mutation de son NLS empêche la liaison de Loc1p et Puf6p sur l’ARNm ASH1, entrainant un défaut de localisation de l’ARNm et de la protéine. Pour étudier plus en détail l’assemblage de la machinerie de localisation des ARNm dans le noyau, nous avons utilisé des techniques d’immunoprécipitation de chromatine afin de suivre le recrutement des facteurs de localisation et des répresseurs traductionnels sur les ARNm naissants. Nous avons montré que She2p est recruté sur le gène ASH1 pendant sa transcription, via son interaction avec l’ARNm ASH1 naissant. Puf6p est également recruté sur ASH1, mais d’une manière dépendante de la présence de She2p. De façon intéressante, nous avons détecté une interaction entre She2p et la plus grande sous-unité de l’ARN polymérase II (Rpb1p). Cette interaction est détectée avec la forme active en élongation de l’ARN polymérase II. Nous avons également démontré que She2p interagit avec le complexe d’élongation de la transcription Spt4p/Spt5p. Une délétion de SPT4 ou une mutation dans SPT5 (Ts spt5) à température restrictive empêche l’interaction entre She2p et Rpb1p, et diminue le recrutement de She2p au gène ASH1, entrainant un défaut de localisation de l’ARNm et un défaut de localisation asymétrique de la protéine Ash1p. De manière globale, nos résultats montrent que les facteurs impliqués dans la localisation cytoplasmique des ARNm et dans leur contrôle traductionnel sont recrutés de façon co-transcriptionnelle sur les ARNm naissants via leur interaction avec la machinerie de transcription, suggèrant un rôle important de la machinerie transcriptionelle dans la localisation des ARNm. / Cytoplasmic transport and localization of messenger RNAs allows temporal and spatial expression of specific factors involved in cell fate determination, synaptic plasticity, cellular polarity or asymmetric cell division. In S. cerevisiae, over thirty transcripts are actively transported and localized to the bud tip of budding yeast. One of them, the ASH1 mRNA (for Asymmetric Synthesis of HO), is localized at the bud tip in late anaphase cells. This allows Ash1p, a transcriptional repressor of the HO endonuclease, to be sorted exclusively to the daughter cell nucleus, where it prevents mating type switching. Proper ASH1 mRNA localization and Ash1p asymmetric expression involve localization factors, which are part of the She-proteins (She1p/Myo4p, She2p and She3p), and translational repressors (the proteins Puf6, Loc1 and Khd1). The nucleo-cytoplasmic shuttling protein She2p binds the ASH1 mRNA and targets it for localization at the bud tip by recruiting the She3p-Myo4p complex. Translational repressors regulate the translation of ASH1 mRNA and avoid ectopic expression of the Ash1 protein during the transport of its transcript. While the cytoplasmic role of She2p in mRNA localization is known, its nuclear function is still unclear. We now show that She2p contains a non-classical nuclear localization signal sequence (NLS) which is essential for its nuclear import via the importin  Srp1p. Exclusion of She2p from the nucleus by mutagenesis of its NLS disrupt the binding of Loc1p and Puf6p to the ASH1 mRNA, leading to defective mRNA localization and Ash1p sorting. To further investigate the assembly of the mRNA localization machinery in the nucleus, we used chromatin immunoprecipitation (ChIP) to follow the recruitment of localization factors and translational repressors on nascent localized mRNAs. We found that She2p is recruited on the ASH1 gene during transcription, via its interaction with the nascent ASH1 mRNA. Puf6p is also recruited on the ASH1 gene, but in a She2p-dependent manner. Interestingly, we detected an interaction between She2p and Rpb1p, the largest subunit of RNA polymerase II in vivo. This interaction is independent of the RNA-binding properties of She2p, and involves the elongating form of the RNA polymerase II. We also found that She2p interacts with both members of the elongation factors Spt4p /Spt5p; Deletion of SPT4 or Ts spt5 mutants at restrictive temperature disrupted the interaction between She2p and Rpb1p, and then reduced the recruitment of She2p on the ASH1 gene, resulting in ASH1 mRNA delocalization and defective Ash1p sorting. Altogether, our results show that factors involved in cytoplasmic mRNA localization and translational control are recruited co-transcriptionally on nascent mRNAs via interation with the transcription machinery, pointing toward a role of the transcription machinery in the mRNA localization process.

Le transport et la localisation des ARN messagers permettent de réguler l’expression spatiale et temporelle de facteurs spécifiques impliqués dans la détermination du destin cellulaire, la plasticité synaptique, la polarité cellulaire et la division asymétrique des cellules. Chez S.cerevisiæ, plus de trente transcrits sont transportés activement vers le bourgeon cellulaire. Parmi ces transcrits, l’ARNm ASH1 (asymetric synthesis of HO) est localisé à l’extrémité du bourgeon pendant l’anaphase. Ce processus va entrainer une localisation asymétrique de la protéine Ash1p, qui sera importée uniquement dans le noyau de la cellule fille, où elle entraine le changement de type sexuel. La localisation asymétrique de l’ARNm ASH1, et donc de Ash1p, implique la présence de différents facteurs de localisation. Parmi ces facteurs, les protéines She (She1p/Myo4p, She2p et She3p) et les répresseurs traductionnels (Puf6p, Loc1p et Khd1p) participent à ce mécanisme. La protéine navette She2p est capable de lier l’ARNm ASH1 et va entrainer le ciblage de cet ARNm vers l’extrémité du bourgeon en recrutant le complexe She3p-Myo4p. Des répresseurs traductionnels régulent la traduction de cet ARNm et évitent l’expression ectopique de la protéine Ash1p pendant son transport. Alors que la fonction cytoplasmique de She2p sur la localisation des ARNm est connue, sa fonction nucléaire est encore inconnue. Nous avons montré que She2p contient une séquence de localisation nucléaire non classique qui est essentielle à son import nucléaire médié par l’importine α (Srp1p). L’exclusion de She2p du noyau par mutation de son NLS empêche la liaison de Loc1p et Puf6p sur l’ARNm ASH1, entrainant un défaut de localisation de l’ARNm et de la protéine. Pour étudier plus en détail l’assemblage de la machinerie de localisation des ARNm dans le noyau, nous avons utilisé des techniques d’immunoprécipitation de chromatine afin de suivre le recrutement des facteurs de localisation et des répresseurs traductionnels sur les ARNm naissants. Nous avons montré que She2p est recruté sur le gène ASH1 pendant sa transcription, via son interaction avec l’ARNm ASH1 naissant. Puf6p est également recruté sur ASH1, mais d’une manière dépendante de la présence de She2p. De façon intéressante, nous avons détecté une interaction entre She2p et la plus grande sous-unité de l’ARN polymérase II (Rpb1p). Cette interaction est détectée avec la forme active en élongation de l’ARN polymérase II. Nous avons également démontré que She2p interagit avec le complexe d’élongation de la transcription Spt4p/Spt5p. Une délétion de SPT4 ou une mutation dans SPT5 (Ts spt5) à température restrictive empêche l’interaction entre She2p et Rpb1p, et diminue le recrutement de She2p au gène ASH1, entrainant un défaut de localisation de l’ARNm et un défaut de localisation asymétrique de la protéine Ash1p. De manière globale, nos résultats montrent que les facteurs impliqués dans la localisation cytoplasmique des ARNm et dans leur contrôle traductionnel sont recrutés de façon co-transcriptionnelle sur les ARNm naissants via leur interaction avec la machinerie de transcription, suggèrant un rôle important de la machinerie transcriptionelle dans la localisation des ARNm. / Cytoplasmic transport and localization of messenger RNAs allows temporal and spatial expression of specific factors involved in cell fate determination, synaptic plasticity, cellular polarity or asymmetric cell division. In S. cerevisiae, over thirty transcripts are actively transported and localized to the bud tip of budding yeast. One of them, the ASH1 mRNA (for Asymmetric Synthesis of HO), is localized at the bud tip in late anaphase cells. This allows Ash1p, a transcriptional repressor of the HO endonuclease, to be sorted exclusively to the daughter cell nucleus, where it prevents mating type switching. Proper ASH1 mRNA localization and Ash1p asymmetric expression involve localization factors, which are part of the She-proteins (She1p/Myo4p, She2p and She3p), and translational repressors (the proteins Puf6, Loc1 and Khd1). The nucleo-cytoplasmic shuttling protein She2p binds the ASH1 mRNA and targets it for localization at the bud tip by recruiting the She3p-Myo4p complex. Translational repressors regulate the translation of ASH1 mRNA and avoid ectopic expression of the Ash1 protein during the transport of its transcript. While the cytoplasmic role of She2p in mRNA localization is known, its nuclear function is still unclear. We now show that She2p contains a non-classical nuclear localization signal sequence (NLS) which is essential for its nuclear import via the importin  Srp1p. Exclusion of She2p from the nucleus by mutagenesis of its NLS disrupt the binding of Loc1p and Puf6p to the ASH1 mRNA, leading to defective mRNA localization and Ash1p sorting. To further investigate the assembly of the mRNA localization machinery in the nucleus, we used chromatin immunoprecipitation (ChIP) to follow the recruitment of localization factors and translational repressors on nascent localized mRNAs. We found that She2p is recruited on the ASH1 gene during transcription, via its interaction with the nascent ASH1 mRNA. Puf6p is also recruited on the ASH1 gene, but in a She2p-dependent manner. Interestingly, we detected an interaction between She2p and Rpb1p, the largest subunit of RNA polymerase II in vivo. This interaction is independent of the RNA-binding properties of She2p, and involves the elongating form of the RNA polymerase II. We also found that She2p interacts with both members of the elongation factors Spt4p /Spt5p; Deletion of SPT4 or Ts spt5 mutants at restrictive temperature disrupted the interaction between She2p and Rpb1p, and then reduced the recruitment of She2p on the ASH1 gene, resulting in ASH1 mRNA delocalization and defective Ash1p sorting. Altogether, our results show that factors involved in cytoplasmic mRNA localization and translational control are recruited co-transcriptionally on nascent mRNAs via interation with the transcription machinery, pointing toward a role of the transcription machinery in the mRNA localization process.