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Pseudomonas syringae is a pathogen of numerous plant species, including several economically important crops. P. syringae pv. syringae B728a is a resident on leaves of common bean, where it utilizes several well-studied virulence factors, including secreted effectors and toxins, to develop a pathogenic interaction with its host. The B728a genome was recently sequenced, revealing the presence of 1,297 genes with unknown function. This dissertation demonstrates that a 29.9-kb cluster of genes in the B728a genome encodes a novel secretion pathway, the type VI secretion system (T6SS), that functions to deliver at least one protein outside of the bacterial cell. Western blot analyses show that this secretion is dependent on clpV, a gene that likely encodes an AAA+ ATPase, and is repressed by retS, which apparently encodes a hybrid sensor kinase. RetS and a similar protein called LadS are shown to collectively modulate several virulence-related activities in addition to the T6SS. Plate assays demonstrate that RetS negatively controls mucoidy, while LadS negatively regulates swarming motility. A mutation in retS affects B728a population levels on the surface of bean leaves. A model for the LadS and RetS control of B728a virulence activities is proposed, and possible roles for the B728a T6SS are addressed.

Pseudomonas syringae pv. syringae B728a, an aggressive bacterial pathogen of bean, utilizes large surface populations and extracellular signaling to initiate a fundamental change from an epiphytic to a pathogenic lifestyle. Extracytoplasmic function (ECF) sigma (σ) factors serve as important regulatory factors in responding to various environmental signals. Bioinformatic analysis of the B728a genome has revealed 10 ECF sigma factors, five of which have high levels of sequence similarity to the FecI-type of ECF sigma factors and play a known role in the regulation of various iron transport systems. Because iron is essential for the induction of major virulence factors in B728a, I hypothesized that these FecI-type sigma factors may play a critical role in the bacterium’s transition between lifestyles. Deletion mutants of two FecI-type sigma factors, Psyr_1040 and Psyr_1107, in B728a have been created using homologous recombination based on the phage λ Red recombinase method. This study shows that the B728a FecI-type sigma factors, Psyr_1040 and Psyr_1107 are affected by conditions of iron stress, and influence the expression of putative outer membrane receptors and transmembrane sensors associated with these genes. Moreover, Psyr_1107 contributes to the expression of a cluster of predicted pili assembly genes downstream of it. Mutations in Psyr_1040 and Psyr_1107 affect the population levels of B728a in bean plants, since in planta growth of deletion mutants of B728a lacking Psyr_1040 and Psyr_1107 appears to be slower than wild-type B728a. In this thesis, the possible roles of Psyr_1040 and Psyr_1107 in the adaptation of B728a to a pathogenic lifestyle are addressed using a combination of phenotypic characterization and quantitative real-time PCR (qRT-PCR) analyses.

Les plantes dans leur milieu naturel, sont constamment soumises à de multiples contraintes environnementales de nature biotique ou abiotique qui sont à l'origine de nombreuses pertes de rendement. Afin de répondre à ces stress, les plantes mettent en place des réponses adaptées qui reposent sur l'activation de voies de signalisations. L'une des voies importantes est celle impliquant la phosphorylation des protéines par les Mitogen Activated Protein Kinase (MAPKs). La régulation de l'activité des MAPKs est indispensable et dépend en partie de protéines phosphatases telles que les MAPK Phosphatases (MKPs). Ce travail a consisté à étudier les mécanismes de régulation de l'activité phosphatase de TMKP1, la seule MKP connue de blé dur, par les calmodulines et les protéines 14-3-3. Dans un premier temps, nous avons montré que l'activité phosphatase de TMKP1 est stimulée en présence des ions K+, Li+, Mg 2+ et surtout par le Mn2+. Des expériences de GST pull dawn ont permis de mettre en évidence une interaction, calcium dépendante, entre TMKP1 et la calmoduline (CaM) et nous avons démontré que l'activité de TMKP1 est inhibée par le complexe CaM/Ca2+. En revanche, ce même complexe stimule l'activité de TMKP1 en présence des ions Mn 2+. Ce mode de régulation d'une MKP par CaM/Ca2+ dépendant des ions Mo2+ est décrit ici pour la première fois. Dans un second temps, la présence au niveau de la séquence de TMKP1 d'un domaine de liaison aux protéines 14-3-3s, nous a incité à mener des essais d'immunoprécipitation à l'issue desquelles nous avons montré que TMKP1 pourrait interagir avec les 14-3-3s chez le Blé et que celles-ci stimulent l'activité phosphatase de TMKP1 in vitro. Enfin, l'implication de TMKP1 dans la réponse des plantes aux stress biotiques et abiotiques a été évaluée. Les tests de gennination ont révélé que la sur-expression de TMKP1 chez Arabidopsis permet une meilleure tolérance à la salinité. Ces mêmes plantes semblent également être plus résistantes à une infection bactérienne causée par Pseudomonas syringae que des plantes sauvages. Ces données suggèrent que TMKP1 agirait comme régulateur positif de la réponse d'Arabidopsis au stress salin et à l'infection P. syringae. L'ensemble des résultats obtenus ici a permis de dévoiler de nouvelles propriétés jamais décrites chez une MKP végétale et offre une nouvelle vision sur le rôle de ces phosphatases dans le contrôle des voies de signalisations MAPKs impliquées dans la réponse des plantes aux stress de l'environnement. / Due to their sessile lifestyle, plants are constantly subjected to a variety of biotic and abiotic stresses causing tremendous yield losses. To survive under these conditions, plants have evolved different sigualing pathways allowing efficient stress responses. The Mitogen Activated Protein Kinase (MAPKs) are key sigual transduction molecules, which respond to varions external stimuli. However, the activity of MAPKs has to be strictly regulated by protein phosphatase such as MAPK Phosphatase (MKPs). ln the present study we describe the regulation ofTMKPI, a wheat MKP, by Calmodulins (CaM) and 14-3-3 proteins. We fust showed that phosphatase activity oTMKP1 is stimulated by K\ Li\ Mg2+ and especially by Mo2+. Using GST pull dawn assays, we demonstrated that TMKP1 binds to CaM in a Ca2+-dependent manner. Moreover, the CaM/Ca2+ complex inhibits the catalytic activity of TMKP1 in a CaM-dose dependent marmer. However, in the presence of Mo2+, this activity is enhanced by CaM/Ca2+ complex. Such effects were not reported so far, and raise a possible role for CaM and Mo 2+ in the regulation of plant MKPs during cellular response to extemal siguals. Moreover, a fine sequence analysis ofTMKPl revealed the presence of a conserved 14-3-3 mode 1 binding site. This finding incited us to perfonn co-immunoprecipitation assays on wheat protein extracts through which we provide proof-of-concept evidence for interaction of TMKP1 with 14-3-3 proteins. Interestingly, the phosphatase activity of TMKP1 was shawn to be enhanced by several plant and yeast 14-3-3 isoforms. Finally, the involvement of TMKP1 in plant stress responses was evaluated. Our data showed that the overexpression of TMKP1 in Arabidopsis resulted in a higher tolerance to salt stresses and to bacterial infection caused by P. syringae. Such findings suggest thal TMKP1 may act as a positive regulator of Arabidopsis responses to salt stresses and P. syringae infection. All together, our results provide novel functional properties for plant MKPs, and should add new knowledge to our understanding of the raie of these phosphatases in the control of MAPK signaling pathways controlling plant responses to various environmental stresses.

Caractériser la dissémination des bio-agresseurs est un enjeu majeur pour la gestion et la prédiction des maladies en santé des plantes. Face aux limites des approches usuelles en pathologie végétale, une nouvelle vision a été proposée abordant les paradigmes d’histoire de vie des agents phytopathogènes en dehors des limites du système hôte-pathogène. Parmi ces agents phytopathogènes, les études sur P.syringae sont celles qui ont contribuées le plus à ce nouveau courant de pensée et dont on connaît le mieux l’histoire de vie en relation avec ses réservoirs « non hôtes ». L’espèce est détectée dans de nombreux compartiments du cycle de l’eau, des précipitations jusqu’aux rivières et eaux d’irrigation, en passant par les plantes sauvages et le manteau neigeux. L’ensemble de ces observations ont soulevé de nouvelles questions sur la manière dont P. syringae se dissémine au travers de ces environnements et sur les processus impactant sur la dynamique des populations à l’échelle d’un bassin versant. Ces recherches se sont donc intéressées à ses processus dans des précipitations jusqu’aux cours d’eau alpins dans l’optique d’acquérir des données pour la modélisation des flux de P. syringae. Elles ont mis en évidence les populations résidentes de la litière et la survie sa survie dans le sol, processus jamais identifiés à l’histoire de vie de P. syringae. Elles ont également caractérisé (i) les conditions propices à son transport via les précipitations, (ii) le rôle du manteau neigeux comme réservoir et protecteur des populations des prairies alpines et (iii) ont mis en évidence la chimie de l’eau comme indicateur témoin de la dynamique des populations des les rivières. Ces observations suggérant un transport de P. syringae dans le sol, nous l’avons quantifiée à travers des études de terrain et des simulations en laboratoire.Enfin, l’ensemble des données de ces recherches couplées à des outils SIG et des modèles météorologiques et hydrologiques ont permis de proposé un modèle sur les flux de P.syringae des habitats naturels vers les agro-systèmes. / The characterization of the spread of bio-agressors spread is a major issue for themanagement of plant health and the prediction of disease emergence. Given thelimitations of conventional approaches in plant pathology, a new vision has beenproposed addressing paradigms life history of plant pathogens outside the limits of thecrop host-pathogen system. Among the plant pathogens, studies on P. syringae are thosethat have contributed the most to this new way of thought for which life history inrelation to "non host" reservoirs has been highlighted. The species is found in manycompartments of the water cycle, from precipitation to rivers and irrigation water, wildplants and snowpack. All these observations have raised new questions about how P.syringae spreads through these environments and on the processes impactingpopulation dynamics at the scale of a watershed. This research was therefore interestedin these processes with the objective to acquire data for modeling the tranfer of P.syringae through the watershed. They highlighted the resident populations of litter andtheir survival in the soil, processes never identified in association with the life history ofP. syringae. They also revealed (i) the conditions for transport via precipitations, (ii) therole of snowpack as a reservoir and protector of the populations in alpine meadows and(iii) showed that water chemistry can be used as an indicator of the populationdynamics in headwaters. These observations suggested a transport of P. syringae via thesoil that we subsequently characterized through field studies and laboratorysimulations. Finally, all data from this research combined with GIS tools andmeteorological and hydrological models have permitted us to propose a model of theflux of P. syringae of natural habitats to agricultural systems.

Caractériser la dissémination des bio-agresseurs est un enjeu majeur pour la gestion et la prédiction des maladies en santé des plantes. Face aux limites des approches usuelles en pathologie végétale, une nouvelle vision a été proposée abordant les paradigmes d'histoire de vie des agents phytopathogènes en dehors des limites du système hôte-pathogène. Parmi ces agents phytopathogènes, les études sur P.syringae sont celles qui ont contribuées le plus à ce nouveau courant de pensée et dont on connaît le mieux l'histoire de vie en relation avec ses réservoirs " non hôtes ". L'espèce est détectée dans de nombreux compartiments du cycle de l'eau, des précipitations jusqu'aux rivières et eaux d'irrigation, en passant par les plantes sauvages et le manteau neigeux. L'ensemble de ces observations ont soulevé de nouvelles questions sur la manière dont P. syringae se dissémine au travers de ces environnements et sur les processus impactant sur la dynamique des populations à l'échelle d'un bassin versant. Ces recherches se sont donc intéressées à ses processus dans des précipitations jusqu'aux cours d'eau alpins dans l'optique d'acquérir des données pour la modélisation des flux de P. syringae. Elles ont mis en évidence les populations résidentes de la litière et la survie sa survie dans le sol, processus jamais identifiés à l'histoire de vie de P. syringae. Elles ont également caractérisé (i) les conditions propices à son transport via les précipitations, (ii) le rôle du manteau neigeux comme réservoir et protecteur des populations des prairies alpines et (iii) ont mis en évidence la chimie de l'eau comme indicateur témoin de la dynamique des populations des les rivières. Ces observations suggérant un transport de P. syringae dans le sol, nous l'avons quantifiée à travers des études de terrain et des simulations en laboratoire.Enfin, l'ensemble des données de ces recherches couplées à des outils SIG et des modèles météorologiques et hydrologiques ont permis de proposé un modèle sur les flux de P.syringae des habitats naturels vers les agro-systèmes.