Les bactéries pathogènes coordonnent de manière très stricte l’expression de leurs facteurs de virulence en fonction de leur état métabolique, des conditions externes et de l’état de l’hôte. La topologie du chromosome bactérien est également modulée par les conditions environnementales et l’état métabolique des cellules. Le surenroulement de l’ADN, est considéré désormais comme un élément clé de la régulation de l’expression génique. L’objectif de cette thèse est d’identifier les acteurs essentiels de la réponse aux conditions rencontrées durant l’infection chez la bactérie phytopathogène Dickeya dadantii, responsable de la pourriture molle d’une large gamme d’hôtes. Les symptômes de pourriture molle sont principalement associés à la synthèse d'enzymes extracellulaires, en particulier les pectinases qui vont dégrader la paroi des cellules végétales. Cependant une colonisation efficace de la plante requiert de nombreux facteurs additionnels. L’analyse du transcriptome de D. dadantii dans 32 conditions de culture proches de celles rencontrées lors du cycle infectieux a révélé qu’en moyenne 63% des gènes sont exprimés dans chacune des conditions testées alors que 82% des gènes sont exprimés dans au moins une des conditions analysées. Deux facteurs modifient profondément l’expression génique: la phase de croissance et la nature des stress appliqués. L’analyse des gènes différentiellement exprimés a permis d’établir des signatures transcriptionnelles et fonctionnelles spécifiques de chaque stress et d’identifier de nouveaux régulateurs potentiellement impliqués dans la survie aux stress. L’adaptation au stress acide étant peu connue chez les pathogènes de plante, la régulation de quelques gènes spécifiquement induits en stress acide a été approfondie. Ces études ont révélé que le régulateur OmpR est un élèment clé de la réponse au stress acide chez Dickeya. Afin d’établir un lien entre réponse aux stress et impact de la topologie de l’ADN et des NAPs, les profils transcriptionnels obtenus lors des stress ont été comparés à ceux obtenus dans des conditions de relaxation artificielle de l’ADN et chez des mutants fis ou hns. La distribution chromosomique des GDE a révélé des profils cohérents de gènes activés ou réprimés lors des variations de conditions environnementales quelque soit le milieu de culture utilisé et l’existence de patchs d’expression qui illustre l’organisation en domaines du chromosome bactérien.L’expression des gènes au sein des domaines est dépendante de leur propriété thermodynamique, de leur préférence vis à vis du surenroulement, et de leur réponse aux NAPs. Ainsi, Dickeya tire partie des variations topologiques de l’ADN au cours de l’infection pour coordonner son programme de virulence. Ces résultats illustrent la complexité des processus utilisés par D. dadantii pour s’adapter aux conditions de l’infection et coloniser ses hôtes. / Pathogenic bacteria strictly coordinate the expression of their virulence factors according to their metabolic states, external conditions and the host environment. The topology of the bacterial chromosome is also modulated by environmental conditions and the metabolic state of the cells. The DNA supercoiling is now considered as a key factor in the regulation of gene expression. The objective of this thesis is to provide a comprehensive picture of the Dickeya infection process by integrated analyses of gene expression patterns obtained under various stress conditions encountered by this pathogen in the course of infection. Dickeya dadantii is a plant pathogenic bacterium that causes soft-rot disease in a wide range of plant species. Soft rot symptoms are mainly associated with the synthesis of extracellular enzymes, particularly pectinases which degrade the plant cell wall. However, an effective colonization of the plant requires a number of additional factors. The transcriptome analysis of D. dadantii, grown in a suite of thirty-two different growth conditions similar to those conditions encountered during the infection cycle revealed that an average of 63% of genes was expressed in each individual condition, while 82% of genes are expressed in at least one of the analyzed conditions. Two factors profoundly alter gene expression: the growth phase and the nature of applied stress. Analysis of differentially expressed genes in this work has established specific transcriptional and functional signatures of each stress and proposed new regulators potentially involved in survival under stress conditions. In this way, we obtained the apparent « temporal map » of the bacterial responses to sequential stress conditions encountered during the infection. The chromosomal distribution of DEG revealed coherent patches of genes activated or repressed during changes in environmental conditions and highlighted a rational organization of the DEG in the chromosomal space. Gene expression within the chromosomal domains is dependent on primary sequence organisation, DNA thermodynamic stability, supercoil dynamics, and binding effects of two abundant nucleoid associated proteins, FIS and H-NS. Therefore, Dickeya takes advantage of DNA topological variations during the infection to coordinate its virulence program. These results illustrate the complexity of mechanisms used by D. dadantii to adapt to stress conditions and colonize its hosts.

Caractériser la dissémination des bio-agresseurs est un enjeu majeur pour la gestion et la prédiction des maladies en santé des plantes. Face aux limites des approches usuelles en pathologie végétale, une nouvelle vision a été proposée abordant les paradigmes d'histoire de vie des agents phytopathogènes en dehors des limites du système hôte-pathogène. Parmi ces agents phytopathogènes, les études sur P.syringae sont celles qui ont contribuées le plus à ce nouveau courant de pensée et dont on connaît le mieux l'histoire de vie en relation avec ses réservoirs " non hôtes ". L'espèce est détectée dans de nombreux compartiments du cycle de l'eau, des précipitations jusqu'aux rivières et eaux d'irrigation, en passant par les plantes sauvages et le manteau neigeux. L'ensemble de ces observations ont soulevé de nouvelles questions sur la manière dont P. syringae se dissémine au travers de ces environnements et sur les processus impactant sur la dynamique des populations à l'échelle d'un bassin versant. Ces recherches se sont donc intéressées à ses processus dans des précipitations jusqu'aux cours d'eau alpins dans l'optique d'acquérir des données pour la modélisation des flux de P. syringae. Elles ont mis en évidence les populations résidentes de la litière et la survie sa survie dans le sol, processus jamais identifiés à l'histoire de vie de P. syringae. Elles ont également caractérisé (i) les conditions propices à son transport via les précipitations, (ii) le rôle du manteau neigeux comme réservoir et protecteur des populations des prairies alpines et (iii) ont mis en évidence la chimie de l'eau comme indicateur témoin de la dynamique des populations des les rivières. Ces observations suggérant un transport de P. syringae dans le sol, nous l'avons quantifiée à travers des études de terrain et des simulations en laboratoire.Enfin, l'ensemble des données de ces recherches couplées à des outils SIG et des modèles météorologiques et hydrologiques ont permis de proposé un modèle sur les flux de P.syringae des habitats naturels vers les agro-systèmes.

La bactérie phytopathogène Dickeya dadantii est responsable de la pourriture molle de nombreux végétaux. Elle sécrète dans le milieu extérieur toute une batterie d’enzymes capables de dégrader les constituants des parois végétales. La première partie de mon travail concerne les féruloyl estérases FaeD et FaeT. Les féruloyl estérases sont responsables de l’hydrolyse de liaisons ester entre l’acide férulique et les chaînes de xylane ou de pectine. En clivant ces liaisons, elles favorisent une dégradation complète de la paroi végétale. L'importance de ces enzymes nous a conduit à rechercher si D. dadantii produit de telles estérases. Le criblage d’une banque de gènes par un test de détection de l’activité féruloyl estérase a permis d’identifier deux gènes qui ont été caractérisés. Alors que faeT est faiblement transcrit dans toutes les conditions, la transcription de faeD est fortement induite en présence d’acide férulique et contrôlée par le régulateur FaeR. Alors que FaeT est une protéine cytoplasmique, FaeD est sécrétée par le système Out qui permet la sécrétion de nombreuses pectinases. Les enzymes FaeD et FaeT ont été surproduites dans E. coli et leurs principales propriétés biochimiques ont été déterminées. La connaissance de la séquence complète du génome de D. dadantii permet d’aborder des études de génomique fonctionnelle. Cette séquence confirme la présence des gènes codant les pectinases déjà caractérisées et révèle que ce génome code de nouvelles pectinases potentielles. La deuxième partie de mon travail concerne le gène pelN identifié par analyse du génome. Les pectate lyases coupent les liaisons glycosidiques du polygalacturonate par une réaction de β-élimination, générant des produits insaturés. Leur mécanisme d’action nécessite des cations comme cofacteur, en général Ca2+. Après clonage du gène pelN, la protéine PelN a été surproduite dans E. coli. Son activité pectate lyase a été prouvée en montrant sa capacité à produire des dérivés insaturés à partir de polygalacturonate ou de pectines plus ou moins méthylées. Cette étude démontre que PelN est la première pectate lyase utilisant les ions Fe2+ comme cofacteur préférentiel. Chez D. dadantii, l’expression du gène pelN dépend de divers régulateurs affectant la synthèse des pectinases, comme PecS ou GacA. PelN est une protéine extracellulaire sécrétée par le système Out. Ces études contribuent à mieux comprendre le rôle respectif des différentes enzymes impliquées dans la dégradation de la paroi végétale et le fonctionnement coopératif de ce système pluri-enzymatique. / The phytopathogenic bacterium Dickeya dadantii is responsible for soft rot diseases of various plants. It secretes in the external medium a large array of enzymes which are able to degrade the constituents of the plant-cell wall. The first part of my work was related to the féruloyl esterases FaeD and FaeT. Feruloyl esterases are responsible for the hydrolysis of ester linkages between ferulic acid and the xylan or pectin chains. By cleaving these linkages, they improve the complete degradation of the plant-cell wall. The importance of these enzymes led us to search whether D. dadantii produces such esterases. A gene bank screening using a specific detection test for the feruloyl esterase activity allowed us to identify two genes which were characterized. While faeT is weakly transcribed in all the conditions, the faeD transcription is strongly induced in the presence of ferulic acid and it is controlled by the regulator FaeR. Whereas FaeT is a cytoplasmic protein, FaeD is secreted by the Out system responsible for the secretion of several pectinases. The enzymes FaeD and FaeT were overproduced in E. coli and their main biochemical properties were determined. The determination of the complete sequence of the D. dadantii genome makes it possible to develop functional genomic studies. This sequence confirms the presence of genes encoding the previously characterized pectinases and it reveals that this genome encodes new potential pectinases. The second part of my work was related to the gene pelN identified by genome analysis. Pectate lyases cleave the glycosidic bounds in the polygalacturonate chain by a β-elimination reaction, generating unsaturated products. This reaction mechanism requires cations as cofactor, generally Ca2+. After cloning of the gene pelN, the protein PelN was overproduced in E. coli. Its pectate lyase activity was demonstrated by its capacity to produce unsaturated derivatives from polygalacturonate or pectins. This study showed that PelN is the first pectate lyase that uses Fe2+ ions as the preferential cofactor. In D. dadantii, the pelN expression depends on various regulators controlling the pectinase synthesis, such as PecS or GacA. PelN is an extracellular protein secreted by the Out system. These studies contribute to increase the knowledge on the respective role of the different enzymes involved in the degradation of the plant-cell wall and the cooperative interactions in this pluri-enzymatic system.

Démarche d’ingénierie écologique en santé des plantes : gestion des couvre-sol des vergers pour lutter contre les bactérioses des arbres fruitiers provoquées par Pseudomonas syringaeIdentifier les réservoirs et sources d’inoculum des agents phytopathogènes est un enjeu majeur en pathologie végétale. Les systèmes agricoles pérennes, tels que les vergers, sont soumis aux attaques de nombreux ravageurs et agents microbiens pathogènes. P. syringae, agent phytopathogène responsable de l’émergence de maladies des arbres fruitiers, dont la récente épidémie du chancre bactérien du kiwi causée P. syringae pv. actinidiae (Psa), représente un enjeu économique important au niveau mondial. En France, les moyens de lutte sont constitués de traitements cupriques et de gestes préventifs visant à réduire la propagation de la bactérie au sein et entre les vergers. Avec la prise de conscience de la nécessité de la conservation de l’environnement par les consommateurs et producteurs, les méthodes de cultures actuelles ont tendances à s’orienter vers celles de l’agroécologie et l’usage de l’ingénierie écologique au service de la santé des plantes. En verger, la gestion des communautés de plantes des couvre-sols donne de bons résultats dans la lutte conte certaines espèces de ravageurs, tels que les arthropodes herbivores, mais les effets sur les communautés de microorganismes pathogènes restent inexplorés. Les plantes couvre-sol et adventices des vergers hébergent d’abondantes communautés de P. syringae, cependant le rôle de ces couverts végétaux dans l’émergence des maladies des arbres fruitiers reste incompris. Par conséquent, les travaux de recherche presentés ici focalisent sur l’étude simultanée des communautés de P. syringae associées aux plantes couvre-sol et aux arbres fruitiers de trois vergers d’abricotiers et de quatre vergers de kiwis du département de la Drôme, sud-est de la France, choisis pour leur état sanitaire (sain, malade ou émergence de la maladie), ainsi que des pratiques de gestion du couvre-sol différentes (sol nu, enherbement des inter-rangs, enherbement des inter rangs et rangs des arbres). En l’absence d’outils permettant une identification rapide et une affiliation à l’un des 13 phylogroupes actuellement décris pour l’espèce P. syringae, l’étude du génome complet d’une cinquantaine de souches de P. syringae a permis la mise au point de marqueurs moléculaires capables d’identifier 9 des 13 phylogroupes. L’étude des communautés de P. syringae hébergées par les couvre-sols végétaux montre un effet de la composition des communautés des plantes couvre-sol sur l’abondance et la structure des communautés de P. syringae. La présence de Prunella vulgaris, une plante de la famille des Lamiaceae, est corrélée avec une diminution de l’abondance des P. syringae. La reproductibilité de ce résultat est actuellement en cours d’investigation dans une parcelle expérimentale. Cependant, les résultats préliminaires montrent une absence d’effet de P. vulgaris sur l’abondance de P. syringae. L’étude simultanée des communautés de P. syringae des couvre-sols végétaux et des arbres fruitiers montre que des échanges se font entre les deux compartiments en raison de la présence de souches génétiquement proches. Chez le kiwi, lorsque Psa est présent il coexiste toujours avec d’autres P. syringae, soulevant la question des interactions entre ces souches et leur rôle dans l’émergence de la maladie. Enfin, les résultats mettent en avant un potentiel antagonisme entre les phylogroupes 1 et 2. / Process of ecological engineering in plant health: study of the role of orchard ground cover plants in the emergence of fruit tree diseases caused by Pseudomonas syringaeIdentification of reservoirs and inoculum sources of plant pathogenic microorganisms is a major issue in plant pathology. Perennial agricultural systems, such as orchards, are exposed to many pests and pathogenic microorganisms. P. syringae, a phytopathogenic bacterium responsible for the emergence of diseases of fruit trees, including the recent outbreak of bacterial canker of kiwifruit caused P. syringae pv. actinidiae (Psa), represent an important economic issue worldwide. In France, means of control of bacterial canker consist of copper treatments and preventive measures in order to reduce the spread of bacteria within and between orchards. With the awareness for environmental conservation by consumers and producers, current cultivation methods tend to be progressively replaced by more agroecological ones and the use of ecological engineering to improve plant health. Ecological engineering of orchard ground cover plant communities provides good results for the control of orchard pests, such as herbivorous arthropods, but the effects on pathogenic microbial communities remains unexplored. The ground cover plants and orchard weeds host abundant P. syringae communities, however the role of ground covers in the emergence of fruit tree diseases remains ignored. Therefore, the research presented here is focused on the simultaneous study of P. syringae communities associated with ground covers and fruit trees from three apricot and four kiwifruit orchards of Drôme county, southeastern France, chosen for their health status (healthy, diseased, or disease emergence), as well as different ground cover management practices (bare soil, ground cover in inter-rows, ground cover in inter-rows and tree rows). In the absence of tools for rapid identification and affiliation to one of 13 currently described phylogroups for the P. syringae species, the screening of whole genomes of more than fifty P. syringae strains has allowed the development of specific molecular markers able to identify 9 of the 13 phylogroups. Results show that ground cover P. syringae community abundances and structures are correlated to plant community composition. The presence of Prunella vulgaris, a plant of the Lamiaceae family, is correlated to a decrease in the P. syringae abundances. Reproducibility of this result is currently under investigation in an experimental field. However, preliminary results from the experimental field show that the presence of P. vulgaris in 1-year-old ground covers is not correlated to a decrease in P. syringae abundances. Simultaneous study of ground cover and fruit tree P. syringae communities highlight bacterial exchanges between these two compartments because of the presence of genetically correlated strains in both of them. When present, Psa coexist with other P. syringae, raising the question of the interaction between these strains and their role in the emergence of the disease. Finally, the results highlight a potential antagonism between phylogroups 1 and 2.

Les bactéries pectinolytiques des genres Pectobacterium (ancien nom Erwinia carotovora) et Dickeya (ancien nom Erwinia chrysanthemi) sont les agents des maladies de la jambe noire et de la pourriture molle. Ils provoquent des dommages aux cultures et des pertes économiques élevées. Les pertes causées par les bactéries pectinolytiques sont évaluées à environ 2 à 10% du rendement de pommes de terre, en fonction de l'année. En 2009, les pertes en pommes de terre en Europe ont été estimées à 250 millions d'euros. Au cours des dernières années, des souches de Dickeya ont été de plus en plus souvent isolées de plantes malades en Pologne, en France et d'autres pays européens. Le genre Dickeya est un groupe très diversifié, qui, selon la nomenclature actuelle contient sept espèces: D. aquatica, D. chrysanthemi, D. dadantii, D. dianthicola, D. paradisiaca, D. solani et D. zeae. Les résultats récents, obtenus dans différents pays européens, indiquent qu'un nouveau groupe de souches de Dickeya peut infecter efficacement les plantes de pomme de terre et causer des symptômes de la maladie en climat tempéré. Les souches de D. solani sont considérés comme plus agressives que les autres bactéries causant la jambe noire. Une analyse préliminaire a suggéré qu’elles ont besoin de plus faibles températures optimales pour le développement de la maladie ainsi que de niveaux d'inoculum inférieurs pour la propagation de l'infection. Elles semblent avoir une plus forte capacité à coloniser les racines de plantes de pomme de terre et à se propager à travers le système vasculaire de la plante. Les souches de D. solani produisent une large gamme d’enzymes dégradant de la paroi cellulaire végétale, qui sont les principaux facteurs de virulence. Les objectifs de l'étude étaient les suivants: 1) la caractérisation phénotypique et génotypique des souches de D. solani isolées dans des pays ayant des conditions climatiques différentes: Pologne, Finlande et Israël, 2) l'étude de l’influence d'extraits de pomme de terre sur l'expression de quelques gènes sélectionnés de D. solani: pelD, pelL, tssk, lfaA, 3) la génomique comparative de dix souches de D. solani, basée sur 4 génomes séquencés pour cette étude et 6 séquences génomiques disponibles dans la base de données GenBank. En conclusion, toutes les études génomiques ont montré que les souches de D. solani forment un groupe très homogène. Cependant, leur analyse phénotypique révèle une certaine variabilité entre les souches provenant de différentes conditions climatiques. La raison des variations observées dans les traits phénotypiques peut être liée à la régulation de l'expression des gènes codant les facteurs de virulence qui peuvent être influencés par la température, le pH, la carence en fer ou en oxygène et la disponibilité en azote, ainsi que par la présence de composés spécifiques des tissus végétaux. / Dickeya solani is a species consisting of newly emerged plant pathogenic bacteria that cause blackleg and soft rot diseases. They are responsible for great damages to potato plantations in most of European countries. D. solani strains produce a wide range of plant cell-wall degrading enzymes which are the main virulence factors. The aims of the study were: 1) phenotypic and genotypic characterizations of the D. solani strains isolated in countries with different climatic conditions: Poland, Finland and Israel, 2) study of the potato tuber extract influence on the expression of a few selected D. solani genes : pelD, pelL, tssK, lfaA,3) comparative genomics of ten D. solani strains, performed on 4 genomes sequenced for this study and 6 genome sequences available in the GenBank databases. The results showed that the strains from different climatic conditions have identical profiles in rep-PCR (with three different primers) and in Restriction Fragments Lenght Polymorphism-Pulse Field Gel Electrophoresis. However, they do differ phenotypically, especially in the activity of plant cell-wall degrading enzymes. Polish strains have higher activities of pectinolytic, cellulolytic and proteolytic enzymes than Finnish and Israeli strains. D. solani mutants in the pelD, pelL, tssK, lfaA genes were constructed by site-specific mutagenesis. The highest induction by plant extracts was observed for the lfaA gene. The expression of pelL is also induced by plant derived signal(s), but not that of pelD and tssK. Comparative genomics helped to elucidate the D. solani pangenome. The 10 D. solani strains genomes are coding for a total of 41 947 proteins which were grouped into 5 045 Orthologous Groups, 3 809 belonging to the core genome, 413 to the accessory genome and 823 to the unique genome. Some pathogenicity-related genes as well as their regulators were selected on the basis of the knowledge available for D. dadantii 3937, the most studied Dickeya strain, which belongs to a closely related species. Analysis of their protein sequence showed no difference in the sequence of those genes within the 10 genomes. All the genetic studies proved that D. solani strains form a very homogenous group. On the other hand, the phenotypic analysis showed some variability among strains from different climatic conditions. The observed variations in the phenotypic traits can results from a different regulation of the expression of the genes encoding virulence factors which are influenced by temperature, pH, iron deprivation, oxygen and nitrogen availability, as well as by the presence of plant compounds.

Caractériser la dissémination des bio-agresseurs est un enjeu majeur pour la gestion et la prédiction des maladies en santé des plantes. Face aux limites des approches usuelles en pathologie végétale, une nouvelle vision a été proposée abordant les paradigmes d’histoire de vie des agents phytopathogènes en dehors des limites du système hôte-pathogène. Parmi ces agents phytopathogènes, les études sur P.syringae sont celles qui ont contribuées le plus à ce nouveau courant de pensée et dont on connaît le mieux l’histoire de vie en relation avec ses réservoirs « non hôtes ». L’espèce est détectée dans de nombreux compartiments du cycle de l’eau, des précipitations jusqu’aux rivières et eaux d’irrigation, en passant par les plantes sauvages et le manteau neigeux. L’ensemble de ces observations ont soulevé de nouvelles questions sur la manière dont P. syringae se dissémine au travers de ces environnements et sur les processus impactant sur la dynamique des populations à l’échelle d’un bassin versant. Ces recherches se sont donc intéressées à ses processus dans des précipitations jusqu’aux cours d’eau alpins dans l’optique d’acquérir des données pour la modélisation des flux de P. syringae. Elles ont mis en évidence les populations résidentes de la litière et la survie sa survie dans le sol, processus jamais identifiés à l’histoire de vie de P. syringae. Elles ont également caractérisé (i) les conditions propices à son transport via les précipitations, (ii) le rôle du manteau neigeux comme réservoir et protecteur des populations des prairies alpines et (iii) ont mis en évidence la chimie de l’eau comme indicateur témoin de la dynamique des populations des les rivières. Ces observations suggérant un transport de P. syringae dans le sol, nous l’avons quantifiée à travers des études de terrain et des simulations en laboratoire.Enfin, l’ensemble des données de ces recherches couplées à des outils SIG et des modèles météorologiques et hydrologiques ont permis de proposé un modèle sur les flux de P.syringae des habitats naturels vers les agro-systèmes. / The characterization of the spread of bio-agressors spread is a major issue for themanagement of plant health and the prediction of disease emergence. Given thelimitations of conventional approaches in plant pathology, a new vision has beenproposed addressing paradigms life history of plant pathogens outside the limits of thecrop host-pathogen system. Among the plant pathogens, studies on P. syringae are thosethat have contributed the most to this new way of thought for which life history inrelation to "non host" reservoirs has been highlighted. The species is found in manycompartments of the water cycle, from precipitation to rivers and irrigation water, wildplants and snowpack. All these observations have raised new questions about how P.syringae spreads through these environments and on the processes impactingpopulation dynamics at the scale of a watershed. This research was therefore interestedin these processes with the objective to acquire data for modeling the tranfer of P.syringae through the watershed. They highlighted the resident populations of litter andtheir survival in the soil, processes never identified in association with the life history ofP. syringae. They also revealed (i) the conditions for transport via precipitations, (ii) therole of snowpack as a reservoir and protector of the populations in alpine meadows and(iii) showed that water chemistry can be used as an indicator of the populationdynamics in headwaters. These observations suggested a transport of P. syringae via thesoil that we subsequently characterized through field studies and laboratorysimulations. Finally, all data from this research combined with GIS tools andmeteorological and hydrological models have permitted us to propose a model of theflux of P. syringae of natural habitats to agricultural systems.