La paroi végétale assure des fonctions biologiques majeures définissant la singularité des plantes ; elle est également à l'origine de multiples applications en tant que ressource agro-alimentaire, source de biomatériaux ou encore pour la production de biocarburants. Malgré cette importance fondamentale et pratique de la paroi végétale, la connaissance de sa biosynthèse apparaît à ce jour toujours très limitée. En effet, la faible abondance des glycosyltransférases (GTs) responsables de sa biosynthèse, l'absence de substrat spécifique et les difficultés à obtenir certains nucléotides-sucres nécessaires aux tests enzymatiques, a souvent rendu difficile les approches de biochimie classiques. Cependant, le séquençage de génomes (Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Poplar populus), la création de banques de mutants d'insertion et la classification des activités glycosyltransférases dans la base de données CAZy (www.cazy.org) sont autant d'outils récents ayant permis des avancées significatives vers la compréhension de la biosynthèse de la paroi des végétaux. Le CERMAV a participé à ce type d'avancée en 2009, en publiant une liste de 24 gènes candidats, nommés " NGT " pour " Nouvelles GlycosylTransférases ", présentant des signatures caractéristiques des glycosyltransférases. Afin de démontrer l'implication des gènes NGT dans les processus d'édification de la paroi végétale, nous avons développé une approche de génomique fonctionnelle, analysant en parallèle des lignées mutantes d'Arabidopsis altérées pour les gènes NGT et testant l'activité GT de ces protéines exprimées en systèmes hétérologues. Durant mes travaux de thèse j'ai pu caractériser 15 lignées mutantes à l'état homozygote pour 7 des 24 gènes NGT. Ces lignées homozygotes ont été criblées afin de rechercher un phénotype d'altération du développement ou de la composition en sucres de leur paroi qui soit corrélé à l'altération des gènes NGT. Ce travail de criblage a conduit à s'intéresser plus particulièrement aux mutants ngt1-1 et ngt1-2 altérés pour le gène NGT1 (At5g28910). La caractérisation des lignées mutantes ngt1-1 et ngt1-2 a permis de quantifier un phénotype de croissance foliaire réduit de 38%, par comparaison au développement des feuilles de la plante sauvage. Par ailleurs, la caractérisation biochimique de la paroi des mutants a révélé des réductions significatives et quantitatives de l'arabinose, du galactose et du rhamnose dans la paroi des mutants, ainsi que des modifications qualitatives marquées principalement des arabinanes. L'altération des arabinanes a d'ailleurs pu être confirmée par microscopie après immuno-marquage de sections d'hypocotyle de mutants à l'aide des anticorps monoclonaux LM6 et LM13 dirigés contre des épitopes α-1,5-arabinanes. Il a pu être montré également que la complémentation des mutants par une construction 35S::NGT1 permet de restaurer un phénotype sauvage à ces mutants. Par ailleurs, de façon à tester l'activité glycosyltransférase de la protéine NGT1, nous avons réalisé son expression en système hétérologue. A ce jour, malgré des résultats préliminaires encourageants, il n'a pas été possible de déterminer des conditions de tests permettant d'observer une activité glycosyltransférase suffisante et reproductible pour la protéine NGT1, que ce soit une activité fucosyltransférase (correspondant à la signature de la séquence du gène) ou bien une activité arabinosyltransférase (correspondant au phénotype biochimique des mutants ngt1).

La production de biocarburants de deuxième génération basée sur la transformation de la biomasse végétale est une question d’actualité. La biomasse végétale est représentée par les parois des cellules, qui consistent en un réseau de microfibrilles de cellulose et de polysaccharides enchâssés dans de la lignine. Pour exploiter pleinement le potentiel de cette biomasse, il est nécessaire d’apporter des connaissances complémentaires sur les mécanismes de biosynthèse de ces polymères pariétaux. Par exemple, il est important d’améliorer le rendement de saccharification des microfibrilles de cellulose afin de produire de plus grandes quantités de bioéthanol. Nous avons donc combiné des études basées sur le modèle bien connu Arabidopsis et sur Brachypodium distachyon, la nouvelle espèce modèle pour les graminées tempérées et les céréales monocotylédones dédiées à la production de biocarburants. La cellulose est synthétisée par des complexes membranaires de cellulose synthases (CSC) qui contiennent les sous-unités catalytiques de cellulose synthase (CESAs), et cela requiert d’autres partenaires parmi lesquels KOR1, une endo-β-1,4-glucanase. Le trafic intracellulaire des CESAs semble jouer un rôle crucial dans la régulation du niveau de la synthèse de la cellulose. Nous avons étudié en détails le trafic intracellulaire de KOR1 dans des hypocotyles d’Arabidopsis cultivés à l’obscurité. En parallèle, lors d’un crible visuel de la collection de mutants de Brachypodium de l’INRA de Versailles, nous avons sélectionné un mutant nommé spa. Ce mutant partage des caractéristiques avec les mutants brittle culm du riz et de l’orge, comme par exemple des tiges cassantes, un xylème irrégulier, et une importante déficience en cellulose, surtout au niveau des tiges, qui contiennent 50% de la quantité retrouvée dans une plante sauvage. Des dosages de lignine ont montré une augmentation significative chez spa. De façon itnéressante, ce mutant présente un défaut flagrant du port érigé, au contraire des mutants brittle culm qui sont parfaitement érigés. Les défauts mécaniques du mutant spa s’illustrent par un module de Young trois fois inférieur à celui d’une plante sauvage. Des approches complémentaires ont été mise en œuvre afin d’identifier les défauts génétiques responsables de ce phénotype : le séquençage de gènes candidats reliés à la synthèse de la cellulose a été réalisé ainsi qu’une approche de NGS. De plus, dans le cadre du projet Européen RENEWALL et du projet KBBE CellWall, et grâce à l’outil BradiNet (M.Mutvil, KBBE CellWall) permettant d’accéder aux réseaux de co-expression, des stratégies RNAi sont en cours afin d’inactiver certains gènes seléctionnés selon des critères d’expression spécifiques, et selon leur implication potentielle dans la synthèse de la cellulose, spécifiquement chez les monocotylédones. Parmi ces gènes nous nous sommes concentrés sur la famille des MAP65 (Microtubules Associated Proteins), qui pourraient, au vu de la relation étroite entre microtubules et microfibrilles, jouer un rôle dans la déposition de la cellulose. / The production of second-generation biofuels based on the transformation of plant biomass is a pressing issue. Biomass is represented by cell walls of the plant cells consisting of a network of cellulose microfibrils and polysaccharides encrusted by lignin. To enhance the potential of plant biomass, we need to provide insights on the mechanisms of the biosynthesis of cell wall polymers. For example, it is important to improve the saccharification yield of cellulose microfibrils to produce the highest amount of bioethanol. We therefore combine studies on the well-known model plant Arabidopsis and Brachypodium distachyon, the new model species for temperate graminae and monocotyledonous crops dedicated to biofuel production. Cellulose is synthesized by plasma membrane-bound cellulose synthase complexes (CSC) containing cellulose synthase proteins (CESAs) and requires other partners among which the endo-beta1,4 glucanase KOR1. The intracellular trafficking of CESAs seems to be crucial to regulate the cellulose synthesis rate. We investigated in detail the intracellular trafficking of KOR1 in Arabidospis dark-grown hypocotyls.In parallel we selected by visual screening of the Versailles collection of mutagenized Brachypodium distachyon a mutant called spa. This mutant shares characteristics of the brittle culm mutants of rice and barley, such as brittleness, irregular xylem, and a cellulose content deficiency especially in stems, with 50% of the amount found in the wild type. Lignin assays indicate a higher amount of lignin in spa. Interestingly, this mutant is also "floppy" unlike others brittle culm mutants which are fully erected and the mechanical strength defects of spa is illustrated by a Young’s modulus three times lower than that of WT. Complementary approaches were used to identify the SPA gene: sequencing of candidate genes related to cell wall synthesis or co-expressed with secondary cell wall cellulose synthases and a classical mapping strategy combined with NGS methods. Moreover within the framework of the European RENEWALL and KBBE CellWall projects and thanks to the co-expression network tool BradiNet (M. Mutwil, KBBE project), RNAi strategies are in progress to inactivate a few genes selected according to specific expression criteria and potentially involved in cell wall synthesis specifically in monocots. Among these genes we are focusing on the MAP65 family (Microtubules Associated Proteins), which could play a role in cellulose deposition according to the close relationship between microfibrils and microtubules.

La paroi végétale assure des fonctions biologiques majeures définissant la singularité des plantes ; elle est également à l'origine de multiples applications en tant que ressource agro-alimentaire, source de biomatériaux ou encore pour la production de biocarburants. Malgré cette importance fondamentale et pratique de la paroi végétale, la connaissance de sa biosynthèse apparaît à ce jour toujours très limitée. En effet, la faible abondance des glycosyltransférases (GTs) responsables de sa biosynthèse, l'absence de substrat spécifique et les difficultés à obtenir certains nucléotides-sucres nécessaires aux tests enzymatiques, a souvent rendu difficile les approches de biochimie classiques. Cependant, le séquençage de génomes (Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Poplar populus), la création de banques de mutants d'insertion et la classification des activités glycosyltransférases dans la base de données CAZy (www.cazy.org) sont autant d'outils récents ayant permis des avancées significatives vers la compréhension de la biosynthèse de la paroi des végétaux. Le CERMAV a participé à ce type d'avancée en 2009, en publiant une liste de 24 gènes candidats, nommés « NGT » pour « Nouvelles GlycosylTransférases », présentant des signatures caractéristiques des glycosyltransférases. Afin de démontrer l'implication des gènes NGT dans les processus d'édification de la paroi végétale, nous avons développé une approche de génomique fonctionnelle, analysant en parallèle des lignées mutantes d'Arabidopsis altérées pour les gènes NGT et testant l'activité GT de ces protéines exprimées en systèmes hétérologues. Durant mes travaux de thèse j'ai pu caractériser 15 lignées mutantes à l'état homozygote pour 7 des 24 gènes NGT. Ces lignées homozygotes ont été criblées afin de rechercher un phénotype d'altération du développement ou de la composition en sucres de leur paroi qui soit corrélé à l'altération des gènes NGT. Ce travail de criblage a conduit à s'intéresser plus particulièrement aux mutants ngt1-1 et ngt1-2 altérés pour le gène NGT1 (At5g28910). La caractérisation des lignées mutantes ngt1-1 et ngt1-2 a permis de quantifier un phénotype de croissance foliaire réduit de 38%, par comparaison au développement des feuilles de la plante sauvage. Par ailleurs, la caractérisation biochimique de la paroi des mutants a révélé des réductions significatives et quantitatives de l'arabinose, du galactose et du rhamnose dans la paroi des mutants, ainsi que des modifications qualitatives marquées principalement des arabinanes. L'altération des arabinanes a d'ailleurs pu être confirmée par microscopie après immuno-marquage de sections d'hypocotyle de mutants à l'aide des anticorps monoclonaux LM6 et LM13 dirigés contre des épitopes α-1,5-arabinanes. Il a pu être montré également que la complémentation des mutants par une construction 35S::NGT1 permet de restaurer un phénotype sauvage à ces mutants. Par ailleurs, de façon à tester l'activité glycosyltransférase de la protéine NGT1, nous avons réalisé son expression en système hétérologue. A ce jour, malgré des résultats préliminaires encourageants, il n'a pas été possible de déterminer des conditions de tests permettant d'observer une activité glycosyltransférase suffisante et reproductible pour la protéine NGT1, que ce soit une activité fucosyltransférase (correspondant à la signature de la séquence du gène) ou bien une activité arabinosyltransférase (correspondant au phénotype biochimique des mutants ngt1). / The plant cell wall not only defines the unique biology of the plants but also have practical applications as feedstock for biomaterials and for the production of biofuels. Plant primary cell wall is mainly composed of cellulose, hemicelluloses and pectins. Significant progress has been made recently in identifying the enzymes involved in plant cell wall biosynthesis, but only a handful of those have been involved in pectin biosynthesis. With the aim of identifying new putative glycosyltransferases (GTs), in lab Hansen et al 2009 designed a bioinformatic strategy and identified a new group of 24 genes called “NGT” for (Novel Glycosyltransferase) which were considered “strong” candidates for putative glycosyltransferase activities. In order to determine the putative role of these NGT genes in plant cell wall biosynthesis, we designed a functional genomics strategy, analysing in parallel Arabidopsis T-DNA mutant lines and performing heterologous expression of candidate genes. I have characterized 15 homozygous mutant lines among the group of 24 putative NGT genes through PCR. We analysed the homozygous mutants for phenotypic alteration such as dwarfing or organ malformation and found that some of mutant lines have narrow leaves as compared to Wild type plants. In parallel I have carried out the cell wall chemical analysis of 12 homozygous mutant lines and did not get any strong difference in neutral monosaccharide composition. The detailed and complete analysis (chemical, expression and microscopic analysis) of all the above mentioned genes could have been time consuming and an overwhelming work, so I focused on At5g28910 (named NGT1) which harbours a fucosyltransferase peptide signature and on At5g14550 (named P), a gene belonging to the DUF266 gene family. Homozygous T-DNA mutant lines ngt1-1 and ngt1-2 lines were analyzed and showed a reduced growth phenotype (leaf area). Leaf area was quantified at various development stages using ImageJ, and showed a 38% reduction in mutants. Additionally, biochemical characterization of the cell wall was performed showing a reduction in neutral monosaccharide contents, like arabinose, rhamnose and galactose in mutant cell wall. Furthermore glycosyl linkage analysis of mutant lines ngt1-1 and ngt1-2 has shown that 5-Arabinofuranose (5-Araf) and 3,5-Arabinofuranose (3,5-Araf ) contents were decreased as compared to Wild type Col0 cell wall. These results were also confirmed by immunolabeling of stem cross section of mutant and wild type plants. The complementation of the mutant plants through Agrobacterium transformation resulted in the complete restoration of plant phenotype. Taken together, these data suggest that NGT1 could be an arabinosyltransferase. In order to characterize its biochemical activity, the NGT1 protein was heterologously expressed in Pichia pastoris. The recombinant protein was used to perform in vitro activity tests, but we were unable to demonstrate any neither fucosyltransferase (on the basis of peptide signature) nor arabinosyltransferase activity. In parallel to this study, I contributed to the heterologous expression and characterization of two biochemically characterized Arabidopsis GTs involved in xyloglucan synthesis: the fucosyltransferase (AtFUT1) and xylosyltransferase (AtXT1). I have successfully expressed a truncated and active form of AtFUT1, which represents an essential step for further structural studies that will be undertaken in the lab.

Clostridium cellulolyticum est une bactérie anaérobie stricte et cellulolytique qui produit des complexes multienzymatiques (cellulosomes) très performants pour la dégradation des polysaccharides de la paroi végétale. C. cellulolyticum adhère à la cellulose et ce phénomène intervient dès les premiers stades de croissance. Pour de nombreuses bactéries cellulolytiques, les cellulosomes semblent impliqués dans le processus d'adhérence et alors que les mécanismes moléculaires mis en jeu pour l'adhérence à la cellulose sont connus ou proposés, celui ou ceux de C. cellulolyticum sont inconnus.Mon projet de thèse a consisté à étudier l'adhérence et la colonisation des fibres de cellulose par C. cellulolyticum et d'identifier le ou les facteurs moléculaires impliqués dans l'adhérence. J'ai ainsi mis en œuvre deux stratégies distinctes. D'une part, une approche par mutagénèse aléatoire qui a permis d'isoler deux clones à l'adhérence diminuée et d'autre part, une approche par mutagénèse ciblée visant à inactiver des gènes candidats, susceptibles d'intervenir dans l'adhérence.J'ai aussi étudié la colonisation des fibres de cellulose par C. cellulolyticum et observé que les cellules adhèrent avec une haute spécificité et affinité à la cellulose. La colonisation des fibres se ferait en mono-couche cellulaire et par successions d'événements d'adhésion-relarguage-réadhésion. Un mutant d'inactivation de CipC, la protéine d'échafaudage des cellulosomes, a mis en évidence l'implication de cette protéine dans l'adhérence, mais aussi que l'adhérence à la cellulose pourrait être multifactorielle. Enfin, j'ai étudié le rôle de HycP, une protéine à CBM3 dont la fonction est inconnue. / Clostridium cellulolyticum is a strict anaerobe, cellulolytic bacteria. It produces multienzymatic complexes, called cellulosomes, which are able to efficiently degrade the plant cell wall polysaccharides. Cellulolytic bacteria, including C. cellulolyticum do binds to cellulose since early growth stage. For most of the studied cellulolytic bacteria, adherence to cellulose seems to be mediated by their cellulosomes. However, molecular factors involved in C. cellulolyticum adherence to cellulose remain unknown.My Ph.D. aimed to implement different but complementary strategies to study adhesion and colonization of cellulose fibers by C. cellulolyticum and to identify the molecular mechanism(s) by which the bacteria bind to cellulose. In order to identify some proteins encoding genes involved in adhesion, I firstly developed random mutagenesis and isolated two adhesion deficient mutants. I also used a targeted mutagenesis tool to inactivate some candidate genes.My studies highlight C. cellulolyticum adheres with both high specificity and affinity to cellulose. Colonization of cellulose fibers by C. cellulolyticum forms a mono-layer of segregated cells on cellulose surface and may occur through cycles of adhesion-release-re-adhesion to substrate. Inactivation of the CipC encoding gene led to a short decrease of the mutant strain's adherence level. This result suggests some other proteins may be involved in C. cellulolyticum adhesion to cellulose. Finally, I studied HycP, a produced and secreted CBM3 encoding protein of unknown function. HycP is a unique protein among databases and may have a phagic origin.

En raison des enjeux écologiques actuels, l'utilisation de ressources lignocellulosiques dans l'élaboration de matériaux composites suscite actuellement un intérêt grandissant. Au-delà des applications traditionnelles (papier, panneaux composites, textiles…), les ressources lignocellulosiques constituent une alternative durable aux ressources fossiles pour la production de biocarburant ou d'agrocomposites à base de fibres végétales. Ainsi, si l'on souhaite optimiser les performances de ces nouveaux composites, il est nécessaire de mieux connaitre les propriétés de la fibre et par conséquent réaliser une étude multi-échelle des propriétés physicochimiques et mécaniques des fibres, des polymères constitutifs et de leurs interactions. Dans ce cadre, le premier objectif de la thèse a été de mesurer à l'échelle nanométrique le gradient de propriétés mécaniques et physicochimiques de coupes de fibres végétales par l'intermédiaire de deux techniques utilisant le microscope à force atomique (AFM) visant à cartographier les propriétés nanomécaniques et les caractéristiques spectrales en IR. Puis, pour mieux comprendre le rôle des polymères et de leurs interactions sur les propriétés de la fibre, des systèmes bioinspirés, composés des trois principales classes de polymères pariétaux et de complexité croissante ont été élaborés en veillant à introduire des interactions covalentes et non covalentes entre les polymères, et plus particulièrement entre la lignine et les polysaccharides (cellulose, hémicelluloses). / Due to environmental context, the exploitation of lignocellulosic ressources in the elaboration of composite materials has currently a growing interest. Beside traditional uses (paper, textiles…), lignocellulosic ressources constitute a sustainable alternative to fossils ressources for the production of biofuels and fiber-based agrocomposites. However, optimization of the performance of fiber composites requires a multi-scale study of the physicochemical and mechanical properties of the fibers and of their constitutive polymers and their interactions. To this end, the first goal of the thesis is to measure at nanometric scale, the gradient of the mechanical and physicochemical properties of plant fibers using two AFM-based techniques aiming at the mapping of nanomechanical and IR spectral properties. Then, in order to better understand the role of the polymers and of their interactions on the fibers' properties, bioinspired systems have been designed with three main lignocellulosic polymers while achieving in covalent and non-covalent interactions between the polymers (especially between polysaccharides and lignin).

Le contrôle moléculaire du patterning au cours des processus développementaux est aujourd’hui bien décrit chez les organismes multicellulaires. A l’inverse, la contribution de la croissance dans l’émergence des patterns reste peu explorée, et est souvent réduite à un rôle passif. Au cours de cette thèse, j’ai étudié cette question en utilisant le méristème apical caulinaire (MAC) d’Arabidopsis comme modèle. Le méristème est un groupe de cellules en divisions situé à l’extrémité de toutes les tiges et les branches et qui génère tous les organes aériens de la plante selon un patron stéréotypé, aussi appelé phyllotaxie. Dans une première partie, j’ai étudié comment la croissance de la tige pouvait influencer le patron phyllotactique. Plus précisément, en découplant dépôt de la cellulose dans la paroi et l’orientation des microtubules, j’ai montré que le patron de phyllotaxie devenait bimodal en raison de l’induction d’une torsion lors de la croissance de la tige. Dans une seconde partie, j’ai analysé le lien entre forme du MAC et expression génétique. En particulier, j’ai pu corréler l’expression d’un gène maître : SHOOTMERISTEM LESS (STM) au degré de courbure dans le MAC. De plus, en utilisant des approches de micromécaniques, j’ai aussi pu montrer que l’expression de STM pouvait être induite par le patron de contraintes localement généré par la courbure. Pour finir, j’ai aussi étudié comment la taille du méristème influence la robustesse du pattern de phyllotaxie sur la tige en modulant la fréquence d’initiation des organes. L’ensemble de ce travail met ainsi en avant le rôle de la croissance dans le patterning, notamment via des mécanismes de rétrocontrôles géométriques et mécaniques. / The molecular mechanisms behind the emergence of patterns during developmental processes have been well described in multicellular organisms. However, the contribution of growth in patterning is still poorly understood; growth is often seen as a passive output of the activity of the patterning signals. In this PhD, I have studied the relation between growth and patterning using the shoot apical meristem of Arabidopsis as a model system. The meristem is a group of dividing cells located at the tip of every stems and branches that generates all the aerial organs of the plant following a typical spatio-temporal pattern also called phyllotaxis. In a first part, the influence of post-meristematic growth on phyllotaxis was assessed. More precisely, by uncoupling cellulose deposition from the orientation of the microtubule array, I showed that the resulting stem torsion induces the emergence of a new and robust bimodal phyllotactic pattern. In a second part, the relation between meristem shape and gene expression was analyzed. More precisely, I correlated the expression of a master regulatory gene: SHOOT MERISTEMLESS (STM) to tissue curvature in the boundary domain that separates the emerging organ from the meristem. Furthermore, I showed that STM expression can be induced by micromechanical perturbations thus suggesting that shape-derived mechanical stresses in the meristem boundary contribute to STM expression. Finally, I also studied how meristem size can influence the robustness of the pattern of phyllotaxis along the stem through a modulation of the frequency of organ initiation. Altogether, this work highlights the important contribution of growth in patterning, notably thanks to the existence of geometrical and mechanical feedbacks.

La pectine, un composant de la matrice de la paroi primaire, joue un rôle dans le contrôle de la porosité de la paroi, l’élongation et l’adhésion cellulaire et est un facteur important dans le développement de la plante. Homogalacturonane (HG), le polymère pectique le plus abondant, est sécrété sous forme méthylestérifiée et ne porte donc peu ou pas de charges négatives. La déméthylestérification d’HG par des pectines méthylestérases (PMEs) expose ensuite des charges négatives et a des conséquences importantes sur les propriétés mécaniques de la paroi, affectant des processus physiologiques et développementaux comme l’ouverture des stomates, l’initiation d’organes et la croissance cellulaire anisotropique. De multiples PME existent (chez Arabidopsis thaliana) qui peuvent être inhibées par des « PME inhibitors » (PMEIs) endogènes. L’HG déméthylestérifiée peut former des liaisons Ca²⁺-pectate qui peuvent rigidifier la paroi, mais des études récentes montrent que la déméthylestérification de HG peut également promouvoir le relâchement de la paroi et l’expansion cellulaire à travers un mécanisme inconnu. Dans ma thèse j’ai adressé ce paradoxe en étudiant le lien entre le métabolisme des pectines, le pH et l’extensibilité de la paroi. À cette fin j’ai développé et utilisé des outils génétiques et pharmacologiques pour la manipulation in vivo de l’activité PME. J’ai généré des lignées permettant la surexpression inductible de deux PMEIs différents, mais qui malheureusement s’avéraient non fonctionnelles. J’ai produit PMEI3 dans une levure ce qui m’a permis de montrer que la protéine a une activité inhibitrice pH-dépendante sur un large éventail de PMEs. Par ailleurs, j’ai utilisé et développé des senseurs ratiométriques pour la mesure du pH à la surface de la cellule. En dehors des senseurs existants, j’ai aussi essayé d’adresser les mêmes biosenseurs à la paroi. À l’aide de ces outils, j’ai ensuite étudié l’impact de la modification de l’activité PME sur le pH et la croissance cellulaire. J’ai pu observer qu’un inhibiteur chimique de la PME, l’(-)-epigallocatechin gallate (EGCG) entraînait une augmentation du pH apoplastique (pHApo) dans la racine, et ceci indépendamment de la H⁺-ATPase ; une inhibition de la croissance et une perte de l’anisotropie des cellules. Par ailleurs, un traitement avec PMEI3 ralentissait la croissance et un apport de PME entraînait une réduction du pHApo et une augmentation de la croissance. Enfin, une induction de 24h de PMEI5 causait une réduction du pHApo, ce qui est en accord avec l’activation compensatoire d’autres PMEs suite à une signalisation liée eux brassinostéroide accrue décrit précédemment. En conclusion, nos résultats suggèrent que la démethylesterification des HG crée domaines anioniques qui peuvent séquestrer des protons ce qui pourrait activer localement des protéines qui stimulent le relâchement de la paroi avec un pH optimum acide entraînant une augmentation de la vitesse de croissance cellulaire. / Pectin, a matrix component in the primary cell wall, plays a role in controlling cell wall porosity, cell elongation and cell adhesion and constitutes an important factor in plant development. The demethylesterification of homogalacturonan (HG), the most abundant pectic polymer, has vast consequences on the mechanical properties of the cell wall, and affects developmental processes such as stomata opening, organ initiation and anisotropic cell growth. HG is selectively demethylesterified in muro by pectin methylesterases (PME), which in turn can be inhibited by endogenous PME inhibitor proteins (PMEIs). Demethylesterified HG is thought to form Ca²⁺-pectate complexes, which contribute to wall stiffening, but recent evidence suggest that it can also promote cell wall loosening and expansion, through a so far unknown mechanism. In this study I addressed this paradox by investigating the link between pectin metabolism, cell wall pH and extensibility. To this end I developed and used genetic and pharmacological tools for the in vivo manipulation of PME activity. I generated inducible overexpression lines for two distinct PMEIs, which unfortunately were not functional. I also produced PMEI3 from Arabidopsis in a yeast and showed that the protein displayed an inhibiting activity on a broad range of PMEs. In addition, I developed and used tools to monitor the cell surface pH. In addition to using existing genetically-encoded ratiometric apoplastic pH sensors, I also tried to generate similar sensors targeted to the cell wall. Using these tools I then studied the impact of changes in pectin methylesterification on the cell wall pH and cell expansion. I discovered that a chemical inhibitor of PME, (-)-epigallocatechin gallate (EGCG), promoted an increase in apoplastic pH (pHApo) in root cells, independently from the inhibition of the H⁺-ATPase, and triggered root growth inhibition and abnormal cell shape. Exogenous PMEI3 application also inhibited root growth. In addition, PME application caused a decrease in pHApo and enhanced root growth. Interestingly, long-term induction of PMEI5 could reduce pHApo, consistent with the previously described activation of brassinosteroid signaling causing a compensatory increase in PME activity. Together, my study provides evidence that HG demethylesterification leads to a decrease in pHApo and an increase in cell growth in the Arabidopsis root. Our results support the view that the negatively charged pectate can sequester protons and thus may contribute to the activation of cell wall loosening proteins and cell growth.

Les bactéries pectinolytiques des genres Pectobacterium (ancien nom Erwinia carotovora) et Dickeya (ancien nom Erwinia chrysanthemi) sont les agents des maladies de la jambe noire et de la pourriture molle. Ils provoquent des dommages aux cultures et des pertes économiques élevées. Les pertes causées par les bactéries pectinolytiques sont évaluées à environ 2 à 10% du rendement de pommes de terre, en fonction de l'année. En 2009, les pertes en pommes de terre en Europe ont été estimées à 250 millions d'euros. Au cours des dernières années, des souches de Dickeya ont été de plus en plus souvent isolées de plantes malades en Pologne, en France et d'autres pays européens. Le genre Dickeya est un groupe très diversifié, qui, selon la nomenclature actuelle contient sept espèces: D. aquatica, D. chrysanthemi, D. dadantii, D. dianthicola, D. paradisiaca, D. solani et D. zeae. Les résultats récents, obtenus dans différents pays européens, indiquent qu'un nouveau groupe de souches de Dickeya peut infecter efficacement les plantes de pomme de terre et causer des symptômes de la maladie en climat tempéré. Les souches de D. solani sont considérés comme plus agressives que les autres bactéries causant la jambe noire. Une analyse préliminaire a suggéré qu’elles ont besoin de plus faibles températures optimales pour le développement de la maladie ainsi que de niveaux d'inoculum inférieurs pour la propagation de l'infection. Elles semblent avoir une plus forte capacité à coloniser les racines de plantes de pomme de terre et à se propager à travers le système vasculaire de la plante. Les souches de D. solani produisent une large gamme d’enzymes dégradant de la paroi cellulaire végétale, qui sont les principaux facteurs de virulence. Les objectifs de l'étude étaient les suivants: 1) la caractérisation phénotypique et génotypique des souches de D. solani isolées dans des pays ayant des conditions climatiques différentes: Pologne, Finlande et Israël, 2) l'étude de l’influence d'extraits de pomme de terre sur l'expression de quelques gènes sélectionnés de D. solani: pelD, pelL, tssk, lfaA, 3) la génomique comparative de dix souches de D. solani, basée sur 4 génomes séquencés pour cette étude et 6 séquences génomiques disponibles dans la base de données GenBank. En conclusion, toutes les études génomiques ont montré que les souches de D. solani forment un groupe très homogène. Cependant, leur analyse phénotypique révèle une certaine variabilité entre les souches provenant de différentes conditions climatiques. La raison des variations observées dans les traits phénotypiques peut être liée à la régulation de l'expression des gènes codant les facteurs de virulence qui peuvent être influencés par la température, le pH, la carence en fer ou en oxygène et la disponibilité en azote, ainsi que par la présence de composés spécifiques des tissus végétaux. / Dickeya solani is a species consisting of newly emerged plant pathogenic bacteria that cause blackleg and soft rot diseases. They are responsible for great damages to potato plantations in most of European countries. D. solani strains produce a wide range of plant cell-wall degrading enzymes which are the main virulence factors. The aims of the study were: 1) phenotypic and genotypic characterizations of the D. solani strains isolated in countries with different climatic conditions: Poland, Finland and Israel, 2) study of the potato tuber extract influence on the expression of a few selected D. solani genes : pelD, pelL, tssK, lfaA,3) comparative genomics of ten D. solani strains, performed on 4 genomes sequenced for this study and 6 genome sequences available in the GenBank databases. The results showed that the strains from different climatic conditions have identical profiles in rep-PCR (with three different primers) and in Restriction Fragments Lenght Polymorphism-Pulse Field Gel Electrophoresis. However, they do differ phenotypically, especially in the activity of plant cell-wall degrading enzymes. Polish strains have higher activities of pectinolytic, cellulolytic and proteolytic enzymes than Finnish and Israeli strains. D. solani mutants in the pelD, pelL, tssK, lfaA genes were constructed by site-specific mutagenesis. The highest induction by plant extracts was observed for the lfaA gene. The expression of pelL is also induced by plant derived signal(s), but not that of pelD and tssK. Comparative genomics helped to elucidate the D. solani pangenome. The 10 D. solani strains genomes are coding for a total of 41 947 proteins which were grouped into 5 045 Orthologous Groups, 3 809 belonging to the core genome, 413 to the accessory genome and 823 to the unique genome. Some pathogenicity-related genes as well as their regulators were selected on the basis of the knowledge available for D. dadantii 3937, the most studied Dickeya strain, which belongs to a closely related species. Analysis of their protein sequence showed no difference in the sequence of those genes within the 10 genomes. All the genetic studies proved that D. solani strains form a very homogenous group. On the other hand, the phenotypic analysis showed some variability among strains from different climatic conditions. The observed variations in the phenotypic traits can results from a different regulation of the expression of the genes encoding virulence factors which are influenced by temperature, pH, iron deprivation, oxygen and nitrogen availability, as well as by the presence of plant compounds.

La composition des cellulosomes (complexes multi-enzymatiques impliqués dans la dégradation des polysaccharides de la paroi végétale) produits par Clostridium cellulolyticum varie en fonction du substrat de croissance. En particulier, l’expression d’un regroupement de 14 gènes prédits comme codants pour des hémicellulases (appelés xyl-doc) est induite par la présence de paille et non de cellulose. L’hypothèse a été faite que le système à deux composants putatif, codé par les deux gènes en amont des gènes xyl-doc, est impliqué dans cette régulation. Mes résultats montrent que le régulateur de réponse (appelé XydR) est impliqué dans l’activation de la transcription des gènes xyl-doc et d’un gène additionnel codant pour une protéine de fonction inconnue. Cette protéine possède cependant un module de liaison aux sucres prédit comme ciblant les hémicelluloses. Les régions promotrices, incluant les sites potentiels de liaison de XydR, ont été identifiées en amont des gènes régulés et un lien transcriptionnel entre tous les gènes xyl-doc a été mis en évidence.Un deuxième objectif de mon travail a été d’identifier le signal inducteur présent dans la paille susceptible d’être capté par le senseur apparenté à XydR. Il a été montré que la transcription des gènes cibles est spécifiquement induite par l’arabinose et le xylose qui sont les résidus glucidiques les plus abondants dans les hémicelluloses et donc relargués lors de leur dégradation.Finalement, des études biochimiques des produits de certains des gènes régulés ont montré qu’au moins trois des gènes codaient pour des produits impliqués dans la dégradation des hémicelluloses. / The composition of the cellulosomes (multi enzymatic complexes involved in the degradation of plant cell wall polysaccharides) produced by Clostridium cellulolyticum differs according to the growth substrate. In particular, the expression of a cluster of 14 hemicellulase-encoding genes (called xyl-doc) is induced by the presence of straw and not of cellulose. The hypothesis was made that the putative two-component regulatory system, encoded by the genes localized upstream of xyl-doc, was involved in this regulation.My results provided evidence that the response regulator (called XydR) is involved in the activation of the transcription of xyl-doc genes and of an additional gene encoding a protein of unknown function harboring a carbohydrate binding module predicted to target hemicelluloses. Promoter regions, including XydR binding sites, have been identified upstream of the regulated genes and the transcriptional link between all xyl-doc genes has been demonstrated. A second aim of my work has been to identify the inducing signal present in straw that could be sensed by the cognate sensor of XydR. It was shown that the transcription of the target genes is specifically induced by arabinose and xylose which are the most abundant sugar residues present in hemicellulose and thus released by its degradation.Finally, biochemical studies of the products of some of the regulated genes demonstrated that at least three genes encoded products involved in hemicellullose degradation.