Thèse doctorat : Sciences biologiques fondamentales et appliquées. Psychologie : Nancy 1 : 1999. / Titre provenant de l'écran-titre.

Thèse de doctorat : Biologie structurale, moléculaire et cellulaire : Nancy 1 : 2001. / Thèse : 2001NAN10174. Titre provenant de l'écran-titre.

La composition des cellulosomes (complexes multi-enzymatiques impliqués dans la dégradation des polysaccharides de la paroi végétale) produits par Clostridium cellulolyticum varie en fonction du substrat de croissance. En particulier, l’expression d’un regroupement de 14 gènes prédits comme codants pour des hémicellulases (appelés xyl-doc) est induite par la présence de paille et non de cellulose. L’hypothèse a été faite que le système à deux composants putatif, codé par les deux gènes en amont des gènes xyl-doc, est impliqué dans cette régulation. Mes résultats montrent que le régulateur de réponse (appelé XydR) est impliqué dans l’activation de la transcription des gènes xyl-doc et d’un gène additionnel codant pour une protéine de fonction inconnue. Cette protéine possède cependant un module de liaison aux sucres prédit comme ciblant les hémicelluloses. Les régions promotrices, incluant les sites potentiels de liaison de XydR, ont été identifiées en amont des gènes régulés et un lien transcriptionnel entre tous les gènes xyl-doc a été mis en évidence.Un deuxième objectif de mon travail a été d’identifier le signal inducteur présent dans la paille susceptible d’être capté par le senseur apparenté à XydR. Il a été montré que la transcription des gènes cibles est spécifiquement induite par l’arabinose et le xylose qui sont les résidus glucidiques les plus abondants dans les hémicelluloses et donc relargués lors de leur dégradation.Finalement, des études biochimiques des produits de certains des gènes régulés ont montré qu’au moins trois des gènes codaient pour des produits impliqués dans la dégradation des hémicelluloses. / The composition of the cellulosomes (multi enzymatic complexes involved in the degradation of plant cell wall polysaccharides) produced by Clostridium cellulolyticum differs according to the growth substrate. In particular, the expression of a cluster of 14 hemicellulase-encoding genes (called xyl-doc) is induced by the presence of straw and not of cellulose. The hypothesis was made that the putative two-component regulatory system, encoded by the genes localized upstream of xyl-doc, was involved in this regulation.My results provided evidence that the response regulator (called XydR) is involved in the activation of the transcription of xyl-doc genes and of an additional gene encoding a protein of unknown function harboring a carbohydrate binding module predicted to target hemicelluloses. Promoter regions, including XydR binding sites, have been identified upstream of the regulated genes and the transcriptional link between all xyl-doc genes has been demonstrated. A second aim of my work has been to identify the inducing signal present in straw that could be sensed by the cognate sensor of XydR. It was shown that the transcription of the target genes is specifically induced by arabinose and xylose which are the most abundant sugar residues present in hemicellulose and thus released by its degradation.Finally, biochemical studies of the products of some of the regulated genes demonstrated that at least three genes encoded products involved in hemicellullose degradation.

Dans le cadre des législations européennes relatives au traitement des déchets et aux énergies renouvelables, la méthanisation apparaît comme une alternative prometteuse pour la stabilisation et la valorisation des Ordures Ménagères Résiduelles (OMR). D'un point de vue opérationnel l'hétérogénéité et les difficultés de mise en mouvement d'une matrice aussi complexe que les OMR sont à l'origine de pertes de rendement voire de l'arrêt d'installations de méthanisation. Les performances de méthanisation sont en particulier limitées par l'étape d'hydrolyse des fractions lignocellulosiques qui représentent la majorité du potentiel méthanogène des OMR. Dans ce contexte, l'objectif principal du travail de thèse, était l'étude d'un procédé de percolation dans lequel le déchet n'est pas mis en mouvement. Au travers de ce travail nous avions également pour ambition de produire des connaissances à caractère plus générique sur l'hydrolyse afin d'en améliorer les performances. Des expériences préliminaires ont d'abord permis la définition d'un système expérimental adéquat pour l'étude à l'échelle laboratoire de l'hydrolyse des OMR. La représentativité d'un déchet reconstitué, reproductible et d'utilisation aisée, a notamment été vérifiée en termes de potentiel méthanogène, de profil hydrolytique et de flore microbienne. Suite à la définition de ce système expérimental, son comportement hydrolytique a été comparé à celui d'un test de lixiviation de référence (NF EN 12457-4) afin de valider l'intérêt opérationnel de la percolation pour l'hydrolyse des OMR. De façon inattendue, l'extraction de 38,90% de la matière carbonée initiale du déchet a ainsi été mise en évidence lors de l'hydrolyse par percolation contre 17,84% lors de l'hydrolyse par lixiviation, renforçant l'intérêt suscité par la percolation pour l'hydrolyse des OMR. L'optimisation des performances d'hydrolyse par percolation a ensuite été réalisée par le criblage de huit paramètres opérationnels afin de déterminer leur influence sur les performances d'hydrolyse des OMR, au travers de deux plans d'expérience. L'ajout d'alcalinité (12 gHCO3-.L-1) et la recirculation du percolat pendant 6 h par jour ont ainsi permis d'augmenter significativement les performances d'hydrolyse, passant de 17 à 43% d'extraction de la matière organique (DCO) initiale du déchet (autrement dit de 26 à 69% de la matière biodégradable initiale). L'étude des communautés microbiennes et de leur activité a également été réalisée. Le séquençage des pyrotags d'ADNr 16S a ainsi permis de mettre en évidence le caractère dominant des Classes Clostridia et Bacteroidia au sein des communautés hydrolytiques. Le couplage de cette démarche qualitative à une approche quantitative par qPCR sur une série de biomarqueurs taxonomiques et fonctionnels a permis de montrer qu'il existe une corrélation positive entre l'ajout de carbonates, la neutralisation du pH, la quantité de matière hydrolysée à 14 jours et soit l'abondance de la Classe Bacteroidia soit celle des gènes de la famille hydA, impliqués dans la fermentation. Finalement, l'analyse microbiologique a été approfondie au jour 4, c'est-à-dire durant la phase d'hydrolyse intense, grâce à une approche de métatranscriptomique. L'analyse des transcrits fonctionnels indique que l'alcalinité influence l'activité des microorganismes de la Classe Clostridia dès le jour 4 des essais d'hydrolyse. Plus spécifiquement, l'ajout de carbonates semble corrélé à une modification du métabolisme des sucres chez des microorganismes non cultivables apparentés à Clostridium cellulolyticum et à l'augmentation de l'expression de l'opéron nif, impliqué dans la fixation de l'azote, chez différents groupes de microorganismes. / In the framework of the European green policy, anaerobic digestion appears as a promising technology for stabilization and valorization of Municipal Solid Waste (MSW). In practice, mechanical mixing of a complex and heterogeneous matrix such as MSW induces major operational constraints. Anaerobic digestion performances are especially limited by hydrolysis of lignocellulosic fractions which represent the main part of MSW methanogenic potential. In this context, this PhD project was aiming to characterize and optimize of a percolation process in which MSW stands still. Preliminary experiments were conducted in order to define an experimental system suitable for lab-scale study of MSW hydrolysis. Therefore, the representativeness of an easy-to-use and reproducible reconstituted waste was verified in terms of methanogenic potential, hydrolytic profiles and associated microbial communities. Following system definition, hydrolysis behavior by percolation was compared to a reference lixiviation test (NF EN 12457-4). Surprisingly, hydrolysis by percolation permitted the extraction of 39% of carbonated matter initially contained in waste whereas 18% were extracted during hydrolysis by lixiviation, thus validating operational benefit of percolation for MSW hydrolysis. Optimization of hydrolysis performance was then conducted through the screening of eight operational parameters for their influence on MSW hydrolysis performances thanks to two Designs Of Experiment (DOE). Cumulative effect of alkalinity addition (12 gHCO3-.L-1) and percolate recirculation (6 hour.day-1) significantly improved hydrolysis yield, from 17 to 43% of extracted organic matter compared to the initial content of waste (corresponding to an extraction of 26 and 69% of biodegradable matter). Structure and activity of hydrolytic microbial communities were also studied. 16S rDNA-pyrotags sequencing brought out the dominance of classes Clostridia and Bacteroidia. Additionally, a quantitative approach led by qPCR revealed a correlation between carbonates addition, pH neutralization, amounts of hydrolyzed matter at day 14 and either class Bacteroidia or genes from hydA family, involved in fermentation. Finally, metatranscriptomic approach was conducted at day 4 in order to further study microbial activity during the intense hydrolysis phase. According to functional analysis, alkalinity seems have positive influence on class Clostridia activity. More specifically, carbonates addition seems correlated to a modification of carbohydrates metabolism of organisms affiliated to Clostridium cellulolyticum and to transcriptional up-regulation of nif operon, involved in nitrogen fixation, among various types of microorganisms.