La métagénomique sert à étudier les communautés microbiennes en analysant de l’ADN extrait directement d’échantillons pris dans la nature, elle permet également d’établir un catalogue très étendu des gènes présents dans les communautés microbiennes. Ce catalogue doit être comparé contre les gènes déjà référencés dans les bases des données afin de retrouver des séquences similaires et ainsi déterminer la fonction des séquences qui le composent. Au cours de cette thèse, nous avons développé MetaCLADE, une nouvelle méthodologie qui améliore la détection des domaines protéiques déjà référencés pour des séquences issues des données métagénomiques et métatranscriptomiques. Pour le développement de MetaCLADE, nous avons modifié un système d’annotations de domaines protéiques qui a été développé au sein du Laboratoire de Biologie Computationnelle et Quantitative appelé CLADE (CLoser sequences for Annotations Directed by Evolution) [17]. En général les méthodes pour l’annotation de domaines protéiques caractérisent les domaines connus avec des modèles probabilistes. Ces modèles probabilistes, appelés Sequence Consensus Models (SCMs) sont construits à partir d’un alignement des séquences homologues appartenant à différents clades phylogénétiques et ils représentent le consensus à chaque position de l’alignement. Cependant, quand les séquences qui forment l’ensemble des homologues sont très divergentes, les signaux des SCMs deviennent trop faibles pour être identifiés et donc l’annotation échoue. Afin de résoudre ce problème d’annotation de domaines très divergents, nous avons utilisé une approche fondée sur l’observation que beaucoup de contraintes fonctionnelles et structurelles d’une protéine ne sont pas globalement conservées parmi toutes les espèces, mais elles peuvent être conservées localement dans des clades. L’approche consiste donc à élargir le catalogue de modèles probabilistes en créant de nouveaux modèles qui mettent l’accent sur les caractéristiques propres à chaque clade. MetaCLADE, un outil conçu dans l’objectif d’annoter avec précision des séquences issues des expériences métagénomiques et métatranscriptomiques utilise cette libraire afin de trouver des correspondances entre les modèles et une base de données de séquences métagénomiques ou métatranscriptomiques. En suite, il se sert d’une étape pré-calculée pour le filtrage des séquences qui permet de déterminer la probabilité qu’une prédiction soit considérée vraie. Cette étape pré-calculée est un processus d’apprentissage qui prend en compte la fragmentation de séquences métagénomiques pour les classer.Nous avons montré que l’approche multi source en combinaison avec une stratégie de méta apprentissage prenant en compte la fragmentation atteint une très haute performance. / Metagenomics is used to study microbial communities by the analyze of DNA extracted directly from environmental samples. It allows to establish a catalog very extended of genes present in the microbial communities. This catalog must be compared against the genes already referenced in the databases in order to find similar sequences and thus determine their function. In the course of this thesis, we have developed MetaCLADE, a new methodology that improves the detection of protein domains already referenced for metagenomic and metatranscriptomic sequences. For the development of MetaCLADE, we modified an annotation system of protein domains that has been developed within the Laboratory of Computational and Quantitative Biology clade called (closer sequences for Annotations Directed by Evolution) [17]. In general, the methods for the annotation of protein domains characterize protein domains with probabilistic models. These probabilistic models, called sequence consensus models (SCMs) are built from the alignment of homolog sequences belonging to different phylogenetic clades and they represent the consensus at each position of the alignment. However, when the sequences that form the homolog set are very divergent, the signals of the SCMs become too weak to be identified and therefore the annotation fails. In order to solve this problem of annotation of very divergent domains, we used an approach based on the observation that many of the functional and structural constraints in a protein are not broadly conserved among all species, but they can be found locally in the clades. The approach is therefore to expand the catalog of probabilistic models by creating new models that focus on the specific characteristics of each clade. MetaCLADE, a tool designed with the objective of annotate with precision sequences coming from metagenomics and metatranscriptomics studies uses this library in order to find matches between the models and a database of metagenomic or metatranscriptomic sequences. Then, it uses a pre-computed step for the filtering of the sequences which determine the probability that a prediction is a true hit. This pre-calculated step is a learning process that takes into account the fragmentation of metagenomic sequences to classify them. We have shown that the approach multi source in combination with a strategy of meta-learning taking into account the fragmentation outperforms current methods.

L’exposition aux polluants environnementaux a été associée à de nombreux désordres métaboliques, immunitaires et reproductifs ainsi qu’à divers cancers. De plus en plus de travaux, indiquent que le microbiote intestinal, qui joue un rôle majeur dans l’immunité et le métabolisme de l’hôte, interagit avec les xénobiotiques dont les polluants organiques persistants (POPs) et les contaminants néoformés dans les aliments. Cette interaction peut avoir des conséquences toxicologiques importantes via la modification des fonctions du microbiote intestinal mais également via la métabolisation des xénobiotiques, entraînant une potentielle altération de l'homéostasie de l'hôte. Dans le cadre de cette thèse, nous avons démontré, en modèle in vitro, qu’une exposition aigüe du microbiote intestinal humain au benzo[a]pyrène (hydrocarbure aromatique polycyclique) a entraîné une altération des fonctions du microbiote intestinal au niveau du volatolome et du métatranscriptome microbien. Cependant, dans nos conditions expérimentales, aucun impact sur la structure microbienne n'a été observé. L’Homme étant continuellement exposé à un panel de composés chimiques environnementaux, nous avons par la suite étudié l'impact de divers POPs et produits néoformés dans les aliments sur le microbiote intestinal humain. Des familles de gènes ainsi que des composés volatiles microbiens ont été identifiés comme altérés après l’exposition, conduisant à une perturbation de l'activité microbienne. Nous avons finalement démontré que l'interaction microbiote-polluant pourrait conduire à l'établissement d'un état pro-inflammatoire modéré dans l'intestin avec une libération de cytokine IL-8 par les cellules épithéliales intestinales. Ces résultats appuient le concept émergent selon lequel les contaminants alimentaires pourraient altérer les activités du microbiote intestinal. / Exposure to environmental pollutants has been associated with various life-threatening disorders, including dysregulation of the immune and reproductive systems, metabolic diseases and various cancers. Growing evidences indicate that the gut microbiota, which plays major roles in host metabolic and immune functions, interacts with xenobiotics including persistent organic pollutants (POPs) and foodborne chemicals. The toxicological relevance of the gut microbiota-pollutant interplay is of great concern for the host since the chemicals may disrupt the gut microbiota functions leading to a potential impairment of the host homeostasis. During this PhD thesis, we demonstrated that in vitro acute exposure of the human gut microbiota with benzo[a]pyrene (polycyclic aromatic hydrocarbon) led to an impairment of the gut microbiota functions with a specific shift of the microbial volatolome and metatranscriptome. However, in our experimental conditions, no impact on the microbial structure was observed. Since humans are exposed to a wide range of environmental chemicals we investigated the impact of various POPs and foodborne chemicals on the human gut microbiota. We identified microbial volatiles and gene families that shifted after this exposure leading to an imbalance of the microbial activity. Furthermore, we demonstrated that the interaction between the pollutants and the gut microbiota lead to a significant release of pro-inflammatory IL-8 cytokine by the intestinal epithelial cells which may contribute to the establishment of a low-grade inflammatory state in the gut. All together, these data support the emerging concept that food pollutants could alter the gut microbiota activities.

Le sol est essentiel à toute société humaine notamment pour la production d'aliments. Son fonctionnement repose sur des réseaux d'interactions entre les éléments qui le composent et toute perturbation modifie ces réseaux. Les microorganismes eucaryotes représentent une composante importante de l'écosystème édaphique car ils sont impliqués dans des processus essentiels comme la régulation de populations de procaryotes. Mais paradoxalement, ils restent peu étudiés comparés aux bactéries notamment lorsqu'on s'intéresse aux cycles biogéochimiques autres que celui du carbone comme par exemple ceux des métaux. Suite à une pollution par des métaux, certains de ces microorganismes eucaryotes développent des mécanismes « de résistance » cellulaires. Dans ce contexte, le laboratoire d'accueil a isolé, directement à partir d'extraits d'ARN de sol, des gènes eucaryotes impliqués dans la résistance cellulaire au Cd. Ces nouveaux gènes forment une famille codant des protéines riches en cystéines dont les positions sont conservées au sein de cette famille. Mon projet de thèse a eu pour but de caractériser l'origine taxonomique et la fonction de cette famille de gènes. Dans un premier temps, la purification de cinq de ces protéines produites dans Escherichia coli et leurs caractérisations biochimiques par des méthodes spectrométriques ont permis de montrer que cette famille génique constitue une nouvelle famille de métallothionéines capables de chélater in vitro le Zn, le Cu et le Cd. Dans un second temps, une méthode de quantification par PCR quantitative de l'expression de ces gènes, extraits à partir de sol provenant de microcosmes, a été mise au point. Dans un troisième temps, nous avons tenté d'obtenir les régions génomiques bordant ces gènes environnementaux afin d'affilier les organismes qui les portent à un groupe taxonomique et d'analyser les régions promotrices de ces gènes par capture ciblée de gènes / Soil is essential to human societies, especially for food production. Its functioning relies on interaction networks sensitive to environmental alterations. Eukaryotic microorganisms are an important component of the soil ecosystem where they are involved in essential processes such as the regulation of prokaryotic populations. However, they remain poorly studied compared to bacteria, especially concerning their roles in biogeochemical cycles other than the carbon one such as metal cycles. In response to soil metal contamination, some of these eukaryotic microorganisms develop cellular "resistance" mechanisms. In this context, the host laboratory has previously isolated, directly from soils, eukaryotic genes able to confer Cd resistance. These genes form a family coding for cysteine-rich proteins whose cysteine positions are conserved within this sequences. My thesis project aimed at characterizing the function and taxonomic origin of this gene family. First, the purification of five of these proteins produced in Escherichia coli and their biochemical characterizations by spectrometric methods demonstrated that this gene family constitutes a new family of metallothioneins capable of chelating in vitro Zn, Cu and Cd. Some of these proteins are also able to confer Zn resistance when expressed in a sensitive yeast strain. In a second step, quantitative PCR methods for measuring expression levels of these genes in soil microcosms were developed. This will allow to evaluate the level of expression of these genes as a function of an increasing supply of exogenous metal. In a third step, we tried to obtain the genomic regions flanking these environmental genes in order to be able to associate the organisms from which they originate to a taxonomic group and to analyze the promoter regions of these genes using targeted capture

Les populations naturelles sont confrontées à des changements environnementaux. Pour y faire face, différentes réponses ont été sélectionnées au cours de l'évolution. Parmi elles se trouvent la plasticité phénotypique et l'adaptation génétique. Etudier les liens existants entre elles est une manière de comprendre les dynamiques des populations et de prévoir leurs réponses à un environnement changeant. Dans la présente étude, je me suis attaché à étudier ces liens à plusieurs échelles (intra- et interspécifique), chez le complexe d'espèces cryptiques de la micro-algue Alexandrium minutum, et ce à la fois in vitro et in situ. En ce qui concerne la plasticité phénotypique, ces deux espèces proches montrent de profondes différences, soulignant les liens entre divergence génétique et écologique. Au niveau intraspécifique, il apparaît que face à des variations de facteurs abiotiques, les populations ajustent les niveaux d'expression de certains gènes (notamment impliqués dans des fonctions de motilité et d'interactions intercellulaires dans des environnements froids à faible salinité). D'autre part, les populations montrent de la différentiation génétique à la fois à faible échelle spatiale, au cours du temps, et lorsque la communauté change. Pour conclure, il existe une interaction directe entre divergence génétique et changements d'expression de gènes. En plus de poser de nombreuses questions quant aux capacités de réponse des populations, ces résultats soulignent comment plasticité phénotypique et changements génétique sont liés et interagissent. Ils offrent une perspective nouvelle sur les mécanismes qui sous-tendent les réponses des populations à leur environnement. / Natural populations face environmental changes. In this context, different responses were evolutionnary selected. Among them are phenotypic plasticity and genetic adaptation. Studying the links between these two types of response is a way to understand population dynamics and to predict how they may respond to a changing environment. In the present Ph.D thesis, I focused on studying these links at several scales (intra- and interspecific), in the cryptic species complex of the microalga Alexandrium minutum, both in vitro and in situ. With respect to phenotypic plasticity, these two closely related species show profound differences, highlighting the links between genetic and ecological divergence. At the intraspecific level, it appears that, when facing abiotic factors variations, populations adjust the expression levels of certain genes (notably involved in motility related functions and intercellular interactions under low-salinity and cold environments). On the other hand, populations show genetic differentiation at both small spatial scale, over time, and when the community changes. To conclude, there is a direct interaction between genetic divergence and changes in gene expression. In addition to asking many questions about the response capabilities of populations, these results highlight how phenotypic plasticity and genetic changes are linked and interact. They offer new perspectives on the mechanisms underlying population responses to their environment.

Au sein des sols forestiers, la richesse taxonomique et le rôle des microorganismes eucaryotes (en grande partie des champignons) restent encore largement méconnus. L’espèce d’arbre est un des facteurs qui structurent les communautés de ces microorganismes. Nous avons étudié l’impact de l’essence forestière (hêtre et épicéa) sur la diversité taxonomique et fonctionnelle de ces communautés par une approche métatranscriptomique et une approche biochimique (focalisée sur les champignons ectomycorhiziens). Nous avons montré un effet de la séquence étudiée (ADNr 18S, ADNc) sur la distribution taxonomique des communautés et développé un nouveau marqueur moléculaire mitochondrial pour l’étude des communautés de champignons métaboliquement actifs. L’identification de gènes d’intérêt écologique et industriel par séquençage systématique des banques métatranscriptomiques ainsi que l’identification fonctionnelle d’une nouvelle famille de transporteursmembranaires montrent l’intérêt de l’approche métatranscriptomique. L’approche biochimique a consisté en un dosage à haut débit, sur des extrémités racinaires ectomycorhizés, d’activités enzymatiques liées à la dégradation de la matière organique et à la mobilisation de l’azote et du phosphore du sol. L’ensemble de ces approches a permis de montrer un impact de l’essence forestière sur la nature des espèces présentes plutôt que sur la richesse taxonomique et une préférence d’hôte de certains groupes fongiques ectomycorhiziens. L’approche biochimique a montré une redondance fonctionnelle importante pour certaines activités enzymatiques tandis qu’une autre activité enzymatique était spécifique d’un groupe taxonomique fongique. / In forest soils, taxonomic richness and functional diversity of eukaryotic microorganisms (mainly Fungi) remain largely unknowned. Tree species is one of the main factors that structure eukaryotic microbial communities. We have studied the impact of tree species (beech and spruce) on taxonomic and functional diversity of these communities by using a metatranscriptomic approach and a biochemical one focusing on ectomycorrhizal fungi. We showed an effet of different sequences (18S rDNA, cDNA) on taxonomic composition of eukaryotic microbial communities and we developped anew mitochondrial molecular marker for the study of metabolically active fungal communities. Identification of ecologically and industrially important genes by the shotgun sequencing of metatranscriptomic libraries and also identification of a new family of transmembrane transporter demonstrate the great potential of the metatranscriptomic approach. The biochemical approachconsisted in a multiple enzymatic test carried out on ectomycorrhizal roots, of enzyme activities linked to organic matter degradation and phosphorus and nitrogen mobilization. All these approaches revealed an impact of tree species on the microbial species composition but not on taxonomic richness and also host preference for some ectomycorrhizal taxonomic groups. The biochemical approach showed a high functional redundancy for some enzyme activities while one activity was very specific of an ectomycorrhizal taxonomic group.

La dégradation des fibres alimentaires est une fonction essentielle des écosystèmes digestifs microbiens. Chez le ruminant, elle est assurée par des bactéries, champignons et protozoaires capables de produire de nombreuses enzymes nécessaires à l’hydrolyse des polysaccharides de paroi végétale. Parmi les facteurs susceptibles d’influencer l’efficacité de dégradation des fibres, qui est une composante importante de la productivité et de la santé animales, des additifs tels que des levures probiotiques apparaissent comme un levier intéressant. Afin d’approfondir les connaissances sur les facteurs de modulation de l’activité fibrolytique, une biopuce ADN fonctionnelle, outil moléculaire haut-débit, ciblant les gènes codant les enzymes clés de la dégradation de la cellulose et des xylanes dans les écosystèmes digestifs a été développée. Aussi, une méthode efficace dédiée à des échantillons ruminaux pour la soustraction des ARNr à partir des ARN totaux a été mise au point afin d’accroitre la sensibilité de l’outil. La biopuce fonctionnelle a été validée sur échantillons de complexité croissante et démontre d’excellents caractères de spécificité et de sensibilité tout en étant exploratoire et quantitative. Des régulations différentielles de l’arsenal des gènes de la fibrolyse de la bactérie du rumen Fibrobacter succinogenes ont pu être montrées. De même, les résultats sur échantillons de rumen suggèrent un rôle des microorganismes eucaryotes dans la fibrolyse pouvant être plus important qu’initialement envisagé. Cette approche métatranscriptomique dirigée pourra in fine continuer d’être appliquée dans l’étude de l’impact de facteurs biotiques et abiotiques sur la fonction fibrolytique microbienne chez les animaux d’élevage. / Dietary fibre degradation is an essential function of microbial digestive ecosystems. In ruminants, this function is ensured by bacteria, fungi and protozoa, producing a large array of enzymes able to degrade plant cell wall polysaccharides. Among factors likely to influence the efficiency of fibre degradation, which is an important component in animal productivity and health, dietary additives such as probiotic yeasts appear as an interesting tool. To provide more insight on factors modulating fibrolytic activity, we designed a functional DNA microarray targeting genes coding for key enzymes involved in cellulose and xylan degradation by digestive microbiota. Also, an efficient method dedicated to rumen samples for removing microorganisms’ rRNA from total RNA samples was developed to increase the sensitivity of the tool. The DNA microarray was validated using targets of increasing complexity and demonstrated sensitivity and specificity as well as explorative and quantitative potential. Differential expression of genes involved in fibrolysis was evidenced in the rumen bacterium Fibrobacter succinogenes. Moreover, results on rumen samples suggest a more important role of eucaryotes in fibre degradation than previously thought. This targeted metatranscriptomic approach will be further applied to the study of the impact of biotic and abiotic factors on the microbial mechanisms of fibre degradation in livestock.

Dans le cadre des législations européennes relatives au traitement des déchets et aux énergies renouvelables, la méthanisation apparaît comme une alternative prometteuse pour la stabilisation et la valorisation des Ordures Ménagères Résiduelles (OMR). D'un point de vue opérationnel l'hétérogénéité et les difficultés de mise en mouvement d'une matrice aussi complexe que les OMR sont à l'origine de pertes de rendement voire de l'arrêt d'installations de méthanisation. Les performances de méthanisation sont en particulier limitées par l'étape d'hydrolyse des fractions lignocellulosiques qui représentent la majorité du potentiel méthanogène des OMR. Dans ce contexte, l'objectif principal du travail de thèse, était l'étude d'un procédé de percolation dans lequel le déchet n'est pas mis en mouvement. Au travers de ce travail nous avions également pour ambition de produire des connaissances à caractère plus générique sur l'hydrolyse afin d'en améliorer les performances. Des expériences préliminaires ont d'abord permis la définition d'un système expérimental adéquat pour l'étude à l'échelle laboratoire de l'hydrolyse des OMR. La représentativité d'un déchet reconstitué, reproductible et d'utilisation aisée, a notamment été vérifiée en termes de potentiel méthanogène, de profil hydrolytique et de flore microbienne. Suite à la définition de ce système expérimental, son comportement hydrolytique a été comparé à celui d'un test de lixiviation de référence (NF EN 12457-4) afin de valider l'intérêt opérationnel de la percolation pour l'hydrolyse des OMR. De façon inattendue, l'extraction de 38,90% de la matière carbonée initiale du déchet a ainsi été mise en évidence lors de l'hydrolyse par percolation contre 17,84% lors de l'hydrolyse par lixiviation, renforçant l'intérêt suscité par la percolation pour l'hydrolyse des OMR. L'optimisation des performances d'hydrolyse par percolation a ensuite été réalisée par le criblage de huit paramètres opérationnels afin de déterminer leur influence sur les performances d'hydrolyse des OMR, au travers de deux plans d'expérience. L'ajout d'alcalinité (12 gHCO3-.L-1) et la recirculation du percolat pendant 6 h par jour ont ainsi permis d'augmenter significativement les performances d'hydrolyse, passant de 17 à 43% d'extraction de la matière organique (DCO) initiale du déchet (autrement dit de 26 à 69% de la matière biodégradable initiale). L'étude des communautés microbiennes et de leur activité a également été réalisée. Le séquençage des pyrotags d'ADNr 16S a ainsi permis de mettre en évidence le caractère dominant des Classes Clostridia et Bacteroidia au sein des communautés hydrolytiques. Le couplage de cette démarche qualitative à une approche quantitative par qPCR sur une série de biomarqueurs taxonomiques et fonctionnels a permis de montrer qu'il existe une corrélation positive entre l'ajout de carbonates, la neutralisation du pH, la quantité de matière hydrolysée à 14 jours et soit l'abondance de la Classe Bacteroidia soit celle des gènes de la famille hydA, impliqués dans la fermentation. Finalement, l'analyse microbiologique a été approfondie au jour 4, c'est-à-dire durant la phase d'hydrolyse intense, grâce à une approche de métatranscriptomique. L'analyse des transcrits fonctionnels indique que l'alcalinité influence l'activité des microorganismes de la Classe Clostridia dès le jour 4 des essais d'hydrolyse. Plus spécifiquement, l'ajout de carbonates semble corrélé à une modification du métabolisme des sucres chez des microorganismes non cultivables apparentés à Clostridium cellulolyticum et à l'augmentation de l'expression de l'opéron nif, impliqué dans la fixation de l'azote, chez différents groupes de microorganismes. / In the framework of the European green policy, anaerobic digestion appears as a promising technology for stabilization and valorization of Municipal Solid Waste (MSW). In practice, mechanical mixing of a complex and heterogeneous matrix such as MSW induces major operational constraints. Anaerobic digestion performances are especially limited by hydrolysis of lignocellulosic fractions which represent the main part of MSW methanogenic potential. In this context, this PhD project was aiming to characterize and optimize of a percolation process in which MSW stands still. Preliminary experiments were conducted in order to define an experimental system suitable for lab-scale study of MSW hydrolysis. Therefore, the representativeness of an easy-to-use and reproducible reconstituted waste was verified in terms of methanogenic potential, hydrolytic profiles and associated microbial communities. Following system definition, hydrolysis behavior by percolation was compared to a reference lixiviation test (NF EN 12457-4). Surprisingly, hydrolysis by percolation permitted the extraction of 39% of carbonated matter initially contained in waste whereas 18% were extracted during hydrolysis by lixiviation, thus validating operational benefit of percolation for MSW hydrolysis. Optimization of hydrolysis performance was then conducted through the screening of eight operational parameters for their influence on MSW hydrolysis performances thanks to two Designs Of Experiment (DOE). Cumulative effect of alkalinity addition (12 gHCO3-.L-1) and percolate recirculation (6 hour.day-1) significantly improved hydrolysis yield, from 17 to 43% of extracted organic matter compared to the initial content of waste (corresponding to an extraction of 26 and 69% of biodegradable matter). Structure and activity of hydrolytic microbial communities were also studied. 16S rDNA-pyrotags sequencing brought out the dominance of classes Clostridia and Bacteroidia. Additionally, a quantitative approach led by qPCR revealed a correlation between carbonates addition, pH neutralization, amounts of hydrolyzed matter at day 14 and either class Bacteroidia or genes from hydA family, involved in fermentation. Finally, metatranscriptomic approach was conducted at day 4 in order to further study microbial activity during the intense hydrolysis phase. According to functional analysis, alkalinity seems have positive influence on class Clostridia activity. More specifically, carbonates addition seems correlated to a modification of carbohydrates metabolism of organisms affiliated to Clostridium cellulolyticum and to transcriptional up-regulation of nif operon, involved in nitrogen fixation, among various types of microorganisms.