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Die Untereinheitenstöchiometrie des humanen P2X2/3-RezeptorsSchmid, Julia Anna Maria 02 May 2019 (has links)
Heteromere P2X2/3-Rezeptoren befinden sich neben homomeren P2X3-Rezeptoren an peripheren und zentralen Endigungen von nozizeptiven Spinalganglienneuronen und spielen eine Rolle bei der Entstehung von akuten und chronischen Schmerzen, die im Rahmen von Verletzungen, Entzündungen, Tumorerkrankungen und Neuropathien auftreten. Bislang ging man davon aus, dass P2X2/3-Rezeptoren eine festgelegte Untereinheitenstöchiometrie von
(P2X2)1/(P2X3)2 aufweisen. In der vorliegenden Arbeit wird an transient mit der cDNA von hP2X2 und hP2X3 transfizierten HEK293-Zellen untersucht, inwiefern sich heteromere P2X2/3-Rezeptoren in Abhängigkeit vom gewählten Transfektionsverhältnis P2X2/P2X3-1:2 und -4:1 in Bezug auf ihre pharmakologischen Eigenschaften funktionell unterscheiden und somit wahrscheinlich auch in einer alternativen Untereinheitenstöchiometrie von (P2X2)2/(P2X3)1 vorkommen. Die Ergebnisse der durchgeführten Ca2+-Imaging-Experimente legen die Schlussfolgerung nahe, dass bei P2X2/3-Rezeptoren abhängig vom jeweiligen Expressionslevel der beteiligten P2X-Subtypen beide Untereinheitenstöchiometrien 1:2 und 2:1 existieren, dass sie sich aber in ihren funktionellen Eigenschaften nicht wesentlich voneinander unterscheiden. Diese
Erkenntnisse tragen zur Vervollständigung des Wissens über P2X2/3-Rezeptoren bei, die ein potenzielles Target für die Entwicklung neuer, analgetisch wirksamer Arzneimittel darstellen.:I Bibliographische Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1 Einleitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.1 Das purinerge Signalsystem (engl. purinergic signalling) . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2 Purinerge Rezeptoren als pharmakologisches Target . . . . . . . . .. . . . . . . . . . 6
1.3 P2X-Rezeptoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3.1 Aufbau einer P2X-Untereinheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3.2 3D-Struktur, ATP-Bindung und Kanalöffnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.3.3 Desensitisierung und allosterische Modulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.3.4 Homo- und Heterotrimere . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.3.5 ATP-Bindungsstellen in Heteromeren und Untereinheitenstöchiometrie . . .12
1.4 Der P2X2/3-Rezeptor und seine Rolle im nozizeptiven System . . . . . .. . . . . 13
1.5 Pharmakologische Eigenschaften von P2X2, P2X3 und P2X2/3 . . . . . . . . . . 15
1.6 Das Ziel meiner Arbeit . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2 Material und Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.1 Zellkultur . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.1.1 HEK293-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.1.2 Plasmide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.1.3 Mutagenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.1.4 Transfektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2 Ca2+-Imaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2.1 Fura-2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2.2 Fluoreszenzmikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.3 Datengewinnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.3.1 Arbeitsplatz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.3.2 Ablauf eines Experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.4 Datenauswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3 Ergebnisse . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.1 Nomenklatur zur Untereinheitenstöchiometrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.2 Versuchskomplex I: Experimente mit hP2X2- und hP2X3-Mutanten . . . . . . . 27
3.2.1 Konzentrations-Wirkungs-Kurven der Wildtyp-Rezeptorvarianten . . . . . . 28
3.2.2 Inaktivität der verwendeten Mutanten in homomeren Konstellationen . . . . 30
3.2.2.1 P2X2-Mutanten K69A und K307A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.2.2.2 P2X3-Mutanten K63A und K299A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.2.3 Mutationen im NBS1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.2.4 Mutationen im NBS4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.3 Versuchskomplex II: Rezeptormodifikation durch Veränderung des pH-Werts34
3.3.1 Applikation von αβ-meATP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.3.2 Applikation von 2-MeSATP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.4 Versuchskomplex III: Einsatz des kompetitiven Antagonisten A-317491 mit
αβ-meATP . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4 Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.1 Nullhypothese und Arbeitshypothese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4.2 Transfektionsverhältnis und resultierende Untereinheitenstöchiometrie .. . . 40
4.3 Versuchskomplex I: Experimente mit inaktiven hP2X2- und hP2X3-Mutanten 40
4.4 Versuchskomplex II: Rezeptormodifikation durch Veränderung des pH-Werts43
4.4.1 Vergleich mit den Ergebnissen der Patch-Clamp-Methode . . . . . . . . . . 44
4.4.2 Pathophysiologischer Aspekt von saurem pH in der extrazellulären Matrix 45
4.5 Versuchskomplex III: Einsatz des kompetitiven Antagonisten A-317491 . . . . 45
4.6 Zusammenfassung und Schlussfolgerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . 47
5 Ergänzende Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
6 Abkürzungsverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
7 Abbildungsverzeichnis mit Quellenangaben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
8 Tabellenverzeichnis mit Quellenangaben . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . 55
9 Zubehör . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
10 Literaturverzeichnis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
II Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
III Lebenslauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
IV Danksagung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
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Untersuchung der Interaktion der Untereinheiten im humanen P2X2- und P2X2/3-Rezeptor durch Cystein-substituierte AminosäurenLindner, Anna 02 December 2015 (has links) (PDF)
P2X-Rezeptoren treten aufgrund ihrer Präsenz in verschiedensten Organsystemen des menschlichen Körpers zunehmend in den Mittelpunkt zahlreicher Forschungsansätze. Besonderes Interesse gilt dabei u.a. den P2X2/3-Rezeptoren, da in ihnen ein neuer Angriffspunkt für die Entwicklung von Schmerztherapeutika gesehen wird. Trotz enormer Fortschritte in diesem Bereich, bleiben die Vorgänge und strukturellen Gegebenheiten, die zur Öffnung der Ionenkanäle führen, weiterhin spekulativ.
In der vorliegenden Arbeit wurden mithilfe einer Mutagenese einzelne Aminosäuren des hP2X2-Rezeptors, welche sich in geringer Entfernung zueinander zwischen zwei Untereinheiten befanden, durch Cysteine substituiert. Die Auswahl der Aminosäuren erfolgte dabei anhand eines Homologiemodells des hP2X2-Rezeptors und des Aminosäureabgleichs zwischen den hP2X2- und hP2X3-Rezeptoren. Auf diese Weise sollte deren Interaktion über eine mögliche Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen zwei Untereinheiten untersucht werden. Die Rezeptorfunktion wurde anschließend mittels der whole-cell patch-clamp-Technik charakterisiert. Der Rezeptor reagierte bei allen untersuchten Varianten mit einem Funktionsverlust, ein spontan öffnender Kanal konnte somit nicht generiert werden.
Durch die Kombination der verschiedenen hP2X2-Rezeptor-Cysteinmutanten mit einer hP2X3-Rezeptor-Cysteindoppelmutante, konnte gezeigt werden, dass sich die verschiedenen Untereinheiten im heterotrimeren hP2X2/3-Rezeptor nicht soweit annähern, dass eine Disulfidbrücken-Bildung zwischen den Untereinheiten möglich wird. Es konnte allerdings verdeutlicht werden, dass für die Aktivierung des heterotrimeren hP2X2/3-Rezeptors zwei funktionelle Bindungsstellen zur Kanalaktivierung ausreichen.
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Untersuchung der Interaktion der Untereinheiten im humanen P2X2- und P2X2/3-Rezeptor durch Cystein-substituierte AminosäurenLindner, Anna 22 October 2015 (has links)
P2X-Rezeptoren treten aufgrund ihrer Präsenz in verschiedensten Organsystemen des menschlichen Körpers zunehmend in den Mittelpunkt zahlreicher Forschungsansätze. Besonderes Interesse gilt dabei u.a. den P2X2/3-Rezeptoren, da in ihnen ein neuer Angriffspunkt für die Entwicklung von Schmerztherapeutika gesehen wird. Trotz enormer Fortschritte in diesem Bereich, bleiben die Vorgänge und strukturellen Gegebenheiten, die zur Öffnung der Ionenkanäle führen, weiterhin spekulativ.
In der vorliegenden Arbeit wurden mithilfe einer Mutagenese einzelne Aminosäuren des hP2X2-Rezeptors, welche sich in geringer Entfernung zueinander zwischen zwei Untereinheiten befanden, durch Cysteine substituiert. Die Auswahl der Aminosäuren erfolgte dabei anhand eines Homologiemodells des hP2X2-Rezeptors und des Aminosäureabgleichs zwischen den hP2X2- und hP2X3-Rezeptoren. Auf diese Weise sollte deren Interaktion über eine mögliche Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen zwei Untereinheiten untersucht werden. Die Rezeptorfunktion wurde anschließend mittels der whole-cell patch-clamp-Technik charakterisiert. Der Rezeptor reagierte bei allen untersuchten Varianten mit einem Funktionsverlust, ein spontan öffnender Kanal konnte somit nicht generiert werden.
Durch die Kombination der verschiedenen hP2X2-Rezeptor-Cysteinmutanten mit einer hP2X3-Rezeptor-Cysteindoppelmutante, konnte gezeigt werden, dass sich die verschiedenen Untereinheiten im heterotrimeren hP2X2/3-Rezeptor nicht soweit annähern, dass eine Disulfidbrücken-Bildung zwischen den Untereinheiten möglich wird. Es konnte allerdings verdeutlicht werden, dass für die Aktivierung des heterotrimeren hP2X2/3-Rezeptors zwei funktionelle Bindungsstellen zur Kanalaktivierung ausreichen.
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