Neste estudo foram avaliados os efeitos das serinoproteinases PA-BJ e giroxina, isoladas dos venenos das serpentes Bothrops jararaca e Crotalus durissus terríficus, respectivamente, sobre células endoteliais (CEs) em cultura. Os resultados obtidos demonstraram que essas toxinas, nas concentrações utilizadas, não afetaram a viabilidade e a integridade das CEs. Por outro lado, induziram a liberação de PGI2, que foi significativamente reduzida por inibidores não seletivos e seletivos das ciclooxigenases -1 e -2 (COX-1 e -2), mas não afetaram a expressão protéica constitutiva das mesmas. Adicionalmente, foi demonstrado que o antagonista de receptores PAR-1, o SCH 79797, não alterou a liberação de PGI2, induzida pelas toxinas. Em conclusão, essas toxinas, em concentrações não citotóxicas, induziram a liberação de PGI2 a partir de CEs, de modo dependente da ativação das COX-1 e -2. Por outro lado, o receptor PAR-1 não parece ser importante para este efeito, nessas células. / In this study, the effects of PA-BJ and gyroxin, isolated from Bothrops jararaca and Crotalus durissus terrificus snake venoms, respectively, on endothelial cells in culture were investigated. Results showed that neither PA-BJ nor gyroxin affected the integrity of monolayers nor modified ECs viability in the periods of incubation tested. In contrast, these serine proteinases increased the release of prostacyclin from ECs. This effect was inhibited by both non-selective and selective COX-1 and COX-2 inhibitors, but these toxins did not affect the protein expression of COX-1 and -2. Inhibition of the catalytic activity of PA-BJ and gyroxin or pre-incubation of ECs with PAR-1 antagonist did not abrogate the ability of these toxins to induce PGI2 release. These findings demonstrate that these serine proteinases are able to stimulate production of prostacyclin by ECs by a mechanism dependent on stimulation of COX-1 and COX-2 enzyme activity. Moreover, neither enzyme activity of both serine proteinases nor the receptor PAR-1 contribute for this effect on endothelium.

Plaquetas são fragmentos celulares anucleados, derivados de megacariócitos, que estão envolvidos em diversos processos fisiológicos e patológicos, como coagulação, inflamação, trombose, aterosclerose, e metástase e angiogênese tumorais. Para executar estas funções, plaquetas ativadas secretam uma fração solúvel de moléculas presentes em seus conteúdos granulares, que passam a interagir com outras moléculas e células adjacentes ao local da injúria, e com os próprios receptores plaquetários. No entanto, os mecanismos que regem a secreção em plaquetas ainda são pouco conhecidos. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi analisar comparativamente a agregação de plaquetas ativadas por dois diferentes agonistas enzimáticos: a trombina, um dos mais importantes agonistas plaquetários, e a PA-BJ, uma serinoproteinase do veneno da Bothrops jararaca, que assim como a trombina, ativa plaquetas através dos receptores PAR-1 e PAR-4. Neste estudo foram utilizadas abordagens de espectrometria de massas e de bioinformática para caracterizar alterações nos proteomas do sedimento de plaquetas não ativadas e ativadas, e também, para em paralelo analisar as frações proteicas e peptídicas presentes no sobrenadante (secretoma). Nas análises do sedimento de plaquetas ativadas tanto por PA-BJ quanto por trombina, foi verificada a menor abundância das proteínas PBP, PF4, proteína S, fibronectina, fator V e alfa-1 antitripsina, entre outras, e que também foram identificadas no sobrenadante (secretadas), e o aumento de abundância das proteínas ADAM-10, tromboxano A2 sintase, integrina αlIb, miosina-9 e fosforilase b, que estão diretamente envolvidas na ativação/agregação. Por outro lado, verificamos que na secreção plaquetária induzida por trombina ocorreu o aumento de abundância de proteínas envolvidas na regulação da formação do coágulo, como a proteína S, PAI1 e antitrombina III, sugerindo que nos eventos disparados pela trombina, exista uma regulação rigorosa de sua ação no local da injúria vascular. Já na secreção induzida por PA-BJ, verificamos o aumento significativo das proteínas amiloide beta A4 e do fibrinogênio, envolvidas na ativação/agregação plaquetária, além da liberação e ativação de MMP1, indicando que esta metaloproteinase atue sinergicamente com a PA-BJ para a formação e estabilização do agregado plaquetário. Nas análises do secretoma de plaquetas não ativadas, identificamos pela primeira vez, a presença das proteínas catalase, anidrase carbônica, inibidor de elastase leucocitária e a glicoproteína rica em histidina, que estão envolvidas na inibição e regulação da ativação plaquetária. A análise da fração peptídica do sobrenadante plaquetário permitiu avaliar pela primeira vez o degradoma gerado no processo de agregação por PA-BJ e trombina. O conjunto de peptídeos resultante da ativação plaquetária pela PA-BJ é maior e mais complexo do que aquele gerado pela ação da trombina, sugerindo que as vias ativadas por ambas sejam diferenciais e sujeitas a diferentes controles de regulação da proteólise. Além disso, a degradação seletiva de algumas proteínas, e o conjunto de peptídeos gerados, poderiam ter um papel no controle da ativação e agregação plaquetárias. Em conjunto, nossos resultados demostram que, embora a PA-BJ e a trombina induzam a agregação plaquetária mediada pelos receptores PAR-1 e PAR-4, estas enzimas induzem vias diferentes, alterando a secreção plaquetária para levar à agregação. / Platelets are anucleated cell fragments derived from megakaryocytes which are involved in many physiological and pathological processes, such as coagulation, inflammation, thrombosis, atherosclerosis, and tumor angiogenesis and metastasis. To perform these functions, activated platelets secrete a soluble fraction of molecules present in their granules, which then interact with other molecules and cells adjacent to the site of injury, and with platelet receptors. However, the mechanisms governing secretion in platelets are still poorly understood. Therefore, the objective of this study was to comparatively analyze the aggregation of platelets activated by two different enzyme agonists: thrombin, one of the most important platelet agonists, and PA-BJ, a serine proteinase from Bothrops jararaca venom, which, like thrombin, causes platelet aggregation mediated by the receptors PAR-1 and PAR-4. For this purpose, approaches of mass spectrometry and bioinformatics were used to characterize changes in the proteome of non-activated and activated platelets, and also to analyze proteins and peptides present in the supernatant of aggregated platelets (secretome). In the analysis of the sediment of platelets activated by PA-BJ and thrombin, various proteins, such as PBP, PF4, protein S, fibronectin, factor V, and alpha-1 antitrypsin, were detected in lower abundance while they were also identified as secreted, in the supernatant; likewise, proteins that are directly involved in the activation/aggregation, such as ADAM-10, thromboxane A2 synthase, integrin αIIb, myosin-9 and phosphorylase b were identified in higher abundance in platelets activated by PA-BJ and thrombin. Moreover, we found that in the thrombin-induced platelet secretion there was increased abundance of proteins involved in the regulation of blood clot formation, such as protein S, and antithrombin III PAI1, suggesting that in the events triggered by thrombin, there is strict regulation of its action at the site of vascular injury. In the analysis of the secretion induced by PA-BJ, we found a significant increase in amyloid beta A4 protein and fibrinogen, which are involved in the platelet activation/aggregation, in addition to the release and activation of MMP-1, indicating that this metalloproteinase acts synergistically with PA-BJ in the formation and stabilization of the platelet thrombus. In the analysis of the non-activated platelet secretome, we identified for the first time the presence of catalase, carbonic anhydrase, leukocyte elastase inhibitor and histidine-rich glycoprotein, which are involved in the inhibition and regulation of platelet activation. The analysis of the peptide fraction of the supernatant of activated platelets enabled the characterization, for the first time, of the degradome generated in the process of aggregation by thrombin and PA-BJ. The resulting set of peptides generated upon platelet activation by PA-BJ is larger and more complex than that generated by the action of thrombin, suggesting that the pathways activated by both are differential and are subject to different controls of proteolysis. Furthermore, the selective degradation of some proteins, and the set of generated peptides could play a role in the control of platelet activation and aggregation. Taken together, our findings demonstrate that although both PA-BJ and thrombin induce platelet aggregation via PAR-1 and PAR-4, these enzymes activate different pathways to cause platelet secretion and aggregation.

Plaquetas são fragmentos celulares anucleados, derivados de megacariócitos, que estão envolvidos em diversos processos fisiológicos e patológicos, como coagulação, inflamação, trombose, aterosclerose, e metástase e angiogênese tumorais. Para executar estas funções, plaquetas ativadas secretam uma fração solúvel de moléculas presentes em seus conteúdos granulares, que passam a interagir com outras moléculas e células adjacentes ao local da injúria, e com os próprios receptores plaquetários. No entanto, os mecanismos que regem a secreção em plaquetas ainda são pouco conhecidos. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi analisar comparativamente a agregação de plaquetas ativadas por dois diferentes agonistas enzimáticos: a trombina, um dos mais importantes agonistas plaquetários, e a PA-BJ, uma serinoproteinase do veneno da Bothrops jararaca, que assim como a trombina, ativa plaquetas através dos receptores PAR-1 e PAR-4. Neste estudo foram utilizadas abordagens de espectrometria de massas e de bioinformática para caracterizar alterações nos proteomas do sedimento de plaquetas não ativadas e ativadas, e também, para em paralelo analisar as frações proteicas e peptídicas presentes no sobrenadante (secretoma). Nas análises do sedimento de plaquetas ativadas tanto por PA-BJ quanto por trombina, foi verificada a menor abundância das proteínas PBP, PF4, proteína S, fibronectina, fator V e alfa-1 antitripsina, entre outras, e que também foram identificadas no sobrenadante (secretadas), e o aumento de abundância das proteínas ADAM-10, tromboxano A2 sintase, integrina αlIb, miosina-9 e fosforilase b, que estão diretamente envolvidas na ativação/agregação. Por outro lado, verificamos que na secreção plaquetária induzida por trombina ocorreu o aumento de abundância de proteínas envolvidas na regulação da formação do coágulo, como a proteína S, PAI1 e antitrombina III, sugerindo que nos eventos disparados pela trombina, exista uma regulação rigorosa de sua ação no local da injúria vascular. Já na secreção induzida por PA-BJ, verificamos o aumento significativo das proteínas amiloide beta A4 e do fibrinogênio, envolvidas na ativação/agregação plaquetária, além da liberação e ativação de MMP1, indicando que esta metaloproteinase atue sinergicamente com a PA-BJ para a formação e estabilização do agregado plaquetário. Nas análises do secretoma de plaquetas não ativadas, identificamos pela primeira vez, a presença das proteínas catalase, anidrase carbônica, inibidor de elastase leucocitária e a glicoproteína rica em histidina, que estão envolvidas na inibição e regulação da ativação plaquetária. A análise da fração peptídica do sobrenadante plaquetário permitiu avaliar pela primeira vez o degradoma gerado no processo de agregação por PA-BJ e trombina. O conjunto de peptídeos resultante da ativação plaquetária pela PA-BJ é maior e mais complexo do que aquele gerado pela ação da trombina, sugerindo que as vias ativadas por ambas sejam diferenciais e sujeitas a diferentes controles de regulação da proteólise. Além disso, a degradação seletiva de algumas proteínas, e o conjunto de peptídeos gerados, poderiam ter um papel no controle da ativação e agregação plaquetárias. Em conjunto, nossos resultados demostram que, embora a PA-BJ e a trombina induzam a agregação plaquetária mediada pelos receptores PAR-1 e PAR-4, estas enzimas induzem vias diferentes, alterando a secreção plaquetária para levar à agregação. / Platelets are anucleated cell fragments derived from megakaryocytes which are involved in many physiological and pathological processes, such as coagulation, inflammation, thrombosis, atherosclerosis, and tumor angiogenesis and metastasis. To perform these functions, activated platelets secrete a soluble fraction of molecules present in their granules, which then interact with other molecules and cells adjacent to the site of injury, and with platelet receptors. However, the mechanisms governing secretion in platelets are still poorly understood. Therefore, the objective of this study was to comparatively analyze the aggregation of platelets activated by two different enzyme agonists: thrombin, one of the most important platelet agonists, and PA-BJ, a serine proteinase from Bothrops jararaca venom, which, like thrombin, causes platelet aggregation mediated by the receptors PAR-1 and PAR-4. For this purpose, approaches of mass spectrometry and bioinformatics were used to characterize changes in the proteome of non-activated and activated platelets, and also to analyze proteins and peptides present in the supernatant of aggregated platelets (secretome). In the analysis of the sediment of platelets activated by PA-BJ and thrombin, various proteins, such as PBP, PF4, protein S, fibronectin, factor V, and alpha-1 antitrypsin, were detected in lower abundance while they were also identified as secreted, in the supernatant; likewise, proteins that are directly involved in the activation/aggregation, such as ADAM-10, thromboxane A2 synthase, integrin αIIb, myosin-9 and phosphorylase b were identified in higher abundance in platelets activated by PA-BJ and thrombin. Moreover, we found that in the thrombin-induced platelet secretion there was increased abundance of proteins involved in the regulation of blood clot formation, such as protein S, and antithrombin III PAI1, suggesting that in the events triggered by thrombin, there is strict regulation of its action at the site of vascular injury. In the analysis of the secretion induced by PA-BJ, we found a significant increase in amyloid beta A4 protein and fibrinogen, which are involved in the platelet activation/aggregation, in addition to the release and activation of MMP-1, indicating that this metalloproteinase acts synergistically with PA-BJ in the formation and stabilization of the platelet thrombus. In the analysis of the non-activated platelet secretome, we identified for the first time the presence of catalase, carbonic anhydrase, leukocyte elastase inhibitor and histidine-rich glycoprotein, which are involved in the inhibition and regulation of platelet activation. The analysis of the peptide fraction of the supernatant of activated platelets enabled the characterization, for the first time, of the degradome generated in the process of aggregation by thrombin and PA-BJ. The resulting set of peptides generated upon platelet activation by PA-BJ is larger and more complex than that generated by the action of thrombin, suggesting that the pathways activated by both are differential and are subject to different controls of proteolysis. Furthermore, the selective degradation of some proteins, and the set of generated peptides could play a role in the control of platelet activation and aggregation. Taken together, our findings demonstrate that although both PA-BJ and thrombin induce platelet aggregation via PAR-1 and PAR-4, these enzymes activate different pathways to cause platelet secretion and aggregation.

Neste estudo foram avaliados os efeitos das serinoproteinases PA-BJ e giroxina, isoladas dos venenos das serpentes Bothrops jararaca e Crotalus durissus terríficus, respectivamente, sobre células endoteliais (CEs) em cultura. Os resultados obtidos demonstraram que essas toxinas, nas concentrações utilizadas, não afetaram a viabilidade e a integridade das CEs. Por outro lado, induziram a liberação de PGI2, que foi significativamente reduzida por inibidores não seletivos e seletivos das ciclooxigenases -1 e -2 (COX-1 e -2), mas não afetaram a expressão protéica constitutiva das mesmas. Adicionalmente, foi demonstrado que o antagonista de receptores PAR-1, o SCH 79797, não alterou a liberação de PGI2, induzida pelas toxinas. Em conclusão, essas toxinas, em concentrações não citotóxicas, induziram a liberação de PGI2 a partir de CEs, de modo dependente da ativação das COX-1 e -2. Por outro lado, o receptor PAR-1 não parece ser importante para este efeito, nessas células. / In this study, the effects of PA-BJ and gyroxin, isolated from Bothrops jararaca and Crotalus durissus terrificus snake venoms, respectively, on endothelial cells in culture were investigated. Results showed that neither PA-BJ nor gyroxin affected the integrity of monolayers nor modified ECs viability in the periods of incubation tested. In contrast, these serine proteinases increased the release of prostacyclin from ECs. This effect was inhibited by both non-selective and selective COX-1 and COX-2 inhibitors, but these toxins did not affect the protein expression of COX-1 and -2. Inhibition of the catalytic activity of PA-BJ and gyroxin or pre-incubation of ECs with PAR-1 antagonist did not abrogate the ability of these toxins to induce PGI2 release. These findings demonstrate that these serine proteinases are able to stimulate production of prostacyclin by ECs by a mechanism dependent on stimulation of COX-1 and COX-2 enzyme activity. Moreover, neither enzyme activity of both serine proteinases nor the receptor PAR-1 contribute for this effect on endothelium.