Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000442629-Texto+Completo-0.pdf: 4545565 bytes, checksum: 75785599771804ca3f6535bc606e1454 (MD5) Previous issue date: 2012 / The clinical depression treatment faces serious obstacles as the disease mechanism is not fully elucidated. In addition, there are no effective means to predict and prevent depression as well as any biological method of diagnosis. The use of antidepressants is still the basis of the treatments for depression. Lithium has been used clinically as effective drug to treat all phases of bipolar disorder, including major depression. The Selective serotonin re-uptake inhibitors (SSRIs), such as fluoxetine and citalopram, and Tricyclic antidepressant (TCA) as clomipramine are drugs constantly used for depression treatment. Recent evidence has shown an involvement of adenosine and its receptors in the pathophysiology of depression. ATP can be stored and co-released with other neurotransmitters like serotonin and can be hydrolyzed by a cell-surface enzyme family known as ectonucleotidases. Among these members, we highlight the nucleoside triphosphate diphosphohtdrolases (NTPDases) and ecto-5'-nucleotidase. They are able to control the availability of ligands such as ATP and adenosine to its specific receptors. Adenosine deaminase (ADA) can promote the hydrolytic deamination of adenosine to inosine, modulating the extracellulr levels of this neuromodulator. In cholinergic signaling, after its release, acetylcholine (ACh) promotes the activation of specific muscarinic or nicotinic receptors and thus, it promotes diverse cellular responses. ACh is hydrolyzed by acetylcholinesterase (AChE) in acetate and choline in synaptic cleft. The zebrafish has been used in research behavioral neuroscience and is also a choice model for elucidating the development and function of neuronal circuitry. Considering the cholinergic and purinergic signaling are important participation in the CNS and these neurotransmitter pathways have been identified and characterized in zebrafish, the objective of this study was to evaluate the effect of antidepressants on ectonucleotidases, ADA and ACh activities, which are essential enzymes in the modulation of these signaling pathways in the zebrafish brain. We evaluated the ex vivo effects of fluoxetine (1-10 μM), clomipramine (1-10 μM), citalopram (70-300 μM) on ectonucleotidases and ADA activities. It has been also analyzed the in vitro (1 to 1000 μM) and ex vivo (1 to 10mg/L) effect of lithium on ectonucleotidases and AChE activities and gene expression. There was a significant inhibition of ADP hydrolysis after ex vivo exposure to lithium at 5 and 10 mg/L, whereas an inhibitory effect was observed for AMP hydrolysis only at 10 mg/L. The same treatment decreased the AChE activity in a concentration of 10mg/L. Lithium did not induce significant changes in the analysis of gene expression patterns in the concentrations tested. In vivo treatment, there were no significant changes inectonucleotidases and AChE activities. Treatment with clomipramine promotes an inhibition ecto-5'-nucleotidase activities at the concentration of 5μM when compared to the control group. For ADA activity, we also observed a significant inhibition in the treatment with clomipramine at concentrations of 5 and 10 μM in membrane fractions of zebrafish brain. However, treatment with fluoxetine and citalopram did not alter ectonucleotidases and ADA activities in the zebrafish brain. Our findings may contribute to a better understanding of pharmacology of antidepressants and their interaction with the cholinergic and purinergic neurotransmission. / O tratamento clínico da depressão enfrenta sérios obstáculos já que o mecanismo da doença não é totalmente elucidado. Além disso, não existem meios eficazes para prever e prevenir a depressão bem como nenhum método biológico de diagnóstico. O uso de fármacos antidepressivos ainda é a base dos tratamentos para depressão. O lítio tem sido usado clinicamente como fármaco eficaz para tratar todas as fases do transtorno bipolar, incluindo depressão aguda. Os inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRSs), como fluoxetina e citalopram, e os antidepressivos tricíclicos (TCA), como a clomipramina, são fármacos constantemente utilizados para o tratamento da depressão. Evidências recentes mostram o envolvimento da adenosina e seus receptores na patofisiologia da depressão. O ATP pode ser armazenado e co-liberado, juntamente com outros neurotransmissores, como serotonina e noradrenalina, e pode ser hidrolisado até adenosina por uma família de enzimas de superfície celular, conhecidas como ectonucleotidases. Dentre elas, destacam-se as Nucleosídeo Trifosfato Difosfoidrolases (NTPDases) e a ecto-5´-nucleotidase, capazes de controlar a disponibilidade de ligantes como ATP e adenosina aos seus receptores específicos. A Adenosina desaminase (ADA) pode promover a desaminação hidrolítica da adenosina em inosina, modulando os níveis extracelulares deste neuromodulador. Na sinalização colinérgica, a acetilcolina (ACh), após liberada, promove a ativação de receptores muscarínicos ou nicotínicos, e desta maneira a ACh promove diversas respostas celulares. A ACh que permanece na fenda sináptica é hidrolisada pela acetilcolinesterase (AChE) em acetato e colina. O peixe-zebra tem sido utilizado na pesquisa da neurociência comportamental, sendo também um modelo de escolha para elucidar o desenvolvimento e a função do circuito neuronal. Considerando que as sinalizações purinérgica e colinérgica têm importante participação no sistema nervoso central e que essas vias de neurotransmissão já estão caracterizadas em peixe-zebra, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de fármacos antidepressivos na atividade das ectonucleotidases, ADA e AChE, enzimas essenciais na modulação destas vias de sinalização em cérebro de peixe-zebra. Foram avaliados os efeitos ex vivo da fluoxetina (1-10 μM), clomipramina (1-10 μM) e citalopram (70-300 μM) na atividade das ectonucleotidases e ADA. Foi analisado também o efeito in vitro (1 a 1000 μM) e ex vivo (1-10mg/L) do lítio sobre a atividade e expressão gênica das ectonucleotidases e AChE. A exposição ao lítio inibiu a hidrólise de ADP nas concentrações de 5 e 10mg/L e inibiu a hidrólise de AMP na concentração de 10mg/L quando comparado ao grupo controle. Este mesmo tratamento diminuiu a atividade da AChE na concentração de 10mg/L. O lítio não induziu alterações significativas na análise do padrão de expressão gênica. No tratamento in vitro, não foram observadas alterações na atividade das ectonucleotidases e AChE. O tratamento com a clomipramina mostrou uma inibição na atividade da ecto-5´-nucleotidase na concentração de 5 μM quando comparado ao grupo controle. Na atividade da ADA também observamos uma inibição significativa no tratamento com a clomipramina nas concentrações de 5 e 10 μM em frações de membrana de cérebro de peixe-zebra. Entretanto, o tratamento com fluoxetina e citalopram não alterou a atividade das ectonucleotidases e ADA no cérebro do peixe-zebra. Nossos resultados podem contribuir para uma melhor compreensão da farmacologia dos fármacos antidepressivos e a sua interação com a neurotransmissão colinérgica e purinérgica.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000435930-Texto+Completo-0.pdf: 928390 bytes, checksum: 7d9c63e8c3ebdc0a8df50f72dcdee9ab (MD5) Previous issue date: 2011 / Nanocomposites derived from carbon atoms have been the focus of interest in various industrial fields such as electronic engineering, pharmaceuticals, medical devices, cosmetics, food packaging and other, since its discovery in 1985. Fullerene C60 is a nanocomposite with 60 carbon atoms, which has been the subject of numerous studies for its ability to store atoms in the interior and accept various structural modifications. The importance of understanding all the possible effects of exposure to fullerenes is very great, since its production and its use is growing every day increasing environmental exposure to this compound. The cholinergic system has as its main neurotransmitter acetylcholine (ACh). The acetylcholinesterase (AChE, EC3. 1. 1. 7) is an important regulatory enzyme that controls the transmission of nerve impulses across cholinergic synapses by hydrolysis of the ACh. AChE levels are controlled by the interaction of ACh with its receptors, and when the interaction is enhanced, the levels of AChE are increased. Therefore, AChE can be used as a marker of cholinergic function. In this study our goal was to determine whether intraperitoneal injections of fullerene C60 at the doses of 7. 5, 15 and 30 mg/kg and the time of 6h, 12h and 24h of exposure would cause a change in the modulation of the cholinergic system. We observed that the dose of 30 mg/kg in the exposure time of 24 hours showed a 84% increase in enzyme activity compared with the vehicle control group. These results suggest a possible neurotoxic effect. Further studies should be conducted to extend these findings. / Nanocompostos derivados de átomos de carbono têm sido foco de interesse para aplicações em vários campos industriais, tais como engenharia eletrônica, produtos farmacêuticos, dispositivos médicos, cosméticos, embalagens de alimentos, entre outros, desde seu descobrimento em 1985. O fulereno C60 é um nanocomposto com 60 átomos de carbono que tem sido alvo de inúmeros estudos por suas propriedades como a capacidade de armazenar átomos em seu interior e aceitar diversas modificações estruturais. A importância de entendermos todos os possíveis efeitos de uma exposição aos fulerenos é muito grande, já que a sua produção e sua utilização estão crescendo a cada dia aumentando a exposição do meio ambiente a este composto. O sistema colinérgico tem como principal neurotransmissor a acetilcolina (ACh). A acetilcolinesterase (AChE, E. C. 3. 1. 1. 7) é uma importante enzima regulatória que controla a transmissão de impulsos nervosos através da sinapse colinérgica pela hidrólise da ACh. Os níveis de AChE são controlados pela interação da ACh com seus receptores, sendo que quando a interação é acentuada, aumentam os níveis de AChE Portanto, a AChE pode ser usada como um marcador da função colinérgica. Neste estudo nosso objetivo foi verificar se injeções intraperitoneais de fulereno C60 nas doses de 7,5; 15 e 30 mg/kg e nos tempos de 6h, 12h e 24h de exposição causaria alguma alteração na modulação do sistema colinérgico. Observamos que a dose de 30 mg/kg, no tempo de exposição de 24h, apresentou um aumento de 84% na atividade enzimática quando comparado com o grupo controle-veículo. Estes resultados sugerem um possível efeito neurotóxico, embora estudos adicionais devam ser realizados para estender estes achados.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000437833-Texto+Completo-0.pdf: 963349 bytes, checksum: 9fc7ce9b6fb62b2118fc694c4bf21677 (MD5) Previous issue date: 2012 / Hyperargininemia is a rare disease caused by an innate error of the metabolism (EIM) biochemically characterized by the accumulation of arginine in body tissues due to arginase deficits. Mental retardation and other neurological symptoms are common in hyperargininemic patients. Several mechanisms have been proposed to describe the neurotoxicity of hiperargininemia, such as changes in antioxidant enzyme systems and neurotransmission. The purinergic system is an important pathway for which uses extracellular nucleotides and nucleosides as signaling molecules. The extracellular ATP degradation and the consequent adenosine production are performed by a cellular surface enzyme family known as ectonucleotidases, which include the NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphoohydrolases) and the ecto-5´-nucleotidase. Adenosine is a neuromodulator that acts through the activation of P1 metabotropic receptors (A1, A2A, A2B, A3) and plays a role as an endogenous neuroprotector. Thus, the NTPDase and ecto-51-nucleotidase control the levels of nucleotides and nucleosides, modulating the purinergic system. Whereas the zebrafish is an important tool for the study of developmental biology and the hiperargininemia is a disease that occurs in the early stages of development, the objective of this study was to evaluate the effects of arginine exposure in zebrafish larvae on different biochemical, behavioral, and molecular parameters. The results showed that exposure to arginine at a concentration of 0. 1 mM in larvae of the zebrafish from to 7 days post-fertilization (dpf) was capable of changing ectonucleotidase activities, promoting an increase of ATP, ADP, and AMP hydrolysis and as causing morphological changes, such as larvae body size reduction, but did not alter the locomotor activity of animals. Acute arginine exposure (1h) in adult zebrafish was not able to alter the activity of ectonucleotidases. These data demonstrate that arginine can affect the ectonucleotidase activities and morphological parameters in zebrafish larvae, suggesting that the purinergic system is a target for neurotoxic effects induced by arginine in the early stages of developmental. / Hiperargininemia é uma doença rara causada por um erro inato do metabolismo (EIM) bioquimicamente caracterizado pelo acúmulo de arginina nos tecidos devido à deficiência de arginase. Retardo mental e outras doenças neurológicas são sintomas comuns em pacientes hiperargininêmicos. Diversos mecanismos foram propostos para descrever a neurotoxicidade da hiperargininemia, tais como, alterações nos sistemas enzimáticos antioxidantes e de neurotransmissão. O sistema purinérgico é uma importante rota de sinalização celular que utiliza nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares como moléculas sinalizadoras. A degradação do ATP extracelular é realizada por uma família de enzimas localizadas na superfície celular conhecidas como ectonucleotidases, que inclui as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5´-nucleotidase. A adenosina é um neuromodulador que atua através da ativação de receptores metabotrópicos do tipo P1 (A1, A2A, A2B, A3) e pode agir como um neuroprotetor endógeno. As NTPDases hidrolisam nucleotídeos tri- e difosfatados originando a adenosina. Assim, as NTPDases e ecto-5’-nucleotidase controlam os níveis de nucleotídeos e nucleosídeos, modulando o sistema purinérgico. Considerando que o peixe-zebra é uma importante ferramenta para o estudo da Biologia do Desenvolvimento e que a hiperargininemia é uma doença que ocorre nas fases iniciais do desenvolvimento, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com arginina em larvas de peixezebra em diferentes parâmetros bioquímicos, comportamentais e moleculares. Foram avaliados os efeitos da exposição in vivo de larvas e adultos de peixe-zebra na atividade das ectonucleotidases e na locomoção. Os resultados obtidos demonstraram que a exposição à arginina na concentração de 0. 1 mM em larvas de peixe-zebra do 3º ao 7º dia pós-fertilização (dpf) foi capaz de alterar a atividade das ectonucleotidases, promovendo um aumento na hidrólise de ATP, ADP e AMP, assim como causar alterações moleculares e morfológicas, como diminuição do tamanho corporal, porém não alterou a atividade locomotora dos animais. A exposição aguda (1h) a arginina em peixes zebra adultos não foi capaz de alterar a atividade das ectonucleotidases. Esses dados demonstram que a arginina pode afetar a atividade das ectonucleotidases e parâmetros morfológicos em larvas de peixe-zebra, sugerindo que o sistema purinérgico é um alvo para os efeitos neurotóxicos induzidos pela arginina, nas fases iniciais do desenvolvimento.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000440822-Texto+Completo-0.pdf: 1496271 bytes, checksum: ed1a67fe6439eb139b2edd2275228d18 (MD5) Previous issue date: 2012 / Cadmium is considered the seventh most dangerous substance in the environment and is classified as carcinogen type I, potentially affecting a wide range of living organisms, including humans. In addition to its wide systemic impact and potential lethality, cadmium has been associated to neurobehavioral defects that may also compromise animals’ ecological status and survival. Despite its potential impact, the comprehension of cellular and molecular mechanisms underlying cadmium deleterious effects on animals’ behavior is still scarce. This study aimed to evaluate the behavioral effects of cadmium for 1 or 7 days at environmentally relevant concentrations (10 μg/L, 100 μg/L and 1000 μg/L) on zebrafish and to analyze brain oxidative stress and apoptotic markers. Cadmium-exposed zebrafish exhibited a generalized increase in locomotor activity after 1 and 7 days of treatment at all doses in all parameters evaluated, including distance travelled in a 5-min. evaluation period, mean speed and mobile periods. This hyperlocomotory effect significantly compromised animals’ general performance in exploring a new environment, which was evident in all cadmium exposed animals decreased path efficiency and altered distribution on the water column. Additionally, our results confirmed previous reports of increased oxidative damage in fishes exposed to cadmium and specifically demonstrated higher levels of damaged proteins in brain samples of animals exposed to cadmium at 100 μg/L for 1 day and at 10 μg/L for 7 days when compared to their respective control groups. Lipid peroxidation was also significantly increased in animals’ brain after 1 day cadmium exposure at 100 μg/L. Real-Time PCR analysis of transcripts for p53 and bax were not altered after 1 day cadmium exposure, but significantly increased after 7 days. Our results present evidence of cadmium deleterious effects on zebrafish cognitive functions and raise attention to the fact that its manifestation appears already after a one day exposure to 10 μg/L, a concentration accepted by most international regulating agencies. / O cádmio é considerado a sétima substância mais perigosa presente no ambiente e é classificado como carcinogênico tipo I, potencialmente afetando uma grande quantidade de seres vivos, incluindo os humanos. Ademais, o cádmio tem sido associado a defeitos neurocomportamentais que podem comprometer o status ecológico e a sobrevivência de animais. Apesar do potencial impacto, a compreensão dos mecanismos celulares e moleculares por trás de seus efeitos deletérios no comportamento de animais é ainda escassa. Este estudo teve por objetivo avaliar os efeitos comportamentais do cádmio por 1 e 7 dias a concentrações relevantes no ambiente (10 μg/L, 100 μg/L and 1000 μg/L) em zebrafish e analisar o estresse oxidativo e marcadores de apoptose no encéfalo. Animais expostos ao cádmio apresentaram aumento na atividade locomotora após 1 e 7 dias de tratamento em todas as concentrações e parâmetros avaliados, incluindo distância percorrida num período de 5 minutos, velocidade média e períodos móveis. A hiperlocomoção afetou significativamente o desempenho dos animais em explorar um novo ambiente em todos os grupos tratados, evidenciado por uma diminuição na eficiência de percurso e alterada distribuição na coluna d’água. Adicionalmente, nossos resultados confirmaram estudos prévios sobre aumento no dano oxidativo em peixes quando expostos ao cádmio e especialmente demonstraram níveis mais elevados de dano a proteínas em amostras de encéfalo em animais tratados a 100 μg/L por 1 dia e a 10 μg/L por 7 dias quando comparados aos seus respectivos controles. Lipoperoxidação aumentou significativamente no encéfalo de animais expostos por 1 dia a 100 μg/L. Análises dos marcadores p53 e bax por Real-time PCR apresentaram nenhuma alteração após 1 dia de exposição, mas significativamente aumentaram após 7 dias. Nossos resultados apresentam evidências dos efeitos deletérios do cádmio no comportamento de zebrafish e chama atenção para o fato de que a manifestação de seus efeitos aparece a partir de 1 dia de exposição a 10 μg/L, uma concentração aceita por muitas agências de regulamentação internacional.

Made available in DSpace on 2015-05-22T12:36:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000469018-Texto+Completo-0.pdf: 1309740 bytes, checksum: 2aed89fbf06476e1b1522282c9325099 (MD5) Previous issue date: 2015 / The ethanol exposure during early embryonic development can cause morphological and behavioral changes even when ingested in low doses. Growth retardation, microcephaly and mental retardation are some of the features observed in children with FAS (fetal alcohol syndrome) whose mothers ingested ethanol during pregnancy. The mechanisms by which ethanol affects embryonic development and cause such changes have not been fully elucidated. The increase in the extracellular adenosine levels after chronic and acute exposure to ethanol indicates that the purinergic system has an important role in this situation. Adenosine is a neuromodulator that acts through the activation of metabotropic receptors type P1 (A1, A2A, A2B and A3) and can act as an endogenous neuroprotector. In the extracellular space, adenosine can be produced by sequential hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP) held by ectonucleotidases, a cascade of a family of enzymes located on the cell surface, which the key process to hydrolyze to adenosine is performed by ecto-5'-nucleotidase. The use of zebrafish in toxicology studies and development offers a number of advantages. Its size and breeding allow the maintenance of a large quantity of fish in a relatively small space. The production of a large number of eggs and the development occurs rapidly, and progresses through well-defined steps. Recent studies have employed the zebrafish as a model for fetal alcohol syndrome and demonstrated that embryonic exposure to ethanol results in phenotypes comparable to those observed in other vertebrate models. The objective of this study was to evaluate the role of adenosine metabolism in the morphological and locomotor parameters of zebrafish larvae exposed to ethanol. The results showed that in addition to morphological damage already known, there is a change in the enzymatic activity of ecto-5'-nucleotidase in larvae of seven days, in both treatments, acute and chronic, independent of gene expression form, which in time was not changed. Pre-treatment with AOPCP, an inhibitor of ecto-5'- nucleotidase, was unable to prevent the morphological damage in a relevant way, although statistically there was a slight prevention. Pre-treatment with dipyridamole, an adenosine transport blocker further worsened the effects caused by ethanol. Considering the changes that occur in extracellular levels of adenosine after exposure to ethanol and the involvement of the purinergic system in early stages of development, our results suggest that there is a combined action of the enzyme ecto-5'-nucleotidase and nucleoside transporters in this rising of extracellular adenosine levels, with emphasis on the inhibition of nucleoside transporters. Additionally, we can infer that there is a correlation between elevated levels of adenosine and morphological defects after exposure to ethanol. These results suggest that the purinergic system is a target for the toxic effects induced by ethanol in the early stages of development. / A exposição ao etanol durante as fases iniciais de desenvolvimento embrionário pode causar alterações morfológicas e comportamentais, mesmo quando ingerido em baixas doses. Retardo no crescimento, microcefalia e retardo mental são algumas das características observadas em crianças portadoras da SAF (síndrome alcoólica fetal), cujas mães ingeriram etanol durante a gestação. Os mecanismos pelos quais o etanol afeta o desenvolvimento embrionário e causa tais alterações ainda não foram completamente desvendados. O aumento extracelular da adenosina após exposições crônicas e agudas ao etanol indica que o sistema purinérgico tem um importante papel nesses mecanismos. A adenosina é um neuromodulador que atua através da ativação de receptores metabotrópicos do tipo P1 (A1, A2A, A2B e A3) e pode agir como um neuroprotetor endógeno. No espaço extracelular, a adenosina pode ser produzida pela hidrólise sequencial da adenosina trifosfato (ATP) realizada pela cascata das ectonucleotidases, uma família de enzimas localizada na superfície celular, sendo o processo chave – hidrólise da adenosina monofosfato (AMP) à adenosina – realizada pela ecto-5’- nucleotidase. A utilização do peixe-zebra em estudos toxicológicos e de desenvolvimento oferece uma série de vantagens. Seu tamanho e a forma de criação permitem a manutenção de uma grande quantidade de peixes em um espaço relativamente pequeno. O cruzamento resulta em um grande número de ovos e o desenvolvimento ocorre rapidamente, e progride através de etapas bem definidas. Estudos recentes têm empregado o peixe-zebra como modelo para a síndrome alcoólica fetal e demonstrado que a exposição embrionária ao etanol resulta em fenótipos comparáveis com aqueles observados em outros modelos vertebrados. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel do metabolismo da adenosina nos parâmetros morfológicos e locomotores de larvas de peixe-zebra expostas ao etanol. Os resultados obtidos demonstraram que além dos danos morfológicos já conhecidos, há alteração na atividade enzimática da ecto- 5’-nucleotidase em larvas de 7 dias, em ambos os tratamentos, agudo e crônico, de uma forma independente da expressão gênica, que por sua vez, não foi alterada. O tratamento prévio com AOPCP, um inibidor da ecto-5’-nucleotidase, não foi capaz de prevenir os danos morfológicos de forma relevante, embora estatisticamente verificou-se uma leve prevenção. O pré-tratamento com dipiridamol, um bloqueador do transporte de adenosina, piorou ainda mais os efeitos causados pelo etanol. Considerando as mudanças que ocorrem nos níveis extracelulares de adenosina após exposições ao etanol e o envolvimento do sistema purinérgico em estágios iniciais do desenvolvimento, nossos resultados sugerem que existe uma ação combinada da enzima ecto-5’-nucleotidase e dos transportadores de nucleosídeos nesta elevação dos níveis extarcelulares de adenosina, com ênfase na inibição dos transportadores de nucleosídeos. Adicionalmente, podemos inferir que há uma correlação entre a elevação dos níveis de adenosina e os defeitos morfológicos característicos da exposição ao etanol. Tais resultados sugerem que o sistema purinérgico é um alvo para os efeitos tóxicos induzidos pelo etanol nas fases iniciais do desenvolvimento.

Made available in DSpace on 2015-05-22T12:36:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000468720-Texto+Completo-0.pdf: 6747791 bytes, checksum: dc8f03c538738774e24f74700ad72365 (MD5) Previous issue date: 2015 / New animal models for neurodegenerative diseases study are necessary for the knowledge of molecular mechanisms and behavioral patterns involved on the progression of dementias as Alzheimer’s Disease (AD) as well as for new therapies development. We characterized four neurodegenerative approaches including: (1) ß-amyloid(1-42) peptide injection, one of the hallmark proteins of patients with AD. In this model, we observed that intra-ventricular brain injection of ß-amyloid soluble oligomers in 24hpf embryos caused an increase in tau phosphorylation followed by cognitive deficits at 5dpf, both results being reversed by Lithium treatment, a tau kinase (GSK-3ß) inhibitor. (2) The inhibition of exon 8 splicing of Presenilin-1, protein responsible for the Amyloid Precursor Protein (APP) cleavage, was achieved using Morpholino oligonucleotides. This approach caused a dysfunction of Presenilin-1, characteristic of patients with the familiar form of AD, that disturbed cognitive behavior and caused morphological phenotype similar to the ones observed by modifications of Notch pathway. We also developed two transgenic animals, (3) one overexpressing through a heat-shock promoter the ß-amyloid protein. These animals when exposed to a temperature of 37ºC activate the heat-shock protein expression and as a consequence amyloid-ß protein, one of the hallmark proteins of AD. The second transgenic animal (4) we knocked-out the Appb gene using TALEN as a genetic manipulation technic. This model will provide a better understanding of Appb function during animal development and AD progression. Those four animal models include features suggesting that, when used separately or in combination, can hereafter elucidate those pathways interactions and clarify the cellular and molecular mechanism associated with cognitive deficits during Alzheimer’s disease progression. With these models we were able to characterize zebrafish as a potential animal model, not just for understanding the role of those proteins over neurodegenerative process, but also on their normal functions in the system. Besides that, zebrafish have been used for a few years in pharmacological tests, and the development of animal models for Alzheimer’s disease as ours, make this animal a robust model for development of new treatments for this and other diseases. / Novos modelos para o estudo de doenças neurodegenerativas são necessários para a caracterização dos mecanismos moleculares e comportamentais envolvidos na progressão de demências como a Doença de Alzheimer (DA), além de serem importantes para a identificação de novos alvos com potencial terapêutico. Aqui caracterizamos quatro abordagens neurodegenerativas incluindo: (1) A injeção do peptídeo ß-amilóide(1-42), uma dos principais peptídeos alterados em pacientes com DA. Neste modelo observamos que a injeção de oligômeros solúveis de ß-amilóide no ventrículo cerebral de embriões de 24hpf causou um aumento na fosforilação da proteína tau em resíduos de estágios iniciais da DA acompanhados por déficit cognitivo aos 5dpf, ambos revertidos pelo tratamento com Lítio, inibidor da enzima GSK-3ß que fosforila tau. (2) Realizamos também a inibição do splicing do éxon 8 da proteína Presenilina-1, membro do complexo gama-secretase que é responsável pela clivagem da Proteína Precursora do Amilóide (APP), através do bloqueio com oligonucleotídeos Morfolinos. Esta abordagem causou uma alteração na funcionalidade da Presenilina-1, característica de pacientes com a forma familiar da DA, comprometendo a cognição dos animais e ocasionando alterações morfológicas similares às causadas pela modificação da via Notch. Também realizamos a produção de dois animais transgênicos, o primeiro (3), superexpressando a proteína ß-amilóide através de um promotor heat-shock. Estes animais quando expostos a uma temperatura de 37ºC ativam a expressão das proteínas heat-shock e por consequência a expressão da proteína ß-amilóide, que como dito anteriormente é uma das principais alterações em pacientes com a DA.O segundo (4), inibindo a expressão da APP através da técnica de manipulação genética utilizando TALEN. Este ultimo modelo irá fornecer informações importantes sobre a participação desta proteína durante desenvolvimento e a progressão da DA. Estes quatro modelos abrangem características que sugerem que, quando usados separadamente ou em combinação, poderão contribuir tanto na elucidação de mecanismos celulares e moleculares associados a déficits cognitivos quanto nas interações destas vias com a DA. A possibilidade de desenvolver modelos complementares com abordagens diversas em um mesmo organismo confirma o potencial do zebrafish não só para o entendimento da participação destas proteínas no processo neurodegenerativo mas também em suas funções normais no sistema nervoso.

Made available in DSpace on 2013-10-29T16:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451666-Texto+Completo-0.pdf: 1289575 bytes, checksum: 022edd4e2e930676c57fc69c0dc3e849 (MD5) Previous issue date: 2013 / Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs) are of great interest in nanomedicine due to their capability to act simultaneously as a contrast agent in magnetic resonance imaging and as a targeted drug delivery system with good biocompatibility. At present, one of the biggest concerns about the use of SPIONs remains around its toxicity. For this reason, it is important to establish the safe upper limit for each use. In the present study, SPION coated with cross-linked and aminated dextran (CLIO-NH2) were synthesized by the co-precipitation method and characterized by transmission electron microscopy (TEM) and light scattering dynamics. The analysis of the elementary composition of the solution at the end of the synthesis was also performed. The magnetite core size was 5. 5 ± 1. 4 nm, on a concentration of 10 mg Fe-NPs/ml. We have evaluated the effects of different CLIO-NH2 doses (20, 50, 100, 140 and 200 mg/kg) as a function of time after exposure (one, 16, 24 and 48 hours) on AChE activity and ache expression in zebrafish brain. At tested concentrations, only the animals exposed to 200 mg/kg, and assessed 24 h after administration of the nanoparticles, have shown decreased AChE activity. These values returned to control levels after 48 h of exposition, indicating a transitory toxical effect. The RT-qPCR results suggested that inhibition of brain AChE is not directly related with the transcriptional control, and it was probably due to post-transcriptional events. Once ACh is recognized to play an important role in the regulation of locomotor control, we further evaluated parameters of zebrafish swimming activity. CLIO-NH2 at 200mg/kg, evaluated after 24 h, also impaired all the tested parameters of zebrafish swimming activity, i. e. decreased traveled distance, mean speed, number of line crossings, and turn angle. We further investigated the iron accumulation in zebrafish brain by ICP-MS, and a significant higher level of ferric iron was found in zebrafish brains exposed to CLIO-NH2. In summary, the results presented herein provide further experimental evidence that exposure to high doses of dextran-coated iron oxide nanoparticles can be transiently neurotoxic. / Nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIONs) são de grande interesse na nanomedicina, devido à sua capacidade para agir, simultaneamente, como um agente de contraste em imagem por ressonância magnética e como um sistema de entrega de fármacos específicos, possuindo boa biocompatibilidade. Atualmente, uma das maiores preocupações com a utilização de SPIONs permanece em torno da sua toxicidade e, por esta razão, é importante estabelecer um limite de segurança para sua utilização. Neste estudo, SPIONs revestidas com dextran-aminado (CLIO-NH2) foram sintetizados pelo método de co-precipitação e caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e dinâmica de espalhamento de luz. A análise da composição elementar da solução no final da síntese foi também realizada. O tamanho do núcleo de magnetite foi de 5,5 ± 1,4 nm, com uma concentração de 10 mg Fe-NPs/ml. Foram avaliados o efeito de diferentes doses de CLIO-NH2 (20, 50, 100, 140 e 200 mg/kg), após a exposição de CLIO-NH2 (em uma, 16, 24 e 48 h), sobre a atividade de AChE e sobre a expressão de ache em cérebro de peixe-zebra. Nas concentrações testadas, apenas os animais expostos a 200 mg/kg, testados 24 h após a administração das nanopartículas, demonstraram diminuição da atividade da AChE. Quarenta e oito horas após exposição a CLIO-NH2 os valores voltaram aos níveis controle, indicando um efeito tóxico transitório. Os resultados de RT-qPCR sugerem que a inibição da AChE no cérebro não está diretamente relacionada com o controle da transcrição e que esta relacionada com a modulação de eventos pós-transcricionais. Uma vez que a ACh é reconhecida por desempenhar um papel importante na regulação do controle locomotor, foram avaliados parâmetros da atividade da natação do peixe-zebra. CLIO-NH2, à 200 mg/kg, após 24 h de tratamento, também prejudicou todos os parâmetros testados de comportamento de nado, ocorrendo diminuição da distância percorrida, velocidade, número de cruzamentos de linha e ângulo de virada. Ainda foi analisado o acúmulo de ferro no cérebro de peixe-zebra, por ICP-MS, onde um nível significativamente maior de ferro férrico foi encontrado nos cérebros de peixe-zebra expostos a CLIO-NH2 nas mesmas condições experimentais (200 mg/kg e 24 h de exposição). Concluindo, os resultados apresentados fornecem evidências de que doses elevadas de nanopartículas de óxido de ferro, revestidas com dextran-aminado, podem produzir neurotoxicidade transitória, coincidente com níveis cerebrais elevados de ferro, bem como as alterações comportamentais.

Made available in DSpace on 2014-07-11T02:02:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000459166-Texto+Completo-0.pdf: 2547388 bytes, checksum: 27814fb2b5f7b670424cdc2d80523d6f (MD5) Previous issue date: 2014 / Disturbances in glutamatergic signaling have been proposed as the cause of many diseases of the nervous system. The zebrafish has been considered as an efficient model in the investigation of the neurochemical basis of various disorders, such as schizophrenia and epilepsy. Several neurotransmitter systems have been characterized in zebrafish, including the glutamatergic system. Moreover, a vast repertoire of behavioral responses to drugs has been characterized in particular in adults. However, little information is available about the ability to generate response to classic drugs of glutamatergic action in the early stages of development in zebrafish.Throughout development, ionotropic glutamate receptors have an orderly variability between the subunits that compose them, giving them different pharmacokinetic properties and degree of affinity for their ligands. In this way, we analyzed the locomotor/behavioral profile of zebrafish in response to the glutamate receptor antagonist, MK-801, in different doses in 30, 60, 120 days post-fertilization (dpf) and 2 years post-fertilization animals, as well the effect of caffeine pre-exposure on MK-801 action. Additionally, we analyzed the expression profile of subunits that comprise the NMDA receptor in whole brain of zebrafish during development. Locomotor/behavioral response to kainic acid (KA) was evaluated in different doses at ages 7, 15 and 30 dpf.Also, the pre-exposure to kainic acid in 24 hours post-fertilization (hpf) and 7 and 15 dpf animals was challenged by a second exposure to kainic acid at 2 months post-fertilization The results demonstrated that zebrafish has an age-dependent response to MK-801 and kainic acid, at least on the locomotor/behavior aspects. The peak of locomotor response to MK-801 occurred at 60-120 days post-fertilization, which was partially prevented by caffeine and able to alter the time on upper zone of aquarium as a measure of anxiety. Analysis of gene expression of NMDA receptor subunits in zebrafish brain demonstrated that NR2C and NR2D subunits have later expression in comparison to subunits NR1, NR2A and NR2B. The animals that were exposed to KA showed alterations in locomotor activity without displaying classic convulsive characteristics. However, pre- exposure to 7dpf KA was able to partially prevent the seizure events in response to KA injection (6 mg / K) at 2 months post- fertilization. / Distúrbios na sinalização glutamatérgica são propostos como a causa de inúmeras patologias do sistema nervoso. O peixe-zebra tem sido considerado um eficiente modelo na investigação das bases neuroquímicas de diversos transtornos, tais como a esquizofrenia e a epilepsia. Diversos sistemas de neurotransmissão já foram caracterizados em peixe-zebra, incluindo o sistema glutamatérgico. Além disto, um vasto repertório de respostas comportamentais a fármacos já foram caracterizados em especial em indivíduos adultos. Entretanto, pouca informação é disponível a cerca da capacidade de gerar resposta a clássicas drogas de ação glutamatérgica em fases iniciais do desenvolvimento em peixe-zebra. Ao longo do desenvolvimento, os receptores glutamatérgicos apresentam uma ordenada variabilidade entre as subunidades que os compõem, o que lhes confere diferentes propriedades farmacocinéticas e grau de afinidade por seus ligantes.Desta forma, neste trabalho foi analisado o perfil de resposta locomotora/comportamental do peixe-zebra ao antagonista glutamatérgico MK-801 em diferentes doses nas idades de 30, 60, 120 dias pós-fertilização (dpf) e 2 anos pós-fertilização(apf), bem como o efeito da pré-exposição à cafeína sobre os efeitos do MK-801. Adicionalmente, foi analisado o perfil de expressão das subunidades que compõem o receptor NMDA em cérebro total de peixe-zebra ao longo do desenvolvimento. A resposta locomotora ao ácido caínico (KA) também foi avaliada em diferentes doses nas idades de 7, 15 e 30 dpf. A pré-exposição ao ácido caínico em animais de 24 horas pós-fertilização (hpf) e 7 e 15 dpf foi confrontada pela exposição ao ácido caínico aos 2 meses de vida do peixe-zebra. Os resultados encontrados neste trabalho demonstram haver uma resposta idade-dependente na atividade locomotora do peixe-zebra, tanto para MK-801 quanto para ácido caínico.O pico de resposta locomotora ao MK-801 foi entre 60 e 120 dpf, o qual foi parcialmente prevenido pela pré-exposição à cafeína e foi capaz de alterar de forma idade-dependente o tempo no topo do aquário, utilizado como uma medida de ansiedade. A análise de expressão das subunidades dos receptores NMDA em cérebro de peixe-zebra demonstrou que as subunidades NR2C e NR2D possuem expressão tardia em relação às subunidades NR1, NR2A e NR2B. Os animais que foram expostos ao KA apresentaram alteração na atividade locomotora sem exibir características convulsivas clássicas. Entretanto, a pré-exposição ao KA aos 7dpf foi capaz de prevenir parcialmente os eventos convulsivos em resposta à injeção de KA (6 mg/Kg, i. p) aos 2 meses pós-fertilização.

Made available in DSpace on 2015-04-30T14:03:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000467154-Texto+Completo-0.pdf: 7061163 bytes, checksum: 094a6255137e152d52395cd63a9b0ee4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Alzheimer disease (AD) and Parkinson disease (PD) are the two most common neurodegenerative disorders affecting around 35 and 10 million people worldwide, respectively. These disorders are characterized by neuronal protein deposits and progressive loss of function or structure of central nervous system (CNS). Studies have shown that purinergic system is involved in mechanisms associated with neurodegenerative diseases such as AD and PD. The purinergic signaling is meditated by ATP and adenosine through activation of purinoceptors P2 and P1, respectively. The nucleotide and nucleoside levels are modulated by the action of the ectonucleotidase family, especially by ecto-Nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases) and ecto-5´-nucleotidase (EC-5´-Nt). These enzymes hydrolyze ATP to adenosine, which is subsequently deaminated by the enzyme Adenosine Deaminase (ADA) to inosine. Adenosine is described as an important neuromodulator and neuroprotective of CNS, and its modulation has proven to be a promising alternative for the treatment of neurodegenerative diseases. Thus, this study aims to evaluate behavioral parameters in models of cognitive impairment induced by scopolamine, 6-hydroxydopamine, and paraquat in zebrafish and study the possible effect of these models on the purinergic system. Our results, using a model of pharmacological cognitive impairment induced by scopolamine in adult zebrafish, showed that selective and non-selective inhibitors of adenosine receptors (Caffeine, ZM241385, and DPCPX) prevented the cognitive deficit induced by scopolamine. The same results were found for the adenosine transporter inhibitor (dipyridamole), and ADA inhibitor (EHNA). These data support the hypothesis of adenosinergic signalling can modulate memory mechanisms. We also developed a new experimental model of neurodegeneration by treating adult zebrafish chronically with paraquat herbicide (Pq) that results in symptoms of PD. Treatment consisted of six ip. injections of Pq in doses of 10 or 20 mg/kg and each injection was administered every three days. Locomotor behavior was assessed 24 hours after each injection and showed a decrease in both doses. The turn angle was also evaluated and showed difference between the doses administered compared to control group. Non-motor behaviors such as anxiety and social interaction were not significantly different after chronic treatment with Pq. However, after Pq exposure, the animals showed a deficit in Y-maze task memory. Apart from the behavioral data, our results presented an increase on dopamine levels, whereas DOPAC decreased in the experimental group showing change in dopamine metabolism. The amount of tyrosine hydroxylase demonstrated no significant difference between control and treated fish; however, dopamine transporter expression decreased in the group treated with 10 mg/kg Pq, and there was no change at the highest dose. Our study also evaluated the effect of chronic exposure of Pq and 6-hydroxydopamine (6-OHDA) neurotoxins, commonly used as an animal model of PD, on extracellular nucleotide and nucleoside metabolism. Two doses of 6-OHDA were tested, 25 and 50 mg/kg, and the animals were sacrificed at six days after exposure. Our data showed no changes in ectonucleotidase activities or ATP, ADP and AMP levels after exposure to Pq. However, a decrease of extracellular adenosine and increase in inosine levels were observed when compared to the control group. The 6-OHDA treatment did not affect the activity of NTPDase, EC-5´-Nt, and ATP levels in both tested doses. In contrast to the previous results, ADP levels were different for each dose used, while the AMP levels decreased in both doses. The adenosine and inosine showed an increase in both doses of 6-OHDA tested in zebrafish brains. These data suggest that the purinergic system can be modulated differently in experimental animals with symptoms of Parkinson's disease. In addition, this study also presented a new model of neurodegeneration using the Pq and confirms the involvement of purinergic system on neurodegeneration as well as its pharmacological potential in neurodegenerative diseases. / As doenças neurodegenerativas mais prevalentes são a doença de Alzheimer (DA) e a doença de Parkinson (DP) afetando cerca de 35 e 10 milhões de pessoas no mundo, respectivamente. Essas patologias são caracterizadas pelo depósito de proteínas em células neuronais e pela perda progressiva da função ou estrutura no sistema nervoso central (SNC). Estudos têm mostrado que o sistema purinérgico está envolvido nos mecanismos relacionados a DA e DP. A sinalização purinérgica é mediada pela ação do ATP e da adenosina através da ativação dos receptores P2 e P1, respectivamente. Os níveis de nucleotídeos e de nucleosídeos são modulados pela ação enzimática das ectonucleotidases, especialmente pela ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases (NTPDases) e ecto-5'-nucleotidase (EC-5´-Nt). Estas enzimas hidrolisam ATP em adenosina, que é subsequentemente desaminado pela enzima adenosina deaminase (ADA) a inosina. A adenosina é descrita como importante neuromodulador e neuroprotetor do SNC e sua modulação tem se mostrado uma alternativa promissora para o tratamento de doenças neurodegenerativas. Com isso, este estudo visa avaliar parâmetros comportamentais em modelos de déficit cognitivo induzidos por escopolamina, por 6-hidroxidopamina e por paraquat em peixe-zebra, e estudar o possível efeito desses modelos sobre o sistema purinérgico. Nossos resultados, utilizando o modelo farmacológico de déficit cognitivo induzido por escopolamina em peixe-zebra adulto, mostraram que os inibidores seletivos e não seletivos dos receptores de adenosina (Cafeína, ZM241385 e DPCPX) preveniram o déficit causado pela escopolamina. Os mesmos resultados foram encontrados para o inibidor do transportador de adenosina (dipiridamol) e inibidor da ADA (EHNA). Esses dados suportam a hipótese de que a sinalização adenosinérgica pode modular o processamento da memória. Nosso estudo também caracterizou um novo modelo experimental de neurodegeneração, tratando peixes-zebra adultos cronicamente com paraquat (Pq), herbicida associado aos sintomas da DP. O tratamento consistiu de seis injeções intraperitoniais nas doses de 10 ou 20 mg/kg a cada três dias. O comportamento locomotor foi avaliado 24 horas após cada injeção e mostrou uma diminuição em ambas as doses. O ângulo de giro também foi avaliado 24 horas após cada injeção e demonstrou diferença entre as doses administradas. Comportamentos não motores como ansiedade e interação social não apresentaram diferença significativa após o tratamento crônico com Pq. No entanto, os animais tratados com Pq demonstraram déficit de memória em tarefa de labirinto em Y comparados com o grupo controle. Além dos dados comportamentais, nossos resultados mostraram um aumento nos níveis de dopamina, enquanto os de DOPAC diminuíram nos animais tratados com Pq, mostrando mudança no metabolismo. Já a tirosina hidroxilase não apresentou diferença significativa entre animais do grupo controle e tratados, porém a expressão do transportador de dopamina diminuiu no grupo tratado com 10 mg/Kg de Pq, não havendo alteração na maior dose. Nosso estudo também investigou os efeitos da exposição crônica do Pq e da neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA), comumente usada como modelo animal de DP, sobre o metabolismo extracelular de nucleosídeos e nucleotídeos. Duas doses de 6-OHDA foram testadas, 25 e 50 mg/kg, e os animais foram eutanasiados seis dias após a exposição. Nossos dados mostraram que o Pq não alterou a atividade das NTPDases e EC-5´-Nt ou os níveis extracelulares de ATP, ADP e AMP. No entanto, o tratamento crônico com Pq diminui os níveis extracelulares de adenosina e aumentou os níveis de inosina. Os peixes tratados com 6-OHDA não apresentaram alterações na atividade das NTPDases e EC-5´-Nt, bem como nos níveis de ATP extracelular nas duas doses testadas. Porém, houve mudanças nos níveis de ADP e uma diminuição, em ambas as doses, nos níveis de AMP. Já os níveis extracelulares de adenosina e inosina apresentaram um aumento. Estes dados sugerem que o sistema purinérgico pode ser modulado de forma diferente em animais experimentais com sintomas de Parkinson. Além disso, este trabalho também apresentou um novo modelo de neurodegeneração utilizando o Pq além de reforçar o envolvimento do sistema purinérgico e o seu potencial farmacológico sobre doenças neurodegenerativas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431256-Texto+Completo-0.pdf: 478082 bytes, checksum: c6f6e34791efd5a484688e004ceee45b (MD5) Previous issue date: 2011 / Zebrafish has been increasingly used in behavioral studies, but data can present high variability. Most studies have been performed using isolated zebrafish, despite their interactive nature and dependence on shoal counterparts. We compared adult zebrafish behavioral parameters and cortisol levels after exposure to novelty in animals tested individually or in groups of three (triplets). In the exploratory behavior task, data from single fish and triplets were not significantly different, but single fish data were more disperse than in triplets in latency to and time spent in the tank upper part, and crossings (p<0. 01). In the light dark task, latency to enter in the dark zone, time in the light zone, and number of crossings were not different between groups, but results were more variable in single fish’s latency to enter the dark zone compared to triplets (p<0. 01). In the inhibitory avoidance task, only fish trained individually showed increased test latencies compared to training (p<0. 05). Again, data dispersion was higher in single fish than in triplets (p<0. 001). Cortisol levels from animals in their housing tank were lower than in fish exposed to the exploratory tank for 5 min (p<0. 05). Compared to triplets, cortisol levels of fish individually exposed to the test tank were higher (p<0. 001) and more variable (p<0. 05). Thus, using single zebrafish in behavioral studies increases data variability, probably by disrupting their natural shoal behavioral strategies. This feature can be beneficial or detrimental depending on study aims and should be considered when designing, analyzing and interpreting zebrafish behavioral data. / O peixe zebra (Danio rerio) vem sendo cada vez mais utilizado em estudos de biologia do desenvolvimento, genética, farmacologia e de comportamento, mas os dados comportamentais obtidos nessa espécie apresentam uma grande variabilidade. A maioria dos estudos vem sendo realizados utilizando animais isolados, apesar do seu comportamento natural de formar e viver em cardume. Nós comparamos alguns parâmetros comportamentais e também os níveis de cortisol de peixe zebra adultos após a exposição à novidade. Na tarefa de comportamento exploratório, os resultados dos animais testados individualmente ou em trios não foram significativamente diferentes, mas os resultados dos animais testados sozinhos foram mais dispersos do que os trios nos parâmetros avaliados (latência para explorar a parte superior do aquário, tempo gasto na parte superior do aquário e número de cruzamentos, p <0,01). Na tarefa de claro/escuro, não houve diferença no desempenho dos animais testados individualmente quando comparados com os testados em trios (latência para passar para o lado escuro, tempo no lado claro e número de cruzamentos), mas na latência para passar para o lado escuro os resultados foram mais dispersos quando os peixes foram testados isoladamente (p < 0,01). Na tarefa de esquiva inibitória, apenas os peixes treinados individualmente, apresentaram aumento na latência do teste em relação à latência do treino (p <0,05). Novamente, a dispersão dos dados foi maior nos peixes testados sozinhos em comparação com os testados em trios (p <0,001). Os níveis de cortisol dos animais controle (aquário moradia) eram mais baixos do que os níveis de cortisol dos animais expostos ao teste exploratório durante 5 min (p <0,05). Comparado com trios, os níveis de cortisol dos peixes expostos ao teste individualmente foram mais variáveis (p <0,001) e maiores (P <0,05).Em resumo, utilizar peixe zebra individualmente em testes comportamentais aumenta a variabilidade dos dados, provavelmente por perturbar o seu comportamento natural de formação de cardume. Estes achados mostram que testar peixe zebra isolados pode ser benéfico ou prejudicial, dependendo dos objetivos do estudo mas, isso deve ser levado em consideração ao se estabelecer protocolos comportamentais e também na interpretação dos resultados obtidos.