Submitted by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2014-12-18T17:01:07Z No. of bitstreams: 2 carlos_felipe_reis_costa_guimaraes.pdf: 3938293 bytes, checksum: e0cdf597f1d9513ef2531c8a0cd6278f (MD5) license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2014-12-18T17:56:25Z (GMT) No. of bitstreams: 2 carlos_felipe_reis_costa_guimaraes.pdf: 3938293 bytes, checksum: e0cdf597f1d9513ef2531c8a0cd6278f (MD5) license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2014-12-18T18:01:44Z (GMT) No. of bitstreams: 2 carlos_felipe_reis_costa_guimaraes.pdf: 3938293 bytes, checksum: e0cdf597f1d9513ef2531c8a0cd6278f (MD5) license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-18T18:01:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 carlos_felipe_reis_costa_guimaraes.pdf: 3938293 bytes, checksum: e0cdf597f1d9513ef2531c8a0cd6278f (MD5) license_rdf: 22974 bytes, checksum: 99c771d9f0b9c46790009b9874d49253 (MD5) Previous issue date: 2013 / Neste trabalho foi estudada a influ?ncia dos efeitos estruturais na rea??o de dimeriza??o associada ? obten??o do pept?deo antimicrobiano homotarsinina (Htr), bem como foram realizados ensaios hemol?ticos e de toxicidade desse pept?deo perante c?lulas humanas. Primeiramente foi realizada a s?ntese da cadeia monom?rica da homotarsinina (Htr-M), empregando-se a estrat?gia Fmoc de s?ntese em fase s?lida. Em seguida, o produto foi purificado por cromatografia l?quida de alta efici?ncia em fase reversa (CLAE-FR), tendo sido o homod?mero obtido sequenciado e caracterizado por espectrometria de massas (MALDI-ToF). Foram realizados estudos das prefer?ncias conformacionais da Htr-M por dicro?smo circular (CD) em diferentes meios e condi??es, como na presen?a de tamp?o Tris-HCl aquoso, em diferentes misturas de TFE-H2O e na presen?a de micelas de SDS. Realizou-se ent?o a rea??o de dimeriza??o do mon?mero em tr?s meios: (i) solu??o tamp?o Tris-HCl 100 mmol?L-1 pH 8,5, (ii) solu??o micelar de SDS 350 mmol?L-1 em tamp?o Tris-HCl 100 mmol?L-1 pH 8,5 e (iii) solu??o TFE:H2O 40:60 (v/v) em Tris-HCl 100 mmol?L-1 pH 8,5. O acompanhamento cin?tico das rea??es de dimeriza??o foi realizado por CLAE-FR. Como resultado, foi observado que em solu??o micelar de SDS a rea??o se completa em aproximadamente 6h (rendimento de 62%), enquanto que em solu??o tamp?o e em solu??o de TFE:H2O s?o necess?rias 24h e 48h (rendimentos de 66% e 85%), respectivamente. Os resultados de CD obtidos para a Htr-M em condi??es similares ?s empregadas nas rea??es de dimeriza??o mostraram que a Htr-M apresenta predominantemente conforma??o rand?mica em tamp?o Tris-HCl aquoso, enquanto adota predominantemente estrutura de h?lice ? em solu??o de TFE:H2O (40:60) ou na presen?a de micelas de SDS. Assim, os resultados do acompanhamento cin?tico da rea??o de dimeriza??o indicam que a conforma??o predominantemente rand?mica da Htr-M em tamp?o Tris-HCl aquoso, bem como a diminui??o de sua mobilidade e maior intera??o com a superf?cie das micelas de SDS e os efeitos de agrega??o que ocorrem em solu??o de TFE:H2O influenciam diretamente na forma de aproxima??o das cadeias monom?ricas, atuando de maneiras diferentes na forma??o da liga??o dissulfeto. Por fim, foram realizados ensaios de toxicidade em c?lulas humanas, os quais mostraram que Htr-M e Htr n?o apresentam toxicidade a leuc?citos mononucleares, al?m do que tamb?m n?o apresentam atividade hemol?tica. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Qu?mica, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2013. / ABSTRACT This dissertation is mainly related to studies concerning the role of the structural effects on the dimerization reaction that leads to the antimicrobial peptide homotarsinin (Htr). Besides, hemolytic assays as well as the toxicity of this peptide against human cells have also been investigated. Firstly, the monomeric chain (Htr-M) was obtained by Fmoc solid-phase synthesis. The product was purified by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and then sequenced and characterized by mass spectrometry (MALDI-ToF). Circular dichroism (CD) studies regarding the Htr-M conformational preferences were performed for the peptide in different media and conditions, such as Tris-HCl aqueous buffer, TFE:H2O mixtures, as well as in the presence of SDS micelles. The dimerization reaction was then performed in three distinct media, namely: (i) Tris-HCl aqueous buffer 100 mmol?L-1 pH 8.5, (ii) SDS micellar solution of 350 mmol?L-1 in Tris-HCl 100 mmol?L-1 pH 8.5 and (iii) TFE:H2O 40:60 in Tris-HCl 100 mmol?L-1 pH 8.5. CD studies performed in similar conditions indicated that Htr-M presents predominantly random conformations in aqueous Tris-HCl buffer, whereas it adopts ?-helical arrangements in either TFE:H2O (40:60) solution or in the presence of SDS micelles. The kinetic monitoring of the dimerization reactions was carried out by RP-HPLC. The results indicated that the reaction is completed in about 6 h (yield 62%) in the presence of SDS micelles, whereas 24 h and 48 h (yields 66% and 85%) are necessary for the dimerizations performed in the aqueous Tris-HCl and in the TFE:H2O solutions, respectively. Therefore, the kinetic studies indicated that the predominantly random conformation of Htr-M in Tris-HCl aqueous buffer, as well as the mobility decrease alongside with the peptide-micelle interactions in the presence of SDS, as well as the aggregation effects in the TFE:H2O solution directly affect the inter-chain approach process, which leads to different pathways of the disulfide bond formation. Finally, toxicity assays were performed in human cells and the results showed that both Htr-M and Htr are not toxic against mononuclear leukocytes and also do not show hemolytic activity.

?rea de concentra??o: Qu?mica org?nica. / Submitted by Alexandre Soares (alexandredesoares@yahoo.com.br) on 2016-08-25T12:50:30Z No. of bitstreams: 1 eduardo_ferreira_coelho_junior.pdf: 3071757 bytes, checksum: e9deb6aa475b6a67aeab117cf2df4603 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2016-09-08T17:54:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 eduardo_ferreira_coelho_junior.pdf: 3071757 bytes, checksum: e9deb6aa475b6a67aeab117cf2df4603 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T17:54:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 eduardo_ferreira_coelho_junior.pdf: 3071757 bytes, checksum: e9deb6aa475b6a67aeab117cf2df4603 (MD5) Previous issue date: 2015 / O presente trabalho prop?e a glicosila??o do pept?deo antimicrobiano HSP-1, composto por 14 res?duos de amino?cidos e isolado originalmente da esp?cie Hyla punctata (PRATES et al., 2004) empregando-se a s?ntese de pept?deos em fase s?lida associada a rea??o de cicloadi??o catalisada por cobre (SHARPLESS et al., 2002). Para isto, foi realizada a s?ntese do pept?deo HSP-1 propargilado ([PAG1]HSP-1) atrav?s da metodologia de s?ntese de pept?deo em fase s?lida (SPFS) via estrat?gia Fmoc. Ap?s a confirma??o da obten??o do [PAG1]HSP-1 por espectrometria de massa (MALDI-ToF), foi realizada a glicosila??o com as inser??es dos derivados azido acetilado de glicose e N-acetilglicosamina na presen?a de sulfato de cobre penta hidratado (CuSO4.5H2O) e de ascorbato de s?dio como agente redutor para obten??o dos glicopept?deo-triaz?is [Glc-trz-G14]HSP-1 e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1. Os produtos das s?nteses foram purificados por cromatografia l?quida de alta efici?ncia de fase reversa (CLAE-FR) e tamb?m caracterizados por espectrometria de massa (MALDI-ToF), confirmando a forma??o regiosseletiva dos glicopept?deo-triaz?is sem produ??o de subprodutos da glicosila??o. Os estudos biol?gicos comparativos entre o pept?deo HSP-1 e de suas formas glicosiladas revelaram que as modifica??es qu?micas n?o alteraram significativamente a efic?cia do HSP-1 contra agentes bacterianos. Entretanto, os testes antif?ngicos demonstraram melhor atividade fungicida para os glicopept?deos quando comparado ao pept?deo HSP-1. Foram ainda realizados estudos conformacionais e de intera??o entre o pept?deo e os glicopept?deos com ves?culas fosfolip?dicas de car?ter zwitteri?nico (POPC) e ani?nico (POPC/POPG). Os estudos conformacionais empregando-se a t?cnica de Dicro?smo Circular (CD) revelaram menor teor de helicidade tanto em LUV?s de POPC quanto de POPC/POPG para os glicopept?deos em rela??o a HSP-1. Os estudos de intera??o foram realizados empregando-se as t?cnicas de espalhamento de luz din?mico (DLS), potencial zeta (?) e extravasamento de carboxifluoresce?na (CF). De uma maneira geral, verifica-se que a varia??o no di?metro hidrodin?mico (?Dh) para ves?culas ii zwitteri?nicas POPC e ani?nicas POPC/POPG ? maior para os glicopept?deos [Glc-trz-G14]HSP-1e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1 em rela??o ao HSP-1. Por outro lado, a varia??o do potencial zeta tanto em ves?culas zwitteri?nicas quanto em ves?culas predominantemente negativas causada por HSP-1 foi maior em compara??o ao efeito causado pelas formas glicosiladas. E por fim, os resultados de extravasamento de carboxifluoresce?na induzida por cada esp?cie (HSP-1, [Glc-trz-G14]HSP-1 e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1) mostrou que a capacidade l?tica dos glicopept?deos ? ligeiramente maior em ambos os meios biomim?ticos quando comparados com o pept?deo HSP-1. Assim sendo, este trabalho mostrou que a presen?a do anel triaz?lico pode ser respons?vel pela maior atividade antif?ngica dos glicopept?deos [Glc-trz-G14]HSP-1 e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1 em rela??o ao pept?deo HSP-1. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Qu?mica, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2015. / ABSTRACT This work proposes the glycosylation of the antimicrobial peptide HSP-1, containing 14 amino acid residues and originally isolated from Hyla punctata species (PRATES et al., 2004) by solid phase peptides synthesis associated with cycloaddition reaction copper catalyzed (SHARPLESS et al., 2002). The synthesis of propargylated HSP-1 ([PAG1] HSP-1) was carried out by solid phase peptide synthesis using Fmoc strategy and characterized by mass spectrometry (MALDI-ToF). In order to obtain the glycopeptide triazoles [Glc-trz-G14]HSP-1 and [GlcNAc-trz-G14]HSP-1, azide derivatives acetylated glucose and N-acetylglucosamine were used in the presence of copper sulfate pentahydrate (CuSO4. 5H2O) and sodium ascorbate as a reducing agent. The products were purified by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and characterized by mass spectrometry (MALDI-ToF), confirming the regioselective reaction without glycosylation secondary products. Comparative studies among HSP-1 peptide and their glycosylated forms don?t show significant changes in antibacterial assays. However, the antifungal tests have shown a significant increase in fungicidal activity for glycopeptides when compared to HSP-1 peptide. Furthermore, it were carried out conformational and interaction studies among the peptide and glycopeptides with zwitterionic (POPC) and anionic (POPC/POPG) phospholipid vesicles. The circular dichroism (CD) spectra have revealed lower helicity to glycopeptides relative HSP-1 in both zwitterionic and anionic LUV's. Interaction studies were performed employing the dynamic light scattering (DLS), zeta potential and leakage carboxyfluorescein (CF) techniques. Summing up, the hydrodynamic diameter variation (?Dh) for zwitterionic and anionic vesicles is greater for glycopeptides [Glc-trz-G14]HSP-1 and [GlcNAc-trz-G14]HSP-1 when compared with HSP-1. On the other hand, the zeta potential variation in zwitterionic or negative vesicles caused by HSP-1 was higher compared to the effect caused by glycosylated forms. Finally, the results of carboxyfluorescein leakage induced by each species (HSP- iv 1 [Glc-trz-G14] HSP-1 and [GlcNAc-trz-G14] HSP-1) showed a higher lytic capacity of glycopeptides in both media in relation to the HSP-1 peptide. Thus, it showed that the presence of triazole rings may be responsible for the higher antifungal activity of derivatives [Glc-trz-G14] HSP-1 and [GlcNAc trz-G14] HSP-1.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:10:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KellyaFMB_DISSERT.pdf: 2697762 bytes, checksum: 1ffb7fc96fd841e9f2d4e4bbe9d99a4b (MD5) Previous issue date: 2013-12-17 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The genus Saccharum belongs to Poaceae family. Sugarcane has become important monocultures in Brazil due to their products: ethanol and sugar. The production may change between different regions from Brazil. This difference is related to soil, climatic conditions and temperature that promotes oxidative stress that may induce an early flowering. The aim of this work was to identify the effects of oxidative stress. In order to analyse this, sugarcane plants were submitted to oxidative stress using hydrogen peroxide. After this treatment, the oxidative stress were analyzed Then, the plant responses were analyzed under different approaches, using morphophysiological, biochemical and molecular tools. Thus, sugarcane plants were grown under controlled conditions and until two months they were subjected first to a hydroponics condition for 24 hours in order to acclimation. After this period, these plants were submitted to oxidative stresse using 0 mM, 10 mM, 20 mM and 30 mM hydrogen peroxide during 8 hours. The histomorphometric analysis allowed us to verify that both root and leaf tissues had a structural changes as it was observed by the increased in cell volume, lignin accumulation in cell walls. Besides, this observation suggested that there was a change in redox balance. Also, it was analyzed the activity of the SOD, CAT and APX enzymes. It was observed an increase in the SOD activity in roots and it was also observed a lipid peroxidation in leaves and roots. Then, in order to identify proteins that were differently expressed in this conditions it was used the proteomic tool either by bidimensional gel or by direct sequencing using the Q-TOF EZI. The results obtained with this approach identified more than 3.000 proteins with the score ranging from 100-5000 ions. Some of the proteins identified were: light Harvesting; oxygenevolving; Thioredoxin; Ftsh-like protein Pftf precusor; Luminal-binding protein; 2 cys peroxiredoxin e Lipoxygenase. All these proteins are involved in oxidative stress response, photsynthetic pathways, and some were classified hypothetical proteins and/or unknown (30% of total). Thus, our data allows us to propose that this treatment induced an oxidative stress and the plant in response changed its physiological process, it made changes in tissue, changed the redox response in order to survival to this new condition / A cana-de-a??car ? uma das principais monoculturas no Brasil devido ? import?ncia dos seus produtos: etanol e a??car. A produtividade pode variar entre as diferentes regi?es do Brasil como sudeste e nordeste, por adapta??es destas gram?neas as diferentes condi??es edafo-clim?ticas. As condi??es do solo e da temperatura da regi?o Nordeste podem promover o estresse oxidativo, h?drico e consequentemente o florescimento precoce o que acarreta perdas consider?veis na produ??o. Neste trabalho, procurou-se averiguar as prov?veis altera??es morfofisiol?gicas, bioqu?micas e moleculares resultantes da resposta das plantas ao estresse oxidativo. Deste modo, plantas de cana-de-a??car foram cultivadas em condi??es controladas e quando atingiram dois meses foram submetidas a uma condi??o de hidrop?nia por 24 horas para sua aclimata??o e em seguida ao estresse oxidativo realizado por 8 horas utilizando as concentra??es de per?xido de hidrog?nio: 0 mM; 10 mM; 20 mM e 30 mM. Ap?s este per?odo, foram observadas as seguintes altera??es morfol?gicas para as folhas: o fechamento foliar parcial ou total de acordo com a concentra??o de per?xido de hidrog?nio utilizada. As an?lises histomorfol?gicas permitiram verificar para ambos os tecidos (foliar e radicular) que houve altera??es estruturais relacionadas ao aumento do volume das c?lulas propiciando, assim, a quebra das paredes das membranas dos vasos condutores xilema e floema entre outras modifica??es anat?micas em diferentes regi?es, assim como a lignifica??o em algumas regi?es. Tamb?m foi analisada a atividade enzim?tica das enzimas Super?xido dismutase - SOD; Catalase - CAT e Ascorbato peroxidase - APX. Foi observado um aumento na atividade da enzima super?xido dismutase nas ra?zes. Nessa abordagem bioqu?mica, foi tamb?m analisada a peroxida??o de lip?deos que mostrou que ocorreram danos nas membranas das folhas e ra?zes principalmente para a concentra??o de 30 mM. Entretanto, para a enzima catalase foi observada uma baixa atividade em folhas e esta atividade n?o foi detectada nas ra?zes. Contudo, os resultados histomorfologicos juntamente com os resultados bioqu?micos fortalecem que o tratamento com per?xido de hidrog?nio pode ter alterado a homeostase redox e as vias de sinaliza??o promovendo assim as altera??es morfol?gicas (aumento de c?lulas, lignifica??o) e bioqu?micas (EROs e antioxidantes). Outra ferramenta utilizada nesse trabalho foi a prote?mica, onde foi utilizado o sequenciamento tanto por meio de g?is bidimensionais como tamb?m pelo sequenciamento direto utilizando o EZI Q TOF. Os resultados obtidos permitiram com essa abordagem identificar mais de 3.000 prote?nas com o score variando de 100-5000 ?ons. Algumas das prote?nas identificadas foram: light Harvesting; oxygen-evolving; Thioredoxin; Ftsh-like protein Pftf precusor; Luminal-binding protein; 2 cys peroxiredoxin e Lipoxygenase. Estas prote?nas est?o envolvidas no metabolismo em resposta ao estresse oxidativo, prote?nas do aparelho fotossint?tico, al?m de prote?nas hipot?ticas e/ou desconhecidas (30% do total). Desta forma, os dados obtidos nos permitem propor uma hip?tese, onde ?s prote?nas identificadas estariam envolvidas em processos fisiol?gicos, na remodela??o de tecidos, dano/degrada??o e s?ntese de antioxidante/ desintoxicante, correlacionada aos dados de resposta de defesa enzim?tica, ac?mulo de H2O2 nos tecidos ativando a peroxida??o lip?dica nas paredes das membranas das c?lulas. Desta forma ativando v?rias vias de cascata de sinaliza??o