L'objectif de ce travail est d'introduire, par ingénierie génétique, un site allostérique dans une enzyme pour moduler son activité catalytique par la liaison d'un ligand choisi. Ces enzymes pourraient servir de senseurs moléculaires pour la détection, voire le dosage du ligand. Nous avons décidé de créer ces sites allostériques dans la beta-lactamase TEM-1 d'E. coli, une enzyme dégradant les antibiotiques de type pénicilline, en réalisant l'ingénierie de trois boucles de l'enzyme. Celles-ci sont proches l'une de l'autre dans l'espace et pourraient servir d'épitope discontinu pour la reconnaissance par un anticorps ou de paratope, à savoir le site de liaison d'un anticorps, pour la reconnaissance d'autres protéines ou de petites molécules. Notre hypothèse de travail est que ces beta-lactamases chimériques partageront certaines similitudes avec les anticorps de camélidés dont le site de reconnaissance n'est constitué que de trois boucles. Comme nous ne savions pas a priori quelles sont les séquences à introduire pour lier la molécule cible, nous avons introduit des séquences dégénérées pour créer une grande banque de mutants et sélectionner dans cette banque les clones ayant une affinité pour le ligand d'intérêt. La partie la plus difficile de ce projet fut la création de la collection d'enzymes mutantes contenant trois boucles dégénérées. La dégénérescence de la boucle 1, située à proximité du site actif, a été réalisée en remplaçant aléatoirement trois résidus. Dans la boucle 2, un peptide aléatoire de cinq, six ou sept résidus a été inséré entre deux cystéines et dans la boucle 3, une insertion de six résidus aléatoires a été réalisée. En pratique, l'ingénierie des boucles 1 et 2 a été effectuée dans la même construction pour créer trois banques (trois tailles d'insert différentes dans la boucle 2). D'autre part, nous disposions déjà de la banque contenant l'insertion dans la boucle 3. Ces banques de première génération ont ensuite subit une sélection in vivo pour ne garder que les clones possédant une certaine activité catalytique, par culture des bactéries infectées sur un milieu contenant de l'ampicilline. Cette étape nous a permis d'avoir un contrôle sur la qualité des banques créées car tous les mutants d'insertions retenus ont obligatoirement une structure tertiaire. Nous avons également montré que la présence de deux résidus cystéines est nécessaire de part et d'autre de l'insert dans la boucle 2 pour maintenir une certaine activité enzymatique. D'autre part, la boucle 1 ne semble pas tolérer d'insertion peptidique et ne permet que la mutagenèse par remplacement. Les banques de première génération ont ensuite été combinées pour créer une banque de seconde génération contenant les trois boucles dégénérées. Cette construction hiérarchisée a permis, avec un bon rendement, la création d'une banque combinatoire de grande taille et de bonne qualité. Grâce à la technique d'expression en surface de phage, cette banque a ensuite été soumise à une sélection in vitro afin d'isoler les clones ayant acquis de l'affinité pour des molécules cibles. Ces ligands sont un ion métallique, le Ni(II), et deux petites molécules organiques, la kanamycine et la sulfanilamide, pour lesquelles une protéine liante serait intéressante comme outil de détection. En ce qui concerne les clones sélectionnés avec le nickel, tous les clones testés contiennent des résidus histidine et montrent une modulation de l'activité en présence du métal, que ce soit une activation ou une inhibition de celle-ci. La meilleure activation a été obtenue pour le clone Ni-5-Amp20-#11, qui voit son activité doublée lorsqu'il est complexé au nickel, tandis que la meilleure inhibition a été obtenue pour le clone Ni-5-#2 avec une diminution de 77 % de l'activité. Quant à la meilleure affinité, elle a été obtenue pour le clone Ni-5-#12 avec une constante de dissociation de 7.10-5 M. Les autres valeurs de Kd varient entre 10-4 M et 10-3 M. Parmi les clones issus de la sélection avec la kanamycine, nous avons trouvé un mutant dont l'activité catalytique est augmentée de 44 % en présence du ligand. Sa constante de dissociation est de 6,6.10-4 M. Quant à la sélection avec la sulfanilamide, elle ne nous a pas permis à ce jour d'isoler des clones ayant acquis une affinité détectable pour cette molécule. Ces résultats nous laissent espérer que la banque construite contient potentiellement des clones ayant la capacité de lier une variété de cibles différentes. Si c'est le cas, ces enzymes chimériques possèdent des avantages sur les anticorps conjugués habituellement utilisés en immuno-détection, car la fonction de reconnaissance et la fonction enzymatique sont portées par la même molécule. Ces protéines pourraient donc être produites facilement et à plus faible coût. De plus, la modulation d'activité permet en principe de détecter la présence du ligand cible en phase homogène.

L'objectif de ce travail est d'introduire, par ingénierie génétique, un site allostérique dans une enzyme pour moduler son activité catalytique par la liaison d'un ligand choisi. Ces enzymes pourraient servir de senseurs moléculaires pour la détection, voire le dosage du ligand. Nous avons décidé de créer ces sites allostériques dans la beta-lactamase TEM-1 d'E. coli, une enzyme dégradant les antibiotiques de type pénicilline, en réalisant l'ingénierie de trois boucles de l'enzyme. Celles-ci sont proches l'une de l'autre dans l'espace et pourraient servir d'épitope discontinu pour la reconnaissance par un anticorps ou de paratope, à savoir le site de liaison d'un anticorps, pour la reconnaissance d'autres protéines ou de petites molécules. Notre hypothèse de travail est que ces beta-lactamases chimériques partageront certaines similitudes avec les anticorps de camélidés dont le site de reconnaissance n'est constitué que de trois boucles. Comme nous ne savions pas a priori quelles sont les séquences à introduire pour lier la molécule cible, nous avons introduit des séquences dégénérées pour créer une grande banque de mutants et sélectionner dans cette banque les clones ayant une affinité pour le ligand d'intérêt. La partie la plus difficile de ce projet fut la création de la collection d'enzymes mutantes contenant trois boucles dégénérées. La dégénérescence de la boucle 1, située à proximité du site actif, a été réalisée en remplaçant aléatoirement trois résidus. Dans la boucle 2, un peptide aléatoire de cinq, six ou sept résidus a été inséré entre deux cystéines et dans la boucle 3, une insertion de six résidus aléatoires a été réalisée. En pratique, l'ingénierie des boucles 1 et 2 a été effectuée dans la même construction pour créer trois banques (trois tailles d'insert différentes dans la boucle 2). D'autre part, nous disposions déjà de la banque contenant l'insertion dans la boucle 3. Ces banques de première génération ont ensuite subit une sélection in vivo pour ne garder que les clones possédant une certaine activité catalytique, par culture des bactéries infectées sur un milieu contenant de l'ampicilline. Cette étape nous a permis d'avoir un contrôle sur la qualité des banques créées car tous les mutants d'insertions retenus ont obligatoirement une structure tertiaire. Nous avons également montré que la présence de deux résidus cystéines est nécessaire de part et d'autre de l'insert dans la boucle 2 pour maintenir une certaine activité enzymatique. D'autre part, la boucle 1 ne semble pas tolérer d'insertion peptidique et ne permet que la mutagenèse par remplacement. Les banques de première génération ont ensuite été combinées pour créer une banque de seconde génération contenant les trois boucles dégénérées. Cette construction hiérarchisée a permis, avec un bon rendement, la création d'une banque combinatoire de grande taille et de bonne qualité. Grâce à la technique d'expression en surface de phage, cette banque a ensuite été soumise à une sélection in vitro afin d'isoler les clones ayant acquis de l'affinité pour des molécules cibles. Ces ligands sont un ion métallique, le Ni(II), et deux petites molécules organiques, la kanamycine et la sulfanilamide, pour lesquelles une protéine liante serait intéressante comme outil de détection. En ce qui concerne les clones sélectionnés avec le nickel, tous les clones testés contiennent des résidus histidine et montrent une modulation de l'activité en présence du métal, que ce soit une activation ou une inhibition de celle-ci. La meilleure activation a été obtenue pour le clone Ni-5-Amp20-#11, qui voit son activité doublée lorsqu'il est complexé au nickel, tandis que la meilleure inhibition a été obtenue pour le clone Ni-5-#2 avec une diminution de 77 % de l'activité. Quant à la meilleure affinité, elle a été obtenue pour le clone Ni-5-#12 avec une constante de dissociation de 7.10-5 M. Les autres valeurs de Kd varient entre 10-4 M et 10-3 M. Parmi les clones issus de la sélection avec la kanamycine, nous avons trouvé un mutant dont l'activité catalytique est augmentée de 44 % en présence du ligand. Sa constante de dissociation est de 6,6.10-4 M. Quant à la sélection avec la sulfanilamide, elle ne nous a pas permis à ce jour d'isoler des clones ayant acquis une affinité détectable pour cette molécule. Ces résultats nous laissent espérer que la banque construite contient potentiellement des clones ayant la capacité de lier une variété de cibles différentes. Si c'est le cas, ces enzymes chimériques possèdent des avantages sur les anticorps conjugués habituellement utilisés en immuno-détection, car la fonction de reconnaissance et la fonction enzymatique sont portées par la même molécule. Ces protéines pourraient donc être produites facilement et à plus faible coût. De plus, la modulation d'activité permet en principe de détecter la présence du ligand cible en phase homogène.

Piscine nodaviruses are members of genus Betanodavirus, which infects a large number of species of fish and causes massive mortality in larvae and juveniles. The disease causes great economic losses in aquaculture and sea-ranching. Virus-like particles (VLPs) of dragon grouper nervous necrosis virus (DGNNV) were employed to screen the consensus sequences of paratopes by the phage display peptide technology. Using two biopanning methods to screen phages, their binding efficiency was examined by ELISA. The effects of treatment by different blocking buffers on the ELISA assays and the effects of the ELISA plates exposed to UV light were tested. The display phages with high binding efficiency were sequenced after the inserted fragment by PCR amplification. With NCBI BLAST, they were closely related to the claudin family and the consensus sequences were on the region of EL1 or EL2. Few non-claudin sequences demand further comparison with other kinds of receptors to ascertain the characters of these sequences.

Le but de ce travail est de découvrir des nouvelles protéines suceptibles d'interférer avec le cycle vital du virus HIV. De par leur repliement, les protéines à motifs ankyrines peuvent constituer une ossature protéique trés bien adaptée à cet objectif. Plusieurs interacteurs spécifiques de la protéine MA-CA du HIV ont été sélectionnées par exposition sur phage à partir d'une bibliothèque de variants d'ankyrines. Trois protéines isolées ont été produites à partir de clones ayant une forte activité de liaison. Le meilleur interacteur protéique (1D4) interagit avec un épitope situié sur le domaine CA. La constante de dissociation entre 1D4 et la protéine HACA a été déterminée par Calorimétrie de Titrage Isotherme (ou ITC) et est égale à 0,45M. La protéine 1D4 n'a pas d'effet détectable sur la maturation virale suivie par une technique ELISA de dosage de la Protease du HIV. En revanche, cette protéine interfere avec l'assemblage viral dans des cellules supT1 qui exprime de façon stable la protéine 1D4 sous forme myristoylée. Ce resultat ouvre une perspective d'appoche pour interferer avec le cycle vital du HIV. / Presently, the standard regimen for antiretroviral treatment is highly active antiretroviral therapy (HAART). However, this strategy inherits the well-known side effects and is prone to promote the HIV drug-resistant strains. As a consequence, gene therapy has been introduced as an alternative approach. In this study, we aimed to discover the novel protein-based agents for intervening viral replication by gene targeting procedure. Regarding the efficient folding dynamic in cytoplasm, ankyrin repeat protein was considered to be a candidate scaffold. Several engineered ankyrin binders specific to HIV MA-CA domain were successfully retrieved from the ankyrin-displayed phage library. Three positive clones with high binding activity by ELISA were selected for further analyzing their binding property in soluble form. The best binder, 1D4, recognized its epitope located on CA domain as shown by Western immunobloting and ELISA. The affinity of 1D4 against H6MA-CA was 0.45 μM with one to two moles of target molecule determined by isothermal titration calorimetry (ITC). Although 1D4 exhibited no effect on viral maturation as verified by an ELISA based HIV protease assay technique, it disturbed the viral assembly process in Sup-T1 cells which stably expressed the myristoylated 1D4. This finding has provided a concrete prospect for HIV life cycle interruption by stem cell gene therapy in the future.

Le travail de thèse présente une approche innovante pour la construction d’une bibliothèque de protéines basées sur l’ossature protéique. L’objectif est de générer une source de biodiversité artificielle permettant la création de nouvelles capacités d’interaction avec des cibles d’intérêts. Une banque, basée sur une ossature protéique bactérienne avait déjà été construite dans l’équipe, mais elle nécessitait d’être optimisée. L’étape initiale a été d’explorer les raisons de l’instabilité des protéines de la banque de première génération, ceci par des approches d’étude de la structure in silico suivie d’une stratégie de mutagenèse dirigée. Des positions déstabilisantes existant dans la première banque ont donc été remplacées dans la banque de deuxième génération. La deuxième étape a eu pour objectif de diminuer le nombre de positions diversifiées et de simplifier le schéma de diversification des variants de la banque. Puis un procédé de filtration et de shuffling de ces variants a été mis au point pour augmenter la proportion de séquences codantes correctes. Une nouvelle stratégie de filtration basée sur la technique d’exposition sur phage a été élaborée, en exploitant le fait que la protéine matrice de la banque, l'ossature protéique a un partenaire biologique capable d’interagir sur la zone « constante », non modifiée par le schéma de diversification. Ainsi les variants de la banque exposés dans une conformation correcte à la surface des phages ont pu être capturés par ce partenaire. Ensuite, les séquences correspondant à ces variants ont été recombinées entre elles pour recréer une plus grande diversité utile. Une bibliothèque optimisée composée de 2.8 x 108 protéines indépendantes a ainsi été obtenue. Cette nouvelle banque optimisée a permis de sélectionner par Phage display, des interacteurs contre plusieurs cibles de structures différentes. Ces nouveaux interrupteurs sont spécifiques de leurs cibles et présentent des affinités de l’ordre du μM. Une approche de séquençage à haut débit a également été entreprise pour réaliser une analyse plus approfondie des séquences de cette bibliothèque et de notre processus de sélection. Cette approche nous a apporté une nouvelle dimension pour la caractérisation des banques construites au laboratoire notamment concernant la diversité réelle de ces banques. Pour le suivi de sélections, nous avons appréhendé le séquençage haut débit comme un moyen d’identifier les interacteurs spécifiques d’une cible par l’analyse exhaustive des séquences issues des sélections. L’objectif est ici de mettre au point un protocole utilisant l’approche NGS pour identifier les interacteurs spécifiques isolées par Phage Display. / Here new methods to build a library of artificial proteins based on a new protein framework have been developed. The objective is to generate a source of artificial biodiversity allowing the creation of new interaction capacities with various specific targets. A first-generation library was previously built with this scaffold, but it needed to be optimized. The first step was to explore the reasons of the instability of the first generation proteins library through an in silico approaches followed by a site-directed mutagenesis strategy. The second step was to reduce the number of diversified positions and simplify the randomization scheme of the variants of the library. Then a method of filtering and shuffling of the variants of the bank was elaborated. To increase the proportion of correct coding sequences, a new filtration strategy based on the phage display technique has been developed, exploiting the fact that the scaffold of the librarie. This scaffold has a particularly interesting biological partner able to interact on the "constant" zone. This filtration made it possible to recover a set of well-folded clones. Then, DNA sequences corresponding to these clones were recombined with each other to recreate a greater useful diversity. An optimized library of 2.8 x 108 independent proteins was obtained. This new optimized library has enabled us to select, by a phage display approach, binders against several targets of different structures. These new binders are specific for their targets and have affinities in the μM range. A high throughput sequencing (NGS) approach was also undertaken to further analyse the library sequences and the selection process. This approach offers a new dimension for the characterization of the library built in the laboratory, especially concerning it actual diversity. To follow the selections, we have considered the NGS as a way to identify the target-specific binders through exhaustive analysis of the sequences obtained from selections. The objective here is to develop a general protocol using the NGS approach to identify specific binders isolated by Phage Display.

No description available.

An antibody library against Eimeria tenella sporozoites was constructed by phage display. Total RNA was isolated from the spleen, bone marrow, and ceca of immune chickens, and was used to reverse-transcribe cDNA. Heavy and light antibody variable genes were amplified from cDNA by the Polymerase Chain Reaction (PCR), using primer pairs that contain complementary sequences encoding a short linker sequence. The single-chain antibody fragment (scFv) was obtained by a secondary overlap PCR with primers that incorporate SfiI restriction sites, thus allowing for subsequent cloning into the phagemid vector pComb3X. Vector and scFv insert were digested with SfiI, ligated, and transformed into competent XL1-Blue Escherichia coli cells by electroporation, yielding a library with 7.4 x 107 total transformants. The culture was grown under carbenicillin selective pressure, rescued with helper phage, and the antibody-displaying phage was precipitated by PEG/NaCl, and subsequently used for panning. Five panning rounds were performed using cryopreserved E. tenella sporozoites, with a gradual increase of washing stringency to select for specific, highaffinity binders. A 1000-fold increase in phage output was obtained after 3 rounds of panning. There was clear enrichment of the positive clones over the panning rounds, with the 3rd round resulting in a 3,000-fold enrichment over the first one, as the binding clones became the dominant population in the library. Selected antibodies from the last round of panning were sequenced and characterized by immunoblotting. Soluble antibody fragments were produced in a non-suppressor E. coli strain, and recognized a 66-KDa sporozoite antigen on a Western blot. Primary cultures of chicken enterocytes were prepared in the hope of serving for invasion assays with E. tenella sporozoites. The isolation procedure, however, proved to be cumbersome and time-consuming. Future investigations will focus on purification and further characterization of antibodies selected from the constructed library. Such antibodies can be tested, alone or in combination, for their ability to block in vitro the invasion mechanism of E. tenella.

The growing threat of drug- resistant Staphylococcus aureus (S. aureus) infections mandates the need to develop novel, effective and alternative antibacterial therapeutics. Despite infection prevention and control measures, methicillin resistant S. aureus (MRSA)-associated deaths reached 11,285 in 2011 in the USA (CDC, 2013). To counteract the threat of drug resistant S. aureus, we sought to construct and characterize a novel therapeutic based on the display of lytic antibacterial enzymes, termed endolysins. These endolysins were displayed on the surface of a specific bacterial virus, bacteriophage (phage), to generate lytic antibacterial nanoparticles. Endolysins are encoded individually by a variety of double-stranded DNA phage and act to direct host lysis and escape. These lytic enzymes confer a high degree of host specificity that could potentially substitute for, or be combined with, antibiotics in the treatment of gram-positive drug resistant bacterial infections such as MRSA. In this study, modular domains of the phage-encoded endolysin K enzyme, specific to S. aureus, were displayed on the capsid surface of phage lambda () via fusion with the λ major head (capsid) protein, gpD. The constructs of displayed endolysins were prepared in various combinations to maximize the functional display of gpD::X fusions on the phage. Phage lysates were generated, collected and purified and lysis was investigated by adding to fresh lawns of MRSA, vancomycin resistant S. aureus (VRSA) and bovine S. aureus. Phage preparations did not readily confer cell lysis, likely due to poor incorporation of the fusions onto the functional phage capsid. We purified the fusion proteins (gpD::X) and tested them for their lytic activity. We noted that the activity of the gpD::LysK protein was not impaired by the fusion and demonstrated lysis on live and dead (autoclaved) bovine S. aureus. In contrast to gpD::LysK, the gpD::CHAP protein fusion, expressing only the CHAP catalytic domain of endolysin K showed variable results in the lysis assays that we performed. In the zymogram assay, gpD::CHAP did not elicit any observable lysis on live bovine S. aureus cells, but did effectively lyse dead cells of the same S. aureus species; however, it was highly lytic in the inhibition assay on bovine S. aureus. The CHAP::gpD protein fusion, which is the CHAP domain fused to the N terminus of gpD only showed its ability to inhibit bovine S. aureus growth on the inhibition assay. The fusion of endolysin K or its CHAP domain to gpD protein does not seem to interfere with lytic activity, but may result in recalcitrant gpD fusions that compromise the ability to efficiently decorate the phage capsid. Suggestions for improved fusion capsid integration are discussed.

Natural killer (NK)-like lymphocytes have recently been identified in thymectomised (Tx) Xenopus which are capable of spontaneous cytotoxicity towards the MHC- deficient, allogeneic thymus tumour cell line B(_3)B(_7). This Thesis describes attempts to raise antibodies to Xenopus NK cell surface antigens by phage display and hybridoma technology. The phage display technique was optimised for raising antibodies to novel, cellular antigens in a trial run using the Xenopus thymus tumour cell line B(_3)B(_7). Having isolated a phage antibody which was shown by flow cytometry to bind B(_3)B(_7) cells, the technique was then used to try and raise antibodies to Xenopus NK cells. Isolation of an NIC-specific phage antibody was not achieved but phage antibody XL-6 was raised, which bound an antigen on Xenopus lymphocytes. Phage antibody XL-6, and soluble scFv derived from this, were able to identify a putative mature T cell population in the thymus and may be specific for an amphibian homologue of the mammalian leukocyte common antigen CD45. Hybridoma technology was used to isolate three monoclonal antibodies, 1F8, 4D4 and 1G5, which were shown by flow cytometric analysis to identify a putative NK cell population in control and Tx Xenopus. Following immunomagnetic purification, 1F8- positive spleen cells from control and Tx animals were shown to kill the MHC- deficient tumour target B(_3)B(_7), confirming that this antibody was specific for Xenopus NK cells. Western blotting experiments showed that 1F8, 4D4 and 1G5 identified a doublet of protein bands at 72 and 74 kilodaltons in Xenopus gut lymphoid lysates. Initial attempts to isolate cDNA encoding a Xenopus NK cell surface antigen through immunoscreening a xenopus gut cDNA expression library with antibody 1G5 were unsuccessful as was an attempt to clone a Xenopus homologue of the mammalian NK receptor NKR-Pl by PGR.

abstract: Cyanovirin-N (CV-N) is a naturally occurring lectin originally isolated from the cyanobacteria Nostoc ellipsosporum. This 11 kDa lectin is 101 amino acids long with two binding sites, one at each end of the protein. CV-N specifically binds to terminal Manα1-2Manα motifs on the branched, high mannose Man9 and Man8 glycosylations found on enveloped viruses including Ebola, Influenza, and HIV. wt-CVN has micromolar binding to soluble Manα1-2Manα and also inhibits HIV entry at low nanomolar concentrations. CV-N's high affinity and specificity for Manα1-2Manα makes it an excellent lectin to study for its glycan-specific properties. The long-term aim of this project is to make a variety of mutant CV-Ns to specifically bind other glycan targets. Such a set of lectins may be used as screening reagents to identify biomarkers and other glycan motifs of interest. As proof of concept, a T7 phage display library was constructed using P51G-m4-CVN genes mutated at positions 41, 44, 52, 53, 56, 74, and 76 in binding Domain B. Five CV-N mutants were selected from the library and expressed in BL21(DE3) E. coli. Two of the mutants, SSDGLQQ-P51Gm4-CVN and AAGRLSK-P51Gm4-CVN, were sufficiently stable for characterization and were examined by CD, Tm, ELISA, and glycan array. Both proteins have CD minima at approximately 213 nm, indicating largely β-sheet structure, and have Tm values greater than 40°C. ELISA against gp120 and RNase B demonstrate both proteins' ability to bind high mannose glycans. To more specifically determine the binding specificity of each protein, AAGRLSK-P51Gm4-CVN, SSDGLQQ-P51Gm4-CVN, wt-CVN, and P51G-m4-CVN were sent to the Consortium for Functional Glycomics (CFG) for glycan array analysis. AAGRLSK-P51Gm4-CVN, wt-CVN, and P51G-m4-CVN, have identical specificities for high mannose glycans containing terminal Manα1-2Manα. SSDGLQQ-P51Gm4-CVN binds to terminal GlcNAcα1-4Gal motifs and a subgroup of high mannose glycans bound by P51G-m4-CVN. SSDGLQQ-wt-CVN was produced to restore anti-HIV activity and has a high nanomolar EC50 value compared to wt-CVN's low nanomolar activity. Overall, these experiments show that CV-N Domain B can be mutated and retain specificity identical to wt-CVN or acquire new glycan specificities. This first generation information can be used to produce glycan-specific lectins for a variety of applications. / Dissertation/Thesis / Ph.D. Biochemistry 2013