Le but de ce travail est de découvrir des nouvelles protéines suceptibles d'interférer avec le cycle vital du virus HIV. De par leur repliement, les protéines à motifs ankyrines peuvent constituer une ossature protéique trés bien adaptée à cet objectif. Plusieurs interacteurs spécifiques de la protéine MA-CA du HIV ont été sélectionnées par exposition sur phage à partir d'une bibliothèque de variants d'ankyrines. Trois protéines isolées ont été produites à partir de clones ayant une forte activité de liaison. Le meilleur interacteur protéique (1D4) interagit avec un épitope situié sur le domaine CA. La constante de dissociation entre 1D4 et la protéine HACA a été déterminée par Calorimétrie de Titrage Isotherme (ou ITC) et est égale à 0,45M. La protéine 1D4 n'a pas d'effet détectable sur la maturation virale suivie par une technique ELISA de dosage de la Protease du HIV. En revanche, cette protéine interfere avec l'assemblage viral dans des cellules supT1 qui exprime de façon stable la protéine 1D4 sous forme myristoylée. Ce resultat ouvre une perspective d'appoche pour interferer avec le cycle vital du HIV. / Presently, the standard regimen for antiretroviral treatment is highly active antiretroviral therapy (HAART). However, this strategy inherits the well-known side effects and is prone to promote the HIV drug-resistant strains. As a consequence, gene therapy has been introduced as an alternative approach. In this study, we aimed to discover the novel protein-based agents for intervening viral replication by gene targeting procedure. Regarding the efficient folding dynamic in cytoplasm, ankyrin repeat protein was considered to be a candidate scaffold. Several engineered ankyrin binders specific to HIV MA-CA domain were successfully retrieved from the ankyrin-displayed phage library. Three positive clones with high binding activity by ELISA were selected for further analyzing their binding property in soluble form. The best binder, 1D4, recognized its epitope located on CA domain as shown by Western immunobloting and ELISA. The affinity of 1D4 against H6MA-CA was 0.45 μM with one to two moles of target molecule determined by isothermal titration calorimetry (ITC). Although 1D4 exhibited no effect on viral maturation as verified by an ELISA based HIV protease assay technique, it disturbed the viral assembly process in Sup-T1 cells which stably expressed the myristoylated 1D4. This finding has provided a concrete prospect for HIV life cycle interruption by stem cell gene therapy in the future.

Le segment initial de l'axone (SIA) joue un rôle dans la maintenance de la polarité neuronale et dans l'initiation du potentiel d'action. Il se construit autour de l'ankyrine G (ankG) qui relie les protéines membranaires au cytosquelette d'actine et de microtubules. Cette structure est dynamiquement régulée par des kinases. S'il a été clairement établi que l'ankG est cruciale à la formation et à la maintenance du SIA, les mécanismes responsables de sa concentration dans la partie proximale de l'axone restent encore inconnus. Il en est de même pour la protéine kinase CK2 qui régule l'interaction entre l'ankG et les canaux sodiques (Nav1). Dans un premier temps, nous avons montré, par des approches de mutagénèse, que le domaine serine-rich (SR), notamment ses 73 premiers acides aminés, porte l'information nécessaire à l'entrée de l'ankG dans l'axone. Mais ce domaine n'est pas suffisant pour le confiner dans la partie proximale de l'axone, cette propriété est portée par le domaine Tail. En plus de la coopération de ces domaines, nous avons aussi observé que l'adressage de l'ankG est régulé par les kinases Cdk5 et PKC. Dans un second temps, nous avons montré que l'accumulation de la CK2 au SIA dépend de l'expression des Nav1. L'existence d'un complexe formé par les Nav1 et la CK2 serait donc importante au recrutement de la protéine kinase CK2 au SIA. En outre, le développement des anticorps phosphospécifiques nous a permis de monter que les Nav1 sont phosphorylés in vivo au niveau de leur motif de liaison à l'ankG. L'ensemble de nos résultats ouvre de nouvelles perspectives dans la compréhension de la formation du SIA et des mécanismes de régulation qui peuvent être associés. / The axon initial segment (AIS) is responsible for both the maintenance of neuronal polarity and the generation of action potentials. The scaffolding protein ankyrin G (ankG) is specifically expressed in the AIS where it links transmembrane proteins to the subjacent actin and microtubule cytosqueletons. Moreover, the AIS is dynamically regulated by kinases. Although, it has been clearly established that ankG directs AIS assembly and maintenance, the mechanisms regulating ankG proper transport and tethering remain unclear. Another AIS component, the protein kinase CK2 is also playing an important role via the phosphorylation of the ankG-binding motif (ABM) on sodium channels (Nav1) to strengthen their interaction with ankG. But, the mechanism regulating its targeting and anchoring to the AIS remain still unknown. Here, we report that the first 73 residues of the serine-rich domain are necessary for the targeting of ankG to the axon and the tail domain for the proper positioning along the proximal axon. We also observed that ankG axonal localization is modulated by post-translational modifications. Using phosphospecific antibodies and inhibition/depletion approaches, we also provide evidence that the ABM of Nav1 are phosphorylated in vivo and that CK2 accumulation at the AIS depends on Nav1 expression, with which they form tight complexes. This suggests that CK2-mediated phosphorylation participates in Nav1 clustering in vivo and that its specific localization at the AIS is dependent on Nav1 expression. Altogether, our results open new perspectives in understanding the formation of AIS and regulatory mechanisms that may be involved.

Wolbachia est une bactérie Gram(-) intracellulaire modifiant la reproduction de nombreux arthropodes. Chez l'isopode Armadillidium vulgare, la souche wVulC entraîne la féminisation des mâles. Nous avons caractérisé deux opérons vir s'exprimant dans tous les tissus hôtes et codant un système de sécrétion de type IV (T4SS) pouvant permettre d'exporter des effecteurs bactériens vers le cytoplasme de l'hôte. La comparaison des séquences et de l'organisation des gènes de 37 souches de Wolbachia a révélé la forte conservation des deux opérons vir suggérant l'importance du T4SS dans la biologie de la bactérie. Nous avons également identifié, dans le génome en cours de séquençage de wVulC, 66 gènes codant des protéines à domaines ankyrines. Ces motifs forment des sites d'interactions protéine-protéine chez les eucaryotes et sont supposés être impliqués chez Wolbachia dans l'interaction avec des protéines de l'hôte. Nous avons montré qu'une des trois copies du gène pk2 de wVulC, n'est exprimée que chez des souches féminisantes mais chez aucune des 3 souches induisant l'incompatibilité cytoplasmique chez les isopodes terrestres. Ce produit du gène pk2 pourrait être impliqué dans la féminisation de l'hôte. Toutefois, nous avons réalisé des tests d'interaction par double-hybride en levures et par la méthode CRAfT (Cre-recombinase Reporter Assay for Translocation) entre les protéines du T4SS et cinq protéines à domaines ankyrines dont Pk2 afin de savoir si ces dernières étaient sécrétées par ce système. Les résultats montrent qu'aucun des cinq produits de gènes ank testés n'est sécrété par la bactérie mais se révèlent encourageants pour identifier les effecteurs de Wolbachia.