Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram négatif ubiquitaire, pathogène opportuniste. Elle est la 3ème cause d’infections nosocomiales, notamment chez les immunodéprimés et les grands brûlés. Elle est aussi responsable de la mort de nombreux patients atteints de la mucoviscidose. Sa virulence est largement due à son aptitude à sécréter de nombreuses enzymes dégradatives et toxines, parmi lesquelles la protéine ExoU, sécrétée par le Système de Sécrétion de Type III. ExoU est une phospholipase, de la famille des « patatin-like proteins », dont l’activité est portée par une dyade catalytique Ser-Asp.Mon travail de thèse a permis d’identifier 4 homologues d’ExoU (PlpA, PlpB, PlpC et PlpD) dans le protéome de la souche PAO1 de P. aeruginosa (qui est dépourvu de cette protéine). En étudiant le mode de sécrétion de PlpD, nous avons découvert une nouvelle branche du Système de Sécrétion de Type V (SST5), le SST5d. La protéine représentant ce nouveau système possède un domaine C-terminal transporteur de type TpsB (SST5b), fusionné à un domaine N-terminal patatine sécrété dans le milieu extracellulaire (à l’image d’un autotransporteur, ou SST5a). Ce mode de sécrétion serait un mode dédié à la sécrétion de « patatin-like proteins », comme le suggèrent nos analyses phylogénétiques, à Nous avons en outre démontré que PlpD possède une activité lipase.L’autre protéine étudiée, PlpA, est également sécrétée, bien que nous n’ayons pu établir avec certitude sa voie de transport. Nous avons évalué le rôle de cette protéine lors de l’interaction de P. aeruginosa avec des cellules hôtes de type macrophages et cellules épithéliales. Nous avons observé que cette protéine confère une protection temporaire aux cellules infectées par P. aeruginosa. Ce retard semble être directement imputable à l’activité de la protéine, puisqu’il est dépendant de l’intégrité de la dyade catalytique putative de PlpA / Pseudomonas aeruginosa is an ubiquitous Gram negative bacteria, and efficient opportunistic pathogen. It is the third most common cause of nosocomial infections, most particularly within immunocompromized or burn patients. This pathogen is responsible for the death of numerous cystic fibrosis patients. Its virulence is due mainly to its capacity to secrete numerous degradative enzymes and toxins, among them, ExoU which is secreted via the Type III Secretion System. ExoU is a phospholipase of the patatin-like protein family, and its activity is based on a Ser-Asp catalytic dyad.During my thesis, we identify 4 ExoU homologs (PlpA, PlpB, PlpC, and PlpD) in the proteome of the P. aeruginosa PAO1 strain (this strain does not possess ExoU). Results obtained studying PlpD secretion led us to discover a new branch of the Type V Secretion System (T5SS), the T5dSS. PlpD is composed of a C-terminal TpsB-like transporter domain (like T5bSS), fused to a N-terminal patatin domain which is secreted into the extracellular medium (like autotransporters, or T5aSS). Our phylogenetic analysis suggests that this secretion pathway may be dedicated to the secretion of PLPs, like T5cSS, which secretes only adhesins. Moreover, we demonstrated that PlpD is a lipase.The other studied protein, PlpA, is also a secreted protein, but we still do not know which secretion system is involved in its secretion. We tested the role of PlpA during interaction of P. aeruginosa with host cells by carrying out infections of murin macrophages and epithelial cells. We observed a transitory protection of cells infected with P. aeruginosa. This protection seems to require an active PlpA protein as it is dependent on a intact catalytic dyad in this protein

La bactérie Gram négative Pseudomonas aeruginosa produit un grand nombre d’exoprotéines remplissant de multiples fonctions. Pour rejoindre la surface ou le milieu extracellulaire, ces exoprotéines doivent franchir successivement la membrane interne, le périplasme et la membrane externe. De multiples systèmes de sécrétion ont été mis en place par P.aeruginosa pour réaliser ces différentes étapes. Ainsi, les exoprotéines peuvent traverser l’enveloppe par le système le plus approprié à leur transport. Un de ces systèmes, le système de sécrétion de type II (T2SS) est présent en deux exemplaires. Ces deux T2SS, complets et fonctionnels ont été appelés Xcp (« extracellular deficient protein ») et Hxc (« Homologue toXcp »). Si les éléments constitutifs des T2SSs sont bien identifiés, leur assemblage au sein de l’enveloppe ainsi que leur mode de sécrétion sont très peu documentés. Le modèle communément admis suggère cependant l’existence d’une plateforme de membrane interne, d’un composant demembrane externe et d’un pseudopilus, qui va tel un piston, pousser les substrats au travers du pore formé par l’unique composant de membrane externe, la sécrétine. Les sécrétines formentdans la membrane externe de larges pores homo-multimériques de 12 à 14 monomères.L’adressage et l’assemblage de telles structures nécessitent en général l’implication d’une petite lipoprotéine, connue sous le nom de pilotine. A ce jour, aucune protéine de ce type n’est connue pour assister les multiples sécrétines répertoriées chez P. aeruginosa dans leur adressage à lamembrane externe. Ce travail de thèse à principalement porté sur le second T2SS de P.aeruginosa, le système Hxc. Nous avons en particulier démontré que la sécrétine du système Hxc,HxcQ ne dépendait d’aucune pilotine pour son adressage à la membrane externe et que cette sécrétine était une lipoprotéine dont l’ancre lipidique N-terminale jouait le rôle de pilotine. / The Gram negative bacteria Pseudomonas aeruginosa produces a large number of exoproteins that have multiple functions. To reach the cell surface or the extracellular medium, an exoprotein must successively cross the inner membrane, the periplasm and the outer membrane.P. aeruginosa has developed a number of secretion systems that carry out these different steps.Thus, a specific exoprotein will cross the envelope using the most suitable secretion system. Oneof these systems, the type II secretion system (T2SS), is present in two copies on the P.aeruginosa genome. Both T2SS are complete and functional, and have been named Xcp(« extracellular deficient protein ») and Hxc (« Homologue to Xcp »). While the different components that make up each T2SS have been clearly identified, their assembly in the envelopeand their mode of secretion are poorly documented. Nevertheless, the commonly acceptedworking model suggests the existence of an inner membrane platform, a component in the outer membrane, and a pseudopilus which, acting as a piston, pushes the substrate through a pore formed by the sole component of the outer membrane, the secretin. Secretins form large homomultimeric pores (12 to 14 monomers) in the outer membrane. Targeting and assembly ofsuch structures requires the involvement of a small lipoprotein known as pilotin. To date, no suchprotein is known to assist the targeting of P. aeruginosa secretins to the outer membrane. This thesis work has mainly focused on the second T2SS of P. aeruginosa, the Hxc system. One of ourmajor findings is that the outer membrane targeting of the Hxc secretin, HxcQ, does not dependon any pilotin, but that instead HxcQ is a lipoprotein with a lipid anchor that acts as a pilotin.

Bacterial pathogenesis relies on a subset of mechanisms including adhesion to various matrices, antibiotic resistance, defence and action against surrounding microorganisms, and secretion of virulence factors. Among the secretion systems, the recently identified Type VI secretion system (T6SS) has been shown to be involved in both virulence against eukaryotic cells and inter-bacterial warfare. T6SS are composed of a minimum of 13 proteins called "core components". It is believe to form a macromolecular system that spans the envelope to assemble an extracellular structure composed of the Hcp protein with a trimer of VgrG located at the tip. This model has been built following in silico and structural analyses demonstrating the link between several T6SS subunits and bacteriophage T4 baseplate and tail elements. Other T6SS subunits include membrane proteins. Using enteroaggregative Escherichia coli as a bacterial model, the aim of my work is to understand how this system assembles in the cell envelope. I recently showed that four of these membrane proteins, SciP, SciS, SciN and SciZ make contact to form a complex [1]. These four subunits are critical components of the T6SS. I then delineated the interaction network, demonstrating that SciZ interacts with SciP, and that SciS interacts with both SciP and SciN. Further characterization of these subunits showed that SciN is a lipoprotein associated with the outer membrane [2, 4], whereas SciP and SciS are inner membrane proteins anchored through a single and three transmembrane segments respectively. SciZ is a polytopic inner membrane protein carrying a peptidoglycan-binding motif within its periplasmic domain. Mutagenesis and peptidoglycan binding experiments demonstrated that SciZ anchors the T6SS to the cell wall [1, 3]. Overall, we have identified and characterized a trans-envelope complex anchored in both membrane and to the peptidoglycan layer. / Bacterial pathogenesis relies on a subset of mechanisms including adhesion to various matrices, antibiotic resistance, defence and action against surrounding microorganisms, and secretion of virulence factors. Among the secretion systems, the recently identified Type VI secretion system (T6SS) has been shown to be involved in both virulence against eukaryotic cells and inter-bacterial warfare. T6SS are composed of a minimum of 13 proteins called "core components". It is believe to form a macromolecular system that spans the envelope to assemble an extracellular structure composed of the Hcp protein with a trimer of VgrG located at the tip. This model has been built following in silico and structural analyses demonstrating the link between several T6SS subunits and bacteriophage T4 baseplate and tail elements. Other T6SS subunits include membrane proteins. Using enteroaggregative Escherichia coli as a bacterial model, the aim of my work is to understand how this system assembles in the cell envelope. I recently showed that four of these membrane proteins, SciP, SciS, SciN and SciZ make contact to form a complex [1]. These four subunits are critical components of the T6SS. I then delineated the interaction network, demonstrating that SciZ interacts with SciP, and that SciS interacts with both SciP and SciN. Further characterization of these subunits showed that SciN is a lipoprotein associated with the outer membrane [2, 4], whereas SciP and SciS are inner membrane proteins anchored through a single and three transmembrane segments respectively. SciZ is a polytopic inner membrane protein carrying a peptidoglycan-binding motif within its periplasmic domain. Mutagenesis and peptidoglycan binding experiments demonstrated that SciZ anchors the T6SS to the cell wall [1, 3]. Overall, we have identified and characterized a trans-envelope complex anchored in both membrane and to the peptidoglycan layer.

Xanthomonas fuscans subsp. fuscans (Xff) est l'un des agents responsables de la graisse commune de haricot, bactériose transmise par les semences. A partir d'une semence contaminée, cet agent pathogène colonise les parties aériennes de son hôte sur la totalité d'un cycle cultural sans enclencher de processus infectieux ; cela aboutit finalement à sa transmission à la graine. Les objectifs de cette thèse ont été d'identifier des déterminants moléculaires de Xff et de caractériser leur rôle dans trois étapes clés de la colonisation asymptomatique du haricot. Deux types de gènes candidats ont été identifiés chez Xff : des gènes induits in planta codant le système de sécrétion de type trois (SST3) et ses effecteurs, des gènes impliqués dans les processus d'adhésion aux surfaces et de formation des biofilms.Contrairement à la phyllosphère, la graine de haricot en germination et les jeunes plantules ne constituent pas des environnements limitant pour la multiplication bactérienne. L'absence d'induction de réactions de défense à cette étape laisse penser que les bactéries se comportent en saprophytes sans dialogue moléculaire avec la plante. La survie de Xff dans la phyllosphère du haricot dépend partiellement des régulateurs HrpG et HrpX du SST3 ; la colonisation active et la transmission aux graines par la voie vasculaire nécessitent quant à elle un SST3 fonctionnel. En situation incompatible non-hôte, X. campestris pv. campestris et ses mutants du SST3 survivent et se transmettent à la graine de haricot, mais peu fréquemment et avec de faibles tailles de populations. Les six adhésines identifiées chez Xff interviennent toutes lors de la colonisation de la phyllosphère ou pour la transmission à la graine de haricot par la voie vasculaire. La transmission à la graine par la voie florale est une voie plus générale, régulée seulement partiellement par HrpG et HrpX.

Pseudomonas aeruginosa est un bacille opportuniste responsable d'infections graves. Sa pathogénicité repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le système de sécrétion de type III (SSTT). Ce système est activé par le contact de la bactérie avec une cellule ou une déplétion calcique et permet l'injection de toxines directement dans le cytosol de la cellule. Différents phénotypes sont observés lors d'une infection pulmonaire dans le cas de la mucoviscidose : un phénotype inductible par le contact cellulaire ou la déplétion calcique et un autre non inductible.<br />En l'absence de mutations, cette dualité de phénotype peut être envisagée sous un aspect épigénétique.<br />A l'aide d'un outil informatique, nous avons déterminé les dynamiques possibles d'un modèle du SSTT supportant l'hypothèse de bistabilité et mis en évidence l'existence possible d'épigénèse. Grâce à cette méthode nous avons également définit les expériences permettant de tester cette hypothèse. Nous avons démontré qu'une modification épigénétique pouvait être à l'origine d'une acquisition stable de l'inductibilité du SSTT in vitro. Ce changement héréditaire de phénotype a été confirmé, in vivo, à l'aide d'un modèle d'infection pulmonaire aiguë.<br />Dans un second temps, nous avons mis en évidence une répression du SSTT à densité cellulaire élevée. Celle-ci est induite par un signal produit et sécrété par la bactérie. L'utilisation de mutants a permis de montrer que les signaux connus du quorum sensing ne sont pas impliqués dans cette répression. Ainsi, l'expression du SSTT dépend de la densité bactérienne et la répression à densité cellulaire élevée est induite par un mécanisme de type quorum sensing non connu.

Cette thèse est composée de deux parties : Le première partie rend compte de l'étude structurale de la protéine RrgA. RrgA est associée au pilus du pathogène Streptococcus pneumoniae et participe aux premières étapes de colonisation chez l'hôte en se liant à plusieurs composés de la Matrice Extra Cellulaire. Nous avons résolu la structure de cette protéine à 1.9 Å par cristallographie aux rayons-X. RrgA possède une structure allongée formée de quatre domaines alignés d'origine eucaryote et procaryote. En effet, trois domaines ayant des similarités structurales avec les IgG et le domaine Cna-B semblent servir de piédestal pour orienter et présenter le domaine fonctionnel de type Intégrine. Nous avons confirmé la formation de deux ponts isopeptidiques stabilisateurs par spectrométrie de masse. De plus, le domaine intégrine possède deux insertions particulières dont la présence pourrait être impliquée dans la reconnaissance des divers substrats par RrgA. La deuxième partie de cette thèse est axée sur l'étude structurale du complexe ATPase et de ExsB, la pilotine présumée du système de sécrétion de type III chez Pseudomonas aeruginosa, bactérie opportuniste et jouant un rôle majeur dans l'infection des patients atteints de mucoviscidose. Pour la première fois, nous avons mis au point un protocole d'expression et de purification sous forme soluble de l'ATPase PscN en complexe avec une protéine partenaire, PscL. Des cristaux de ce complexe ont été obtenus au robot du PSB. Par ailleurs, nous avons confirmé l'expression de la lipoprotéine ExsB chez P. aeruginosa que nous avons localisée au sein de la membrane externe. De plus, nous avons résolu la structure de cette protéine qui présente un nouveau repliement et qui établie les bases structurales pour l'étude des pilotines pour tous les systèmes de sécrétion de type III de la famille Ysc.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d'infections graves chez les personnes immunodéprimées, les grands brûlés et les patients atteints de la mucoviscidose. Cette pathogénicité repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le système de sécrétion de type III (SSTT).Nous avons observé une protéine précédemment identifiée, PsrA, nécessaire pour la pleine activation de l'expression du SSTT chez P. aeruginosa. Les analyses par retard de migration électrophorétique de fragments du promoteur de l'operon régulateur exsCEBA ont montré que la protéine recombinante PsrA pourrait se fixer sur celui-ci. Le mutant DpsrA a montré une diminution marquée de la sécrétion des effecteurs de type III et une faible résistance à la bactéricidie par des cellules de type phagocytaires, PLB-985. L'ensemble des résultats suggèrent que PsrA est un nouvel activateur qui est impliqué dans l'expression du SSTT en augmentant le niveau de la transcription d'exsCEBA.Dans un second temps, nous avons mis en évidence qu'un signal inhibiteur, de type quorum sensing inconnu et produit dans la phase stationnaire de la culture, peut réprimer l'expression du SSTT in vitro. L'analyse de milliers de mutants de transposition a montré que la production de ce signal dépend du tryptophane, qui est le précurseur de nombreux métabolites dont l'acide d'indole-3-acétic (IAA). IAA-Na et un autre membre de cette famille de molécules, le acide 1-naphthalenacétique (NAA-K) aux concentrations millimolaires peuvent en effet inhiber l'expression et la sécrétion du SSTT. L'identification précise de ce signal nécessite des investigations plus poussées.

Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pour sécréter divers facteurs de virulence depuis le périplasme vers le milieu extra-cellulaire. La bactérie phytopathogène Dickeya dadanti (ex. Erwinia chrysanthemi) utilise ce système, appelé Out, pour la sécrétion de pectinases responsable de la maladie de la pourriture molle chez de nombreuses plantes. Les deux composants essentiels du système Out, la protéine de membrane interne OutC et la sécrétine OutD, formant un pore dans la membrane externe, sont impliqués dans la spécificité de sécrétion. L'interaction entre OutC et OutD pourrait assurer l'intégrité structurelle et fonctionnelle du système de sécrétion en reliant les deux membranes. Nous avons entrepris une étude structure-fonction de ces deux composants afin d'identifier et caractériser leurs sites d'interaction et de mieux comprendre leurs rôles. Nous avons appliqué une approche intégrative impliquant une analyse in vivo par cystéine-scanning et pontage disulfure, une analyse in vitro par GST pull down et une analyse structurale d'OutC et OutD et de leurs interactions par RMN. Nos résultats indiquent la présence d'au moins trois sites d'interaction entre les régions périplasmiques d'OutC et d'OutD et suggèrent que ces interactions s'établissent par un mécanisme d'addition des brins β. Nous avons démontré qu'un site situé sur le domaine HR d'OutC pouvait interagir avec deux sites distincts d'OutD suggérant un mode d'interaction alternatif. La présence d'exoprotéines et/ou des composants de membrane interne du système OutE-L-M, modifie différemment l'affinité de ces trois sites d'interaction entre OutC et OutD. Nous proposons que ces interactions alternatives entre divers sites d'OutC et OutD pourraient refléter une succession d'étapes fonctionnelles lors du processus de sécrétion. Pour étudier le mécanisme d'adressage et d'assemblage de la sécrétine OutD dans la membrane externe, nous avons exploité les interactions entre OutD et deux composants auxiliaires du T2SS, la protéine de la membrane interne OutB et la lipoprotéine de la membrane externe OutS. Nous avons montré une interaction directe entre le domaine périplasmique d'OutB et le domaine N0 d'OutD. Une analyse structure-fonction du complexe OutS-OutD a révélé que la pilotine OutS interagit fortement avec 18 résidus à l'extrémité C-terminale de la sécrétine, entraînant la structuration sous forme hélicoïdale de cette région initialement non structurée. Ce travail nous permet de mieux comprendre le mécanisme d'assemblage et de fonctionnement du système de sécrétion de type II.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La pathogénicité de P. aeruginosa (P. a) repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le système de sécrétion de type III (SST3). Ce complexe multiprotéique est constitué d'une aiguille se terminant par un translocon composé des protéines PopB et PopD. En s'insérant dans les membranes plasmiques, le translocon permet le passage des exotoxines dans le cytoplasme de la cellule cible. L'induction de la synthèse et de la sécrétion des exotoxines est dépendante d'un contact entre P. a et la cellule cible. Dans ce travail, nous avons examiné l'influence de facteurs cellulaires sur l'efficacité de translocation des toxines. L'utilisation d'un système rapporteur fluorescent CCF2/β-lactamase a permis de visualiser l'injection de toxine. En parallèle, l'association des protéines du translocon avec la membrane de la cellule hôte a été évaluée par immunodétection de PopB/D après fractionnement des membranes sur gradient de sucrose. Les cellules promyelocytaires HL-60 et promonocytaires U937 sont résistantes à l'injection de toxine, bien que PopB et PopD soient associées à la membrane. Après différenciation en neutrophiles, or monocytes/macrophages, ces cellules deviennent sensibles à l'injection sans que l'on détecte de variation notable de la quantité de protéines du translocon insérées dans la membrane. Le traitement des cellules HL-60 sensibles avec un agent déplétant le cholestérol, entraine une diminution de l'injection de toxine. De plus, la protéine PopB est retrouvée dans la fraction membranaire, obtenue par purification sur gradient de sucrose, contenant le marqueur des radeaux lipidiques flotilline. Par une approche pharmacologique, nous apportons la preuve que, en plus de la composition de la membrane, des voies de signalisation intracellulaires impliquées dans la polymérisation de l'actine sont essentielles pour la formation d'un pore fonctionnel. / The pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa (P.a) implies multiple virulence factors among which the type III secretion system (T3SS). This multiprotein complex is composed of a needle through which four exotoxins are exported. The protein PopB and PopD form an oligomeric structure (translocon) at the end of the needle that inserts into the host cell membrane and translocates the exotoxins into the cytoplasm. Synthesis and toxin secretion is induced on contact with eukaryotic cell. In this work, we examined the influence of host cell elements on exotoxin translocation efficiency. The delivery of T3SS toxins was investigated using a CCF2/β-lactamase fluorescent reporter system In parallel, the association of translocon proteins with host plasma membranes was evaluated by immunodetection of PopB/D following sucrose gradient fractionation of membranes. Promyelocytic HL-60 cells and promonocytic U937 cells were found to be resistant to toxin injection even though PopB/D associated with host cell plasma membranes. Differentiation of these cells to neutrophil- or macrophage-like cells resulted in an injection-sensitive phenotype without any significant change in the level of membrane-inserted translocon proteins. Treatment of sensitive HL-60 cells with a cholesterol-depleting agent, resulted in a diminished injection of toxin. Moreover, the PopB translocator was found in the membrane fraction obtained from sucrose-gradient purifications and containing lipid-raft marker flotillin. Through a pharmacological approach, we brought evidence that, in addition to membrane composition, some general signalling pathways involved in actin polymerization may be critical for the formation of a functional pore.