Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Metallo-beta-lactamases (MBLs) are members of the metallohydrolases family and constitute a very effective resistance mechanism employed by bacteria to escape the action of most beta-lactam antibiotics. Emergence of acquired MBLs among pathogenic species represents a major clinical threat, especially since no efficient inhibitors are available. On the basis of their primary structures, these enzymes have been subdivided in three subclasses (B1, B2 and B3). The enzyme studied in this work, termed BcII, is produced by Bacillus cereus, strain 569/H/9, and is the most studied MBL so far (class B1 ; 227 a.a. ; M.W. 24960 Da). It displays a binuclear active site centre, which can bind various metal ions (e.g. Co2+ and Cd2+), although Zn2+ is the natural cofactor used for beta-lactams hydrolysis. The first part of this work was dedicated to the characterization of the equilibrium folding properties of both the apo and holo forms of BcII. We used a variety of biophysical techniques, including absorbance, circular dichroism and intrinsic fluorescence spectroscopy, nuclear magnetic resonance (NMR), and mass spectrometry (MS). Interestingly, optical measurements revealed that although the apo and dizinc species exhibit undistinguishable tertiary structural organizations, the metal-depleted enzyme shows a significant decrease in its α-helical content, presumably associated with enhanced flexibility. The holoenzyme was found to be much more stable than the zinc-depleted form. Whereas the latter unfold according to a simple two-state mechanism, unfolding of the holoenzyme was found to be non-cooperative, with the population of intermediate species showing 3D structures very similar to the native species. Besides folding studies, we investigated the process of metal binding to BcII. Zinc binding was monitored using complementary techniques, including circular dichroism in the far UV, enzymatic activity measurements, competition with a chromophoric chelator, MS and NMR. Most noticeably, MS and NMR experiments, together with catalytic activity measurements demonstrated that two zinc ions bind cooperatively to the enzyme active site (with K1/K2 ≥ 5, indicating positive cooperativity) and hence that catalysis is associated with the dizinc enzyme species only. Furthermore, competitive experiments with the chromophoric chelator Mag-Fura-2 indicated K2 < 80 nM.

Les recherches menées au cours de cette thèse visent à améliorer la qualité de prédiction des structures secondaires d'ARN avec pseudo-nœuds par l'approche thermodynamique. Elles se sont focalisées sur ses deux composantes essentielles : le modèle d'énergie libre qui paramètre les repliements de l'ARN et l'algorithme qui propose les repliements les plus vraisemblables. Bien que la question du modèle d'énergie libre soit considérée comme close à l'heure actuelle, il m'est apparu nécessaire et possible de repenser la manière dont il est calibré. Le principe de TT2NE, un nouvel algorithme de prédiction, est également exposé. Son efficacité repose sur une nouvelle classification des pseudo-nœuds à l'aide du genre, un indice topologique dont j'illustre par ailleurs la pertinence par une analyse qualitative et quantitative des bases de données disponibles. Au final, sans être arrivé au terme de tous les développements possibles des travaux engagés, les résultats obtenus sont prometteurs et améliorent l'état de l'art de ce problème.

Vers la fin des années 1990 et au début des années 2000, l’idée que l’ARN puisse interagir directement avec de petits métabolites pour contrôler l’expression de certains gènes devient de plus en plus acceptée. Des recherches menées à cette époque ont permis la découverte de plusieurs structures d’ARN hautement conservées nommées riborégulateurs. La structure de ces ARN leur permet de reconnaître spécifiquement un ligand. La reconnaissance du ligand entraîne ensuite un changement de conformation dans l’ARN responsable du contrôle de l’expression génétique. Le but de cette thèse est d’étudier la structure et les changements de conformation du riborégulateur associé au gène add liant l’adénine chez Vibrio vulnificus. Ce riborégulateur étant relativement simple, les informations recueillies lors de cette étude pourront servir à comprendre le fonctionnement de riborégulateurs plus complexes. Dans l’introduction, la découverte des riborégulateurs sera décrite en plus des caractéristiques particulières et de l’importance de ces ARN. Par la suite, quelques exemples démontrant l’importance des structures d’ARN seront abordés. Ensuite, les techniques de fluorescence utilisées pour étudier les structures d’ARN au cours de cette thèse seront présentées. Enfin, les recherches effectuées sur les riborégulateurs adénine seront détaillées afin d’aider le lecteur à bien comprendre le type de riborégulateur au centre de cette thèse. Le chapitre 1 traite du repliement de l’aptamère suite à la liaison avec l’adénine. Dans ce chapitre, il est démontré que l’aptamère peut adopter trois conformations. Une modification de la séquence de l’aptamère de type sauvage a permis d’isoler ces trois conformations. Il a ensuite été possible d’identifier les caractéristiques propres à chacun des états. Le chapitre 2 s’intéresse à une région précise du riborégulateur adénine. Dans ce chapitre, la conformation du cœur de l’aptamère est étudiée plus en profondeur. Il y est possible de constater que le repliement du cœur de l’aptamère influence l’interaction boucle-boucle en présence de magnésium et de ligand. De plus, la présence de ligand, en concentration suffisante, permet le repliement du cœur et favorise le rapprochement des tiges P2 et P3 dans un aptamère muté pour empêcher la formation de l’interaction boucle-boucle. Il semble donc que le repliement du cœur de l’aptamère influence la structure globale de l’aptamère. Finalement, les travaux présentés dans les chapitres 1 et 2 seront mis en contexte avec la littérature scientifique disponible. Cette discussion tentera de réconcilier certaines observations contradictoires. Il sera ensuite question de l’impact que les travaux présentés dans cette thèse peuvent avoir dans le domaine de l’ARN. Enfin, quelques études à réaliser en continuité avec ces travaux seront proposées.

Du fait de la complexité du repliement de l'ARN en général et des mécanismes impliqués dans ce processus, il est actuellement impossible de prédire la structure tridimensionnelle et encore moins le chemin réactionnel d'un ARN en se basant uniquement sur sa séquence primaire. Ces deux questions fondamentales doivent être adressées pour comprendre ce qui se passe dans une cellule et pouvoir un jour être capable de créer de novo des molécules d'ARN avec une structure et une activité précise. L'objectif de ce travail est de mieux comprendre les forces permettant d'obtenir une structure tridimensionnelle et les mécanismes impliqués dans le chemin réactionnel d'un ARN modèle hautement structuré: le ribozyme de l'hépatite D humaine (ribozyme HDV). L'idée est que s'il est possible de comprendre dans les moindres détails une structure complexe, ces informations pourront être utilisées pour la prédiction de structures plus simples. Premièrement, il s'agit de trouver quels sont les changements conformationnels du chemin réactionnel et dans quel ordre ils ont lieu. Une fois le chemin réactionnel connu, il devient possible de générer des mutants formant des intermédiaires stables entre chaque changement conformationnel. L'étude thermodynamique de ces mutants permet de dresser le profil énergétique du chemin réactionnel. Finalement, la modélisation permet de suivre l'évolution de la structure tertiaire et ainsi vérifier différentes hypothèses. Ensemble, ces approches ont permis de comprendre comment le ribozyme HDV atteint sa structure tridimensionnelle, quel chemin réactionnel il emprunte et quelle est l'étape limitante.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Quiconque scrute le statut de l’éloquence chez Hume ne peut se dispenser d’interroger les analyses de l’auteur dans le Traité de la nature humaine, tout en accordant une attention soutenue aux Essais moraux, politiques et littéraires, et à l’Enquête sur l’entendement humain. L’examen de la verve au sein de la philosophie humienne peut s’avérer risquée et complexe, d’autant que la fragmentation dans la manière d’aborder le sujet s’accompagne de considérations qui peuvent obscurcir plutôt qu’éclaircir la compréhension d’un certain nombre de problèmes. Le présent travail cherche à démontrer que, chez Hume, l’’éloquence peut être comprise sous le prisme d’une activité délibérée et amusante de « connaissance de soi de l’imagination (esprit), puisque celle-ci se replie sur elle-même lorsqu’elle se représente une myriade d’existences possibles. De cette manière, l’éloquence quitte son statut de pratique risquée et hasardeuse pour se faire la garante d’une propédeutique scientifique, c’est-à-dire d’une discipline d’initiation à la science humienne de l’homme. / Anyone who scrutinizes the status of eloquence in Hume cannot dismiss questioning the author's analyses in A Treatise on Human Nature, while paying close attention to the Moral, Political, and Literary Essays, and to An Inquiry Concerning Human Understanding. Examination of the verve within humian philosophy can be risky and complex, especially as the fragmentation in the approach to the subject is accompanied by considerations that may obscure rather than clarify the understanding of a number of problems. This work seeks to demonstrate that, in Hume, eloquence can be understood under the prism of a deliberate and amusing activity of “self-knowledge of the imagination (spirit)”, since it is withdrawn on itself even when it represents a myriad of possible existences. In this way, eloquence abandons its status of risky and hazardous practice to make itself the guarantor of a scientific propaedeutic endeavor, that is to say, a discipline of initiation to the humian science of man.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.