Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Afin de lever le mystère centenaire qui entoure l'origine du changement de volume associé au dépliement des protéines globulaires, nous avons constitué une collection de 10 mutants du variant hyperstable de la SNase, ∆+PHS. Chacune de ces mutations a été conçue pour créer une nouvelle cavité ou agrandir une cavité existante au sein de la protéine. Dans un premier temps, nous avons analysé comment l'environnement structural local conditionne l'adaptation à la mutation. Les expériences de fluorescence sous haute pression ont montré un accroissement systématique de la différence de volume entre les états replié et déplié pour les 10 variants par rapport à ∆+PHS. Ce résultat majeur, qui s'ajoute à une étude récente démontrant que les effets d'hydratation ne contribuent pas de manière significative au changement de volume, démontre sans ambiguïté que la différence de volume entre les états replié et déplié est principalement due à la présence de cavités internes dans la structure native des protéines. Les mesures par RMN des changements de volume ont permis d'établir une cartographie des effets de la pression à l'échelle du résidu et d'identifier les intermédiaires de repliement peuplant le paysage énergétique. En analysant les cinétiques de dépliement, nous avons finalement pu caractériser les conséquences de ces mutations sur les états de transitions de la SNase. / To solve the century-old question of the origin of the volume change upon unfolding for globular proteins, we built up a collection of 10 mutants of the hyperstable variant of SNase, ∆+PHS. Each of these mutations was designed to create a cavity or to enlarge a naturally occurring cavity in the protein core. We first analyzed how the local structural environment determines the adaptation to the mutation. The high-pressure fluorescence experiments showed a systematic increase of the volume difference between the folded and unfolded states for the 10 variants, compared to ∆+PHS. This major result, in addition to a recent study demonstrating that the hydration effects do not provide any significant contribution to the volume changes, clearly demonstrates that the volume difference between the folded and unfolded states is predominantly due to the presence of internal cavities in the native structure. NMR measurements of the volume change allowed a mapping of the pressure effects on a residue scale and the identification of the folding intermediates populating the free-energy landscape. By analyzing the unfolding kinetics, we finally characterized the consequences of these mutations on the transition state ensembles of SNase.

Le but principal de mon projet de thèse était de développer un instrument de mélange en vol de microgouttes pour jets d'encre synchronisés. Les microgouttes balistiques passent voir l'air peut être pensé comme des navires de réaction avec des volumes en bas à la pl-gamme. Les réactifs restent limités dans les microgouttes pendant leur trajectoire. Les effets de tondage induits de la présence murale ne jouent pas de rôle; bien que la compression mécanique de la solution pendant le processus d'éjection puisse influencer l'intégrité structurelle de protéines fragiles. J'ai exploré dans ma thèse pour la première fois la combinaison de microgouttes balistiques avec des techniques de microdiffusion stroboscopique. L'effort instrumental principal était donc de développer une installation stable avec deux jets d'encre pour étudier mélange de microgouttes en vol à ligne de lumière ID13, ESRF utilisant expériences de diffusion centrale et de diffraction de rayons X stroboscopique. J'ai utilisé ces techniques pour étudier la paraffine liquide en vol et des microgouttes de cytochrome C et la coalescence de microgouttes de cytochrome C avec des microgouttes de tampon de Na-acetate. J'ai également exécuté des expériences exploratoires de diffraction de rayons X à la ligne de lumière ID13 sur des microgouttes de paraffine solide déposés sur des surfaces et la diffraction dépendante de la température sur le solide de paraffine pour calibrer les données stroboscopiques. Des expériences statiques de diffusion centrale ont été exécutées à la ligne de lumière ID02 pour obtenir des courbes de la référence pour les états de conformation de solutions du cytochrome C .

Depuis quelques années, l'interférométrie radar a largement démontré son aptitude à recréer des Modèles Numériques de Terrain (MNT). Cependant, son usage reste délicat aux hautes résolutions, notamment en milieu urbain. En effet, les caractéristiques géométriques d'acquisition et les propriétés de l'onde radar créent des ambiguïtés dans le signal interférométrique. Dans un premier temps, une approche par simulation a donc été retenue, afin d'étudier l'impact des phénomènes mis en jeu, et de tester les techniques susceptibles de lever les ambiguïtés. Ainsi, les travaux sur la haute résolution radar ont mis en évidence des cas de corrélation spatiale de la phase sur des données réelles et simulées. Une proposition de modélisation du phénomène a été effectuée, et nous en avons montré les implications dans le cadre des traitements interférométriques. Nous avons ensuite étudié la possibilité d'un traitement optimal des zones de repliement pour la reconstruction du 3D sur des données simulées, grâce à des techniques de filtrage fréquentiel. Enfin, nous avons souligné l'intérêt d'une reconstruction adaptée à l'objet traité, grâce à une classification floue obtenue à partir de l'ensemble des informations extraites de l'image.

La question de savoir comment les protéines se replient dans leur propre structure tridimentionnelle offre un défi passionnant pour les biophysiciens de nos jours. L'utilisation d'un saut de température rapide est une technique très puissante pour l'étude du processus de dénaturation des protéines. Toutefois, sonder la structure secondaire est un défi difficile et on obtient rarement des valeurs quantitatives. Le but principal de ce projet de thèse est de développer une mise en œuvre technique de dichroïsme circulaire dans l'UV extrême dans une expérience de saut de température nanoseconde. Notre expérience permet de suivre quantitativement l'évolution de la fraction hélicoïdale d'un peptide poly(acide glutamique) au cours de sa dénaturation thermique avec une résolution de 12 ns de temps.

L'objet de ce travail de thèse est l'étude de la photodissociation de la carboxymyoglobine (MbCO) par dichroïsme circulaire résolu temporellement (TRCD). La myoglobine (Mb) est une protéine responsable du stockage de l'oxygène dans les muscles de l'organisme. Lorsque le complexe MbCO absorbe un photon visible, il y a photodissociation, le CO se détache et quitte la protéine. Il s'agit donc de mesurer le dichroïsme circulaire de la myoglobine juste après la photodissociation, afin de pouvoir remonter aux changements de structure ultra rapides de la protéine. D'un point de vue expérimental, la difficulté de ce travail résidait dans la maîtrise des nombreux artefacts d'une telle expérience. D'un point de vue théorique, un calcul basé sur la théorie de la polarisabilité a permis de montre! r que le CD était sensible essentiellement aux mouvements de l'histidine proximale, résidu clef dans la compréhension de l'effet allostérique. Le résultat marquant de cette étude a donc été la mise en évidence d'une dynamique temporelle de 100 ps, attribuée à un mouvement de l'histidine proximale. Une nouvelle source laser a également été développée dans le but de faire des expériences de TRCD dans l'ultraviolet. L'objectif est de pouvoir suivre à terme la dynamique de repliement des protéines. Des résultats préliminaires ont été obtenus.