Pour exprimer sa fonction biologique, une protéine doit adopter une conformation spatiale unique et très précisément définie. On parle de " repliement " vers la structure " native ". La compréhension des mécanismes accompagnant ce processus est actuellement l'un des principaux enjeux de la recherche en biophysique. Dans ce contexte, nous avons mis en place une technique originale de mesure du dichroïsme circulaire, permettant de suivre avec précision les dynamiques structurales de petites molécules chirales en phase aqueuse, sur des échelles de temps allant de la picoseconde à la nanoseconde. Appliquée dans le domaine de l'ultraviolet, elle permet d'étudier les premières étapes du repliement de structures secondaires modèles. Le principe de cette technique repose sur la mesure de l'ellipticité induite par un milieu chiral sur une onde initialement polarisée linéairement. Après avoir présenté cette nouvelle méthode, nous montrerons comment la mettre en œuvre expérimentalement. Nous la comparerons ensuite aux techniques usuelles de mesure du dichroïsme circulaire, et l'appliquerons à l'étude de trois molécules (myoglobine, [Ru(phen)3]2+, 1,1'-Binaphthol). Enfin, nous nous intéresserons aux premiers résultats expérimentaux obtenus dans le cadre de l'étude du repliement en hélices alpha de polypeptides modèles. Deux techniques d'initiation du repliement seront examinées : l'excitation optique d'un chromophore greffé à l'extrémité de la chaîne peptidique, puis l'induction optique d'un saut de température.

Je présente dans ce mémoire un bilan de mon activité scientifique effectuée au sein des groupes POC (Parallèlisation et Optimisation Combinatoire) et SID (Systèmes d'Information Distribués) de l'équipe ROI (Recherche Opérationnelle et Informatique) du laboratoire LAMIH à l'UVHC. <br /><br />Mes travaux de recherche se divisent en trois parties:<br /><br /> - l'étude du problème du sac-à-dos non borné, problème classique de l'optimisation combinatoire, dont nous mettons en évidence des propriétés fondamentales et pour lequel nous avons dérivé, implanté et mis à disposition deux algorithmes qui tirent avantage des propriétés découvertes;<br /><br /> - une approche algorithmique parallèle/distribuée pour la<br /> bio-informatique notamment le problème de repliement de protéïnes qui est un problème reconnu comme l'un des plus difficiles posés à la science informatique dans le contexte de la bio-informatique;<br /><br /> - le développement d'une plate-forme ouverte d'expérimentations pour la méthode formelle B, l'étude de la modularité du langage B et d'extensions de B pour générer des composants logiciels ainsi que l'étude de l' adjonction au langage B d'une logique temporelle.<br /> <br /> Nous montrons comment les approches utilisées dans une recherche en optimisation combinatoire d'une part et en spécification formelle d'autre part peuvent s'enrichir et se féconder mutuellement.

Les protéines sont parmi les molécules les plus importantes du monde vivant. Ce sont en quelque sorte les abeilles ouvrières de tout organisme. Elles remplissent, entre autres, des fonction enzymatiques, nerveuses, motrices ; elles transportent les petites molécules qui permettent aux cellules de fonctionner et de s'alimenter. Au cours de ce travail de thèse nous nous sommes intéressés à l'étude de différents aspects des changements conformationnels pouvant avoir lieu dans les protéines. Tous ces phénomènes ont été approchés par une méthode commune : la mesure du dichroïsme circulaire résolu en temps. En effet le dichroïsme circulaire peut donner des informations quantitatives sur la position d'un chromophore ou le repliement d'une hélice alpha ce qui est un grand avantage par rapport à d'autres mesures. Ainsi nous avons étudié l'influence du solvant sur le dépliement de l'acide polyglutamique et observé des différences dynamiques et thermodynamiques entre les polypeptides dissouts dans l'eau et ceux placés dans l'eau lourde. Nous avons, par une méthode différente, élucidé une étape clef de la relaxation du chromophore dans la protéine PYP. Enfin nous avons abordé le mouvement des hélices alpha dans la bactériorhodopsine et ouvert la porte à la possibilité de changements conformationnels non prédits par d'autres mesures. Grâce à différentes méthodes de mesure du dichroïsme circulaire nous avons pu étudier des phénomènes à des échelles de temps variant de la picoseconde à la microseconde. Nous espérons que ces méthodes pourront être étendues à l'étude d'autres mécanismes de repliement.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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Les riboswitches sont des modules structurés dans les régions 5’ (voire 3’) UTR des ARNm. Chaque riboswitch reconnaît spécifiquement un petit métabolite, ce qui provoque un changement de conformation et permet de moduler au niveau transcriptionnel ou traductionnel (voire par épissage alternatif) l’expression d’un gène impliqué dans la synthèse du métabolite.Ce travail portait sur la cinétique de repliement des domaines aptamères de deux riboswitches homologues liant la thiamine pyrophosphate (TPP), un régulant la transcription du gène thiC (E. coli) et l’autre régulant l’épissage alternatif du gène THIC (A. thaliana).La première approche utilisée (méthode cinétique classique par quenched-flow) consistait à sonder la structure des aptamères par des radicaux hydroxyles au cours du repliement initié par l’addition de TPP. Nous avons également développé (coll. avec A.Griffiths), une approche microfluidique visant à remplacer l’appareillage classique et, à terme, de le dépasser en permettant d’augmenter le nombre d’entrées pour l’étude de systèmes complexes. Nous avons aussi utilisé une méthode (kinITC) récemment développée au laboratoire qui permet d’obtenir des informations thermodynamiques et cinétiques inédites par microcalorimétrie isotherme.Nos résultats ont montré que l’aptamère bactérien se replie beaucoup plus vite que celui d’A. thaliana. Cependant, l’aptamère d’A. thaliana étudié dérivait de la forme sauvage (raccourcissement de l’hélice P3). Par comparaison avec d’autres travaux récents, nos résultats soulignent le rôle fondamental de P3 dans la cinétique de repliement. La méthode kinITC a aussi mis en évidence que le régime cinétique du fonctionnement global du riboswitch de E. coli n’est pas contradictoire avec une première étape de fixation du TPP sous régime thermodynamique.Les résultats obtenus avec la nouvelle méthode de microfluidique sont mitigés. Si nous avons pu reproduire le schéma de coupure de l’ARN lié au TPP obtenu par sondage chimique classique (valide ainsi la première étape de ce développement), la cinétique de repliement observée est plus rapide sans que nous en ayons pour le moment une explication satisfaisante. / Riboswitches are RNA modules found in the 5’-UTR of bacterial mRNA where they control gene expression at the transcriptional or translational level. They are occasionally found in the 3’-UTR where they control alternative splicing. Each riboswitch-controlled gene is involved in the biosynthetic pathway of a metabolite and a feedback loop is ensured by the specific binding of the metabolite.To study the folding kinetics of TPP-binding riboswitch aptamer domains from E.coli (regulating transcription of thiC) and from A. thaliana, (regulating alternative splicing of THIC) two different approaches were used. First, each aptamer structure was probed by hydroxyl radical footprinting during RNA folding triggered by TPP . We also developed (coll. with A. Griffiths) a microfluidic approach aimed at replacing the classical quenched-flow apparatus and, eventually, superseding it by giving access to more entries. We also used a method recently developed in our lab (kinITC), which gives access to rich kinetic and thermodynamic information from isothermal titration calorimetry.Our results showed that the E. coli aptamer folds much faster than its A. thaliana counterpart. However, the form that we used for the latter had a helix P3 shorter than that of the wt and, when compared with recent results, our results highlight the fundamental role of this helix in the kinetics of folding. It was also clear that, globally, the E. coli riboswitch is kinetically controlled but the kinITC method allowed us to show that this is not in contradiction with a thermodynamic control of the first TPP binding step.The results obtained with the microfluidic device are mitigated. We were indeed able to make the proof of concept of hydroxyl RNA probing on a microfluidic chip, but the kinetics of RNA folding appeared to be faster than that observed with the quenched flow. We are not yet able to propose an explanation for this strange fact.

Chez la bactérie Escherichia coli, SecB appartient au réseau de chaperons moléculaires qui assistent le repliement et l'adressage des protéines nouvellement synthétisées. SecB est connu pour faciliter l'export en interagissant avec les pré-protéines sous forme non-native et les adressant au translocon Sec via une interaction directe avec le moteur ATPase SecA. SecB possède aussi une activité de chaperon générique et est capable d'assister le repliement de certaines protéines cytosoliques en absence des chaperons majeurs DnaK et Trigger factor. Alors que le translocon Sec est universellement conservé, le chaperon SecB est retrouvé principalement chez les protéobactéries. Cependant, de plus en plus de séquences de type SecB sont retrouvées dans d'autres groupes de la taxonomie bactérienne, comme par exemple chez le pathogène humain majeur Mycobacterium tuberculosis. Chez cette bactérie, une séquence de type SecB appelée Rv1957 est présente en association avec un système toxine-antitoxin (TA) appartenant à la famille HigBA. Généralement, les TA sont des systèmes à deux composants qui modulent la croissance en réponse à des conditions de stress spécifiques, favorisant ainsi l'adaptation et la persistance. Dans le cas de ce système atypique toxine-antitoxine-chaperon (TAC), Rv1957 interagit avec l'antitoxine HigA et la protège à la fois de l'agrégation et de la dégradation, et est donc strictement requis pour permettre l'inactivation de la toxine par l'antitoxine. La première partie de ce travail avait pour but de reconstruire l'histoire évolutive de ce nouveau système TAC. Pour cela nous avons procédé à une recherche de systèmes similaires dans l'ensemble des génomes disponibles qui a révélé que la présence de systèmes TAC n'est pas limitée aux mycobactéries et que ces systèmes semblent s'être répandus dans la taxonomie par le biais de transferts horizontaux de gènes. Nos résultats suggèrent que les chaperons des systèmes TAC sont évolutivement apparentés au chaperon d'export solitaire SecB et ont divergé pour devenir spécialisés vis-à-vis de leurs antitoxines partenaires. Nous avons ensuite étudié ce phénomène de spécialisation par une approche d'évolution dirigée du chaperon d'export SecB d'E. coli. Nous avons mis en évidence que des substitutions uniques dans SecB sont suffisantes pour améliorer sa capacité à contrôler spécifiquement HigBA du système TAC, et que ces mutations résultaient généralement en une meilleure interaction avec l'antitoxine HigA. Remarquablement, environ la moitié des mutants identifiés sont affectés dans leur activité de chaperon générique en l'absence des chaperons DnaK et Trigger factor, suggérant un conflit entre spécialisation du chaperon et ses fonctions génériques. La plupart des résidus identifiés se trouvent dans une région de SecB non caractérisée et proche du site proposé d'interaction avec le substrat. Des expériences de cross-link à des positions spécifiques ont révélé que cette région interagit directement avec l'antitoxine HigA. Enfin, nous avons montré que HigA est capable d'entrer en compétition avec la fonction d'export d'un SecB spécialisé plus efficacement que pour la version sauvage de SecB, illustrant la potentielle connexion entre les fonctions de type SecB dans l'export et le contrôle d'un système TA. / SecB is part of the intricate network of chaperones that assist folding and targeting of newly synthesized polypeptides in Escherichia coli. SecB is known to interact with nonnative precursor proteins and address them to the Sec translocon via direct interaction with the SecA motor component, thus facilitating their export. SecB is also able to act as a generic chaperone, by assisting the folding of certain cytosolic proteins when the major DnaK/Trigger Factor chaperone pathway is disrupted. While the Sec translocon is universally conserved, the SecB chaperone is mainly found in proteobacteria. However, an increasing number of SecB-like sequences have been found in unusual groups of bacteria and especially in the major human pathogen Mycobacterium tuberculosis. In this bacterium, a SecB-like sequence, Rv1957, is present in association with a toxin-antitoxin (TA) system belonging to the HigBA family. Usually, TA modules are two-component systems that modulate growth in response to specific stress conditions, thus promoting adaptation and persistence. In the case of this atypical toxin-antitoxin-chaperone (TAC) system, Rv1957 interacts with the HigA antitoxin and protects it from both aggregation and degradation, and is thus strictly required for neutralization of the toxin by the antitoxin. The first aim of this work was to reconstruct the evolutionary history of the newly discovered TAC system. We performed a large-scale genome screening and found that TAC is not restricted to mycobacteria and seems to have disseminated in the taxonomy by horizontal gene transfer. Our results suggest that TAC chaperones are evolutionarily related to the solitary export chaperone SecB and have diverged to become specialized towards their cognate antitoxins. Next, we investigated such chaperone specialization event through directed evolution of the E. coli export chaperone SecB. We found that single amino-acid substitutions within SecB were sufficient to improve its ability to specifically control HigBA from TAC, and that these mutations mainly resulted in an increased binding to the HigA antitoxin. Strikingly, about half of the mutants identified were affected in their ability to perform SecB generic chaperone functions in the absence of both DnaK and TF chaperones, suggesting a conflict between specialization and generic chaperone functions. Most of the residues identified are located within a previously uncharacterized region of SecB which is close to the proposed substrate binding site. Further in vitro site-specific cross-linking experiments revealed that this region directly interacts with the HigA antitoxin. Finally, we show that the HigA antitoxin can compete with the export function of specialized SecB more efficiently than it does with wild type SecB, thus illustrating the potential interplay between SecB-like chaperone export functions and TA activation.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.