Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les virus Nipah (NiV) et Hendra (HeV) appartiennent au genre Henipavirus au sein de la famille des Paramyxoviridae. Cette famille comporte de nombreux pathogènes tel que le virus de la rougeole (MeV). Les paramyxovirus possèdent un génome de type ARN simple brin encapsidé par la nucléoprotéine (N) au sein d'une nucléocapside hélicoïdale. N interagit avec la phosphoprotéine (P) et cette dernière recrute la polymérase (L) qui assure la transcription et la réplication du génome viral. L'objectif de mon projet de thèse était de caractériser les protéines N et P ainsi que les interactions qui existent entre elles chez les trois virus, NiV, HeV et MeV. A la différence du MeV, qui a été intensivement étudié au cours des dernières années, les données moléculaires et structurales sur les Henipavirus étaient très limitées. A l'aide d'analyses computationnelles, nous avons pu déchiffrer l'organisation modulaire de N et de P, et nous avons montré que les régions, C-terminale de N (NTAIL) et N-terminale de P (PNT), sont prédites comme intrinsèquement désordonnées (RIDs). Les RIDs sont des régions fonctionnelles dépourvues de structures secondaires et tertiaires stables dans des conditions physiologiques. En utilisant des approches biochimiques et biophysiques, nous avons confirmé que NTAIL et PNT sont désordonnées. Elles conservent toutefois des structures secondaires transitoires qui pourraient correspondre à des éléments de reconnaissance moléculaire (ou MoREs) impliqués dans de transitions structurales en présence d'un partenaire. / The Paramyxoviridae family includes many important human and animal pathogens, such as measles virus (MeV), a morbillivirus, and the emerging Nipah (NiV) and Hendra (HeV) viruses, members of the Henipavirus genus. Paramyxoviruses possess a negative-strand RNA genome that is encapsidated by the nucleoprotein (N) into a helical nucleocapsid. N interacts with the phosphoprotein (P), and this latter recruits the polymerase that ensures genome replication and transcription. My PhD project has mainly focused on the characterization of the N and P proteins and on the interactions between these two proteins from the three cognate viruses, namely NiV, HeV and MeV. While MeV has been extensively studied through the past years, structural and molecular information on Henipavirus N and P proteins were rather scarce. Using computational analyses, we deciphered the modular organization of Henipavirus N and P. Intrinsically disordered regions (IDRs) were predicted within these proteins, notably at the C-terminus of N (referred to as NTAIL), and at the N-terminus of P (referred to as PNT). IDRs are functional despite they lack of a well-defined 3-D structure under physiological conditions. Biochemical and biophysical approaches pointed out a mostly disordered state for both NTAIL and PNT, although they were shown to contain short-order prone segments (i.e. molecular recognition elements, MoREs). These latter are involved in partner recognition and in disorder-to-order transitions. The C-terminal domains of the P proteins (referred to as PXD) were found to bind to NTAIL and to induce an α-helical transition thereof.

Les nanocavités à cristal photonique ont été largement étudiées au cours de la dernière décennie du fait de leur aptitude à fortement confiner la lumière (faible volume modal) et de leurs faibles pertes optiques (grand facteur de qualité). Parmi le grand nombre de géométries proposées, nous nous intéressons ici au cas de la cavité L3 étudiée par Noda et al. (trois trous manquants dans la direction K du réseau triangulaire sous-jacent) utilisée dans plusieurs applications et notamment pour la réalisation de nano-lasers et d’interrupteurs optiques. Cependant, l’injection ou l’extraction de lumière dans de telles nanocavités s’avère extrêmement difficile du fait de la diffraction importante dont souffrent ces structures. Différentes approches en champ proche ont été récemment développées et notamment le couplage évanescent utilisant des guides d’onde nanostructurés ou des fibres optiques étirées. Dans le but de pallier à la faible efficacité de couplage à l’espace libre, nous développons une conception récemment proposée par De Rossi et al. afin de changer radicalement le profil du diagramme de rayonnement. Cette approche utilise la méthode de repliement des bandes qui consiste à introduire au sein d’un réseau triangulaire de période (a), un sous-réseau de trous de période (2a) qui améliore considérablement l’efficacité de couplage dans la direction verticale. Bien que certaines mesures de l’efficacité de collection et du coefficient de qualité aient déjà été mentionnées dans la littérature, aucune mesure directe des diagrammes de rayonnement de ces nanocavités n’a été réalisée jusqu’alors. Nous étudions dans ce travail différents types de nanocavités et de molécules L3 à cristaux photoniques présentant des profils de champ lointain optimisés. Les diagrammes de rayonnement de cavités non-repliées et repliées incorporées dans des membranes actives suspendues en InP sont systématiquement mesurés et comparés. Un bon accord entre les simulations numériques et les diagrammes de champ lointain mesurés expérimentalement est obtenu, montrant des lobes d’émission très directionnels le long de la normale à l’échantillon. En outre, des expériences de couplage à l’espace libre ont été réalisées montrant des efficacités de couplage d’environ 15% pour des coefficients de qualité supérieurs à 10 000. Ces résultats valident ainsi la technique de repliement des bandes dans les cavités L3 qui, une fois repliées, conservent un faible volume modal et un coefficient de qualité élevé ainsi qu’une grande efficacité de couplage à l’espace libre, à la fois dans les configurations nanocavité unique et nanocavités couplés. Nous montrons aussi expérimentalement que l’écart spectral inter-modal dans deux cavités L3 couplées de manière évanescente peut être contrôlé grâce à l’ingénierie de la barrière photonique. La « barrière de potentiel » est formée par les trous d’air séparant les deux cavités. L’écart en fréquence entre les modes peut être fortement réduit et augmentée via une diminution ou une augmentation du rayon des trous de la rangée centrale de la barrière jusqu’à ∼ −30% ou ∼ 30% de sa valeur initiale. En outre, le signe de la l’écart spectral entre les modes peut être inversé de telle sorte que le mode fondamental peut être soit symétrique ou anti-symétrique et ce, sans modifier ni la géométrie de la cavité, ni la distance inter-cavité. / Photonic crystal (PhC) nanocavities have been intensively investigated during the last decade due to their capabilities of achieving tight light confinement and low optical losses simultaneously. Among the different geometries, the cavity proposed by Noda et al., namely a L3 cavity (three holes missing in the K direction of the underlying triangular lattice) with shifted end-holes has been widely used in several applications including laser emission and switching devices. However, input/output free space light coupling of such nanocavities is quite challenging. In this regard, near field coupling schemes have been recently developed, such as evanescent coupling using tapered optical fibers. In order to overcome the poor free space coupling, a new cavity design has been recently proposed by De Rossi et al. that totally changes the radiation pattern. This is based on a band folding approach introducing a modulation of the holes size at twice the period of the underlying PhC, which considerably increases the coupling efficiency in the vertical direction. While some measurements of the Q-factor and coupling efficiency were performed, no direct characterization of the far-field of such cavities has been performed so far. In this work we have studied different types of L3 photonic crystal cavities and L3 photonic molecules with optimized far-field profiles. Radiation patterns from « folded » and « unfolded » cavities incorporated in suspended InP active membranes were systematically measured and compared. Good agreement between simulations and experimental far-field patterns has been found, demonstrating highly directional emission lobes along the sample normal. Furthermore, free space input coupling experiments have been performed showing coupling efficiency of about 15% of contrast with quality factors exceeding 10 000. These results validate the « folded » L3 cavities as good candidates for small volume and high Q cavities with efficient free space coupling, either in single or coupled cavity configurations. We also experimentally show that the mode splitting in two-evanescently coupled Photonic Crystal L3 cavities can be controlled through photonic barrier engineering. The « potential barrier » is formed by the air-holes in between the two cavities. By changing the hole radius of the central row in the barrier up to ∼ 30% or down to ∼ −30% , the frequency splitting can be strongly increased or reduced. Moreover, the sign of the splitting can be reversed in such a way that the fundamental mode can be either the symmetric or the anti-symmetric one without altering neither the cavity geometry nor the inter-cavity distance.

Nous avons étudié le couplage dépliement-transport de la Maltose Binding Protein (MBP ou MalE), une protéine périplasmique d'E. Coli et d'un mutant instable, le MalE219, en fonction de la concentration d'un agent dénaturant, le chlorure de guanidium (GdnHCl) à l'échelle de la molécule unique. La technique utilisée est basée sur la détection électrique du transport de macromolécules à travers un nanopore protéique (l'Aérolysine d'Aeromonas Hydrophila) inséré dans une bicouche lipidique plane. Les résultats obtenus ont été comparés à ceux obtenus lors d'une précédente étude réalisée à travers un autre nanopore protéique, l'alpha-hémolysine du Staphylocoque doré, de géométrie et de charge nette différente. Nous avons montré l'existence de temps courts et longs de blocage du courant associés à des protéines dépliées ou partiellement repliées. La fréquence des blocages du courant permet d'obtenir la fraction de protéine dépliée passant à travers le pore en fonction de la concentration en GdnHCl. Les courbes de dénaturation obtenues avec les deux pores montrent un comportement sigmoïdale très similaire. Le type de pore n'influence donc pas la dénaturation des protéines, mais uniquement leur dynamique de transport. En revanche, la courbe de dénaturation du mutant instable présente un déplacement vers les concentrations plus faibles en GdnHCl. Il a été montré également que la présence du maltose comme ligand sur le MalE219 stabilise nettement sa structure. Pour La MBP, les temps de blocages longs diminuent avec l'augmentation de la concentration de GdnHCl montrant une dynamique de transition vitreuse . Cette technique est appropriée à l'étude du dépliement et des changements de conformation de protéines, mais ne permet pas d'obtenir des informations structurales sur les états intermédiaires de repliement. Ainsi, la spectroscopie RMN a été utilisée pour tenter de caractériser ces états intermédiaires de repliement, notamment par la méthode d'échange proton-deutérium. Elle consiste à suivre les cinétiques d'échange des résidus de la protéine sur des spectres 2D 1H-15N HSQC à différentes concentrations de GdnHCl.Ainsi 180 résidus sur les 370 que compte la MBP ont été suivis lors de la dénaturation en présence de GdnHCl. Les deux hélices en C-terminal sont très accessibles au solvant et se dénaturent facilement. La MBP est composée de deux domaines globulaires, le domaine N-ter et le domaine C-ter. Les éléments de structures secondaires situés dans la zone intermédiaire entre les deux domaines (principalement des brins β) sont particulièrement affectés par l'agent dénaturant. D'autres structures secondaires dans les domaines globulaires sont très protégées et plutôt stables. Il est donc proposé que les protéines partiellement dépliées s'insèrent dans le pore par l'extrémité C-terminal et que des parties de structuration tertiaire restent stable entraînant le blocage du pore. / We study the unfolding-transport mechanism of the Maltose Binding Protein (MBP or MalE), a periplasm protein of E. Coli and a destabilised variant, the MalE219, as the function of the concentration of denaturing agent, Guanidine Hydrochloride(GdnHCl) at the single molecule level. The technique is based on the electrical detection of the macromolecule transport through a nanometer-scale channel, Aerolysin channel, inserted into a planar lipid bilayer. Results obtained were compared to previous data with another channel, the alpha-Hemolysin. Both channels have different geometry and net charge.We show that we can distinguish unfolded states from partially folded ones with aerolysin pore.Unfolded proteins induce short current blockades, their duration is constant as a function of the concentration of denaturing agent. Partially folded proteins exhibit long blockades whose life times decrease as the concentration of GdnHCl increase, this indicates a possible glassy dynamics.The frequency of the short current blockades increases as the concentration of denaturing agent increases, following a sigmoidal denaturation curve.The unfolding curve of native MBP with Aerolysin pore is similar to the one previously measured with Hemolysin channel. The denaturation curve of the destabilized variant obtained with Aerolysin is shifted towards lower value of GdnHCl concentration in agreement with bulk measurements. We show also that the addition of maltose stabilizes the structure of MalE219. This nanopore recording technique is also suitable for the study of unfolding and conformation changes of proteins.In order to obtain structural informations that nanopore recording cannot provides, the structure of MBP along its denaturation curve was studied by NMR spectroscopy. The Hydrogen-exchange method known to be sensitive to folding intermediates was specially used. It consists in tracking hydrogen-deuterium exchange rates for amino on the 2D 1H-15N HSQC spectra.Thus, 180 residus of 370 for MBP was followed during denaturation in the presence of GdnHCl. The two last helices in C-terminal of MBP are accessible to the solvent and are denaturated easily. MBP is a two domains protein, N-ter domain and C-ter domain. It was found out that the C- and D-domain of MBP (mainly alpha-helices) could be relatively stable in presence of denaturing agent and that beta strands which make the link between the two domains would be affected by the denaturing agent. It was proposed that partially unfolded proteins enter the pore by the C-terminal end and that stable tertiary structure still present block the pore.

Les protéines sont des objets biologiques conçus pour résister aux perturbations et, àen même temps, s'adapter à des nouveaux environnements et des nouveaux besoins. Que sont lespropriétés structurelles des protéines permettant une telle plasticité? Pour taclercette question, nous modélisons d'abord la structure des protéines comme un réseau d'acides aminés et atomes en interaction. Compte tenu de la conformation structurelle 3Dd'une mutation obtenue In Silico, une approche réseaupermet la quantification de son changement structurel. En utilisant des grands ensemblesde mutations, nous avons conclu que le changement structurel est indépendant du type d'acide aminé remplacé ou du remplacement après mutation. En regardantà la composition des voisinages d'acides aminés, nous avons remarqué que lela localisation d'un type d'acide aminé dans la structure 3D est arbitraire:ce qui signifie que les contraintes d'interactions d'acides aminés dans une protéinemontre être indépendantes de la position de l'acide aminé en question. Menant à laobservation que la position de l'acide aminé dans la séquence est lapropriété unique modulant la plasticité structurelle.Le fait que les acides aminés peuvent se remplacer les uns les autres danstoutes les positions parce que la contrainte d'interaction ne dépend pas dutype d'acide aminé,est basé sur la personnalisation des voisins viamutations altérnatives compensatoires. Même s'il y a une grandetolérance pour les mutations basée sur la robustesse structurelle, les mutations peuvent avoir un impact surla plasticité structurelle en raison de la modification de la force des interactions êntre acides aminéset la distribution des atomes et des voisins entourant les résidus.La conséquence directe d'une telle variabilité de l'emballage atomique,est dû à une différence de vide (espace vide,pas d'atomes) sur la surface des résidus identifiés par certaines de mes données / résultats.Cela soulève la possibilité que la plasticité structurelle n'est pas seulementrégulée par les acides aminés et les contacts atomiques, mais aussi en sculptantdes vides locales dans la structure de la protéine pour permettre des mouvements atomiquesnécessaires pour la fonction de la protéine. Enfin, pour tester cette hypothèse, nous avonsmis en œuvre trois algorithmes pour mesurer l'espace vide autour desacides aminés pour regarder la relation entre cet espace vide et la plasticité structurelle. / Proteins are biological objects made to resist perturbations and, atthe same time, adapt to new environments and new needs. What are thestructural properties of proteins allowing such plasticity? To tacklethis question we first model protein structure as a network of aminoacids and atoms in interaction. Given the 3D structural conformationof a mutation obtained In Silico, a network approachallows the quantification of its structural change. Using large setsof mutations, we concluded that structural change is independent fromthe type of amino acid replaced, or replacing after mutation. Lookingat the composition of amino acid neighborhoods, we noticed that thelocation of a type of amino acid in the 3D structure is arbitrary:meaning that constraints of amino acid interactions in a proteinshow to be position independent. Leading to theobservation that the position of the amino acid in the sequence is thesingle property modulating structural plasticity.The fact that amino acids can replace each other atany position because the interaction constraint is not dependent on thetype of amino acid,is based on the customization of neighbors via alternative amino acidmutations or compensatory mutations. Even if there is a large mutationtolerance based on structural robustness, mutations can have an impact onthe structural plasticity because of the change in strength of pairwsie interactionsand the distribution of atoms and neihgbors surrounding residues.The direct consequence of such a variable atomic packingdistribution, is a difference of void (empty space,no atoms) on the surface of residues as identified by some of my data/results.This raises the possibility that structural plasticity is not onlyregulated by amino acid and atomic contacts but also by carving localvoids within the protein structure to allow atomic motionsrequired for the function of the protein. Finally, to test this hypothesis, we haveimplemented three algorithms to measure the empty space around aminoacids to look at the relation between this empty space and structural plasticity.

Nous avons développé un algorithme de prédiction des résidus impliqués dans le noyau du repliement par des approches couplées. La prédiction des Most Interacting Residues (MIR) est associée aux méthodes d'analyse structurale par fragments, les Tightened End Fragments (TEF) et d'alignement multiple. Cet algorithme a été développé sur une banque de protéines à faible identité en séquence appartenant à une famille bien documentée, les immunoglobulines. Les résultats obtenus sont comparés à ceux produits par d'autres techniques similaires, mais aussi à ceux provenant d'études expérimentales. Comme résultat nous avons pu voir qu'il existe une bonne corrélation entre les résidus prédits par notre méthode et les données expérimentales. Dans une deuxième partie, nous avons généré une banque de multimères biologiques dans le but de développer un outil de prédiction de la structure quaternaire. La banque est validée par le programme DiMoVo utilisant la représentation des protéines par tesselation de Voronoï. Afin d'analyser les modes d'interaction entre domaines, les différents complexes ont été découpés en fragments par la méthode des Tightened End Fragments. Nous avons développé un algorithme permettant d'inclure chaque fragment dans un cylindre, afin de pouvoir caractériser le fragment par une hauteur et un rayon. Ces fragments ont ensuite été classés sur ces critères structuraux et les interactions de différentes classes de fragments au sein des interfaces protéines-protéines ont été comptabilisées. On observe que les classes ne sont pas utilisées de façon homogène dans les interactions protéines-protéines.

Le repliement des protéines est un des problèmes centraux de la biologie. Il s'agit de comprendre comment la chaîne polypeptidique d'une protéine se replie pour acquérir sa structure tridimensionnelle biologiquement active. Il a été démontré dans les années 60 que la forme repliée de la protéine est le plus stable d'un point de vue thermodynamique et qu'il est défini par la structure primaire. La réaction de repliement correspond ainsi à la dernière étape de l'utilisation de l'information contenue dans l'ADN. Cependant, Il est possible que les protéines se replient mal et interagissent entre elles pour former des fibres amyloïdes. Ce sont des agrégats structurés impliqués dans plusieurs maladies comme la maladie d'Alzheimer, de Parkinson... <br>Ces phénomènes sont étudiés ici dans le cas de l'alpha-lactalbumine, une protéine du lait qui possède un site de liaison pour le calcium. Le repliement est tout d'abord étudié en présence de métaux se liant au site du calcium. Ces expériences sont couplées à des expériences de dénaturation thermiques pour caractériser le rôle de la fixation des métaux sur les différents états de la protéine et son influence sur la cinétique de repliement.<br>La réaction est ensuite caractérisée en absence d'ion métallique. Elle est alors beaucoup plus lente et complexe. Différentes techniques spectroscopiques sont utilisées. Les résultats obtenus permettent de proposer un schéma réactionnel selon lequel un état précurseur de fibres amyloïdes est transitoirement peuplé. Enfin, pour compléter cette étude, les effets des interactions entre protéines sur la formation de fibres amyloïdes ont été étudiés pour différentes concentrations en sel.

L'étude de nombreux processus biologiques et nanotechnologiques requièrent une bonne compréhension du repliement et de la dénaturation des acides nucléiques. Les travaux décrits dans cette thèse portent principalement sur le développement et l'utilisation de modèles thermodynamiques de ces mécanismes. Nous avons tout d'abord mis en place un formalisme unifié du modèle de Poland-Scheraga qui permet de décrire la dénaturation thermique de l'ADN quelque soit la taille des molécules considérées, leur concentration et leur environnement ionique. Nous utilisons ce modèle pour décrire quelques aspects génériques de la dénaturation. En particulier, nous montrons que le comportement des observables est particulièrement sensible à l'incertitude sur les paramètres du modèle pour les longs oligomères. Nous considérons ensuite le modèle de Zimm-Bragg qui est une approximation du modèle précédent. Cela nous permet de procéder à une analyse statistique systématique des corrélations entre domaines thermodynamiquement stables et gènes dans les génomes. Nous avons ensuite développé un modèle sur réseau du repliement de l'ARN paramétré à l'aide d'une version réduite et unifiée du modèle de Turner. L'étude du modèle sur réseau, grâce à la mise en place de plusieurs techniques avancées de Monte-Carlo, montre qu'il décrit quantitativement le repliement de structures complexes. Nous évaluons aussi l'importance des interactions stériques. En particulier, nous estimons des corrections de champ moyen utilisables dans les programmes standard traitant la structure secondaire. Enfin, nous exploitons l'aspect tridimensionnelle du modèle, pour étudier l'effet d'un confinement géométrique.

ABCB4 est un transporteur ABC spécialisé dans la sécrétion de phosphatidylcholine au niveau de la membrane canaliculaire des hépatocytes. Des variations du gène ABCB4 sont responsables de la cholestase intrahépatique familiale progressive de type 3 (PFIC3), une maladie rare, létale, qui progresse en cirrhose et insuffisance hépatique avant l'âge adulte. Nous avons étudié l'effet de la mutation I541F décrite chez un patient. Contrairement à la forme sauvage d'ABCB4 localisée à la membrane des canalicules biliaires dans les cellules HepG2 et à la surface apicale dans les cellules MDCK transfectées, le mutant I541F n'est pas replié correctement et s'accumule dans le réticulum endoplasmique (RE). Après transfert à 27°C, le mutant est exprimé à la surface apicale sous forme mature et active. La modulation des chaperonnes cellulaires calnexine et Hsc/Hsp70 ne restaure pas le trafic intracellulaire du mutant. La cyclosporine A augmente la maturation et l'expression à la membrane plasmique d'ABCB4-I541F, ce qui ouvre des perspectives de développer de nouvelles thérapies pour le traitement de la PFIC3. La seconde partie du travail a eu pour objectif de déterminer le rôle du domaine cytoplasmique N-terminal d'ABCB4, qui n'a pas d'homologie avec d'autres transporteurs ABC. Des délétions progressives de ce domaine ont permis d'identifier une séquence de 11 acides aminés nécessaire à la sortie du RE. Des mutations ponctuelles (T34M et R47G) identifiées chez des patients n'affectent pas la maturation ni le trafic, mais diminuent fortement l'activité d'ABCB4. Ces résultats montrent que le domaine N-terminal est nécessaire à la fois pour le trafic et l'activité d'ABCB4

Le système de sécrétion de type III est présent chez plusieurs pathogènes à Gram négatif chez qui cette véritable nanomachine est impliquée dans le transport de molécules de virulence directement des bactéries vers le cytoplasme des cellules-cible. Pseudomonas aeruginosa, bactérie dont l'aiguille de sécrétion de type III est étudiée dans cette thèse, est responsable de nombreuses maladies nosocomiales ainsi que d'infections chez les patients atteints de mucoviscidose. Ce système de sécrétion est composé d'une base ancrée dans la double membrane bactérienne et d'une structure creuse en forme d'aiguille qui est un homopolymère d'une petite protéine.<br /><br />Dans le cytoplasme bactérien, la protéine PscF qui forme l'aiguille de type III chez P. aeruginosa est stabilisée avant sa sécrétion par 2 chaperonnes distinctes; PscE et PscG. Ceci est nécessaire à la fonctionnalité du système de sécrétion de type III.<br /><br />La structure cristallographique à 2.0A de résolution du complexe hétérotrimérique PscE:PscF55-85-PscG révèle que le domaine C-terminal de la protéine de l'aiguille PscF, impliqué dans le processus de polymérisation, est enfoui dans une cavité hydrophobe de la protéine PscG repliée de façon semblable à un domaine TPR. Ceci montre que le repliement macromoléculaire nécessaire pour stabiliser la protéine de l'aiguille de type III est différent de celui décrit chez le pilus de type IV et le flagelle. Les résidus qui précèdent l'hélice C-terminale de PscF sont maintenus dépliés par des interactions hydrophobes avec PscG. Ainsi, avant sa sécrétion, PscF est maintenue partiellement dépliée par ses chaperonnes. Elle transiterait ensuite sous forme partiellement dépliée à travers l'aiguille avant de se replier lors de sa polymérisation.<br /><br />La rupture des interactions spécifiques entre PscG et PscF entraîne une nette baisse de la cytotoxicité de la bactérie envers une lignée de macrophages, ce qui indique que cet hétérotrimère essentiel, qui possède des homologues chez une grande variété de pathogènes, est une cible thérapeutique attractive pour le développement de nouveaux médicaments.