L'oxydation des résidus cystéines est une modification biochimique très répandue survenant dans tous les compartiments des cellules eucaryotes. Ce phénomène sert le repliement oxydatif des protéines dans le réticulum endoplasmique (RE), l'importation de protéines dans l'espace intermembranaire de la mitochondrie (IMS). De plus, il a un rôle régulateur dans la matrice mitochondriale et dans le cytosol où il contrôle l’activité des enzymes et des protéines de signalisation et de régulation. Dans tous ces procédés, la réversibilité de l'oxydation des résidus Cys est une caractéristique essentielle. Deux systèmes oxydoréductase puissants existent : les voies de glutathion (GSH) et la thiorédoxine ; ils catalysent la réduction des ponts disulfure, et contrôlent la plupart des processus cellulaires thiol-redox dépendant. Cependant, en dépit d'énormes connaissances portant sur leur enzymologie, peu est connu sur les caractéristiques physiologiques de ces systèmes chez les eucaryotes. Pour déterminer l'importance physiologique de ces systèmes et indiquer lequel est à la base de l'exigence du GSH pour la viabilité, nous avons effectué une analyse complète des cellules de levure épuisée ou contenant des niveaux toxiques de GSH. Les deux conditions déclenchent une réponse « iron-starvation-like » et une altération de l'activité des enzymes d’assemblage des centres fer-soufre (Iron sulfure cluster : ISC) extra-mitochondriales. Cependant, elles n’ont pas d'impact sur l’entretien thiol redox, à l’exception des niveaux élevés de glutathion qui ont altéré le repliement oxydatif des protéines dans le reticulum endoplasmique. Alors que le fer sauve partiellement la maturation des ISC et les défauts de croissance des cellules appauvries eh GSH, des expériences génétiques ont indiqué que, contrairement à la thiorédoxine, le glutathion ne peut pas assurer par lui-même les fonctions thiol-redox de la cellule. Nous proposons que le glutathion soit essentiel par son exigence dans l’assemblage des centres fer-soufre, mais ne serve comme backup que pour maintenir l’état thiol-redox de la cellule. Des niveaux physiologiques élevés de GSH sont ainsi destinés à isoler sa fonction dans le métabolisme du fer des variations de sa concentration pendant le stress redox, ce qui constitue un modèle contestant la vision traditionnelle du GSH comme acteur primordial du contrôle thiol-redox cytosolique.Nos données préliminaires sur la distribution de GSH dans les cellules recueillies par lasurveillance de l'état redox de rxYFP ciblée pour différents compartiments cellulaires (RE,Matrice, cytosol et IMS) dans les cellules HGT1 indiquent un transport spécifique du GSH vers le RE et l'exportation de GSSG de ce compartiment. Nous avons pu caractériser deuxtransporteurs ABC dont la suppression modifie le RE plus oxydant et entraîne une accumulation de GSSG par rapport aux cellules sauvages. Ces données ont été confirmées par le suivi de l'état redox de PDI1 et ERO1 (WT et hyper active). Elles suggèrent un rôle de ces transporteurs dans l'exportation du GSSG du la RE, et que le flux de GSH entre les différents compartiments est très régulé. / Cys residue oxidation is a widespread biochemical modification occurring in all eukaryotic cells compartments. It serves oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum (ER), protein import in the intermembrane space of mitochondria (IMS), and it has a regulatory role in the mitochondrial matrix and in the cytosol where it controls enzymes and signaling regulatory proteins activity. In all these processes, reversibility of Cys residue oxidation is a crucial feature. Two potent oxidoreductase systems, the glutathione (GSH) and thioredoxin pathways, catalyze disulfide bond reduction, and presumably control most thiol-redox-dependent cellular processes. However, despite tremendous knowledge of their enzymology, little is known about the physiological features of these systems in eukaryotes. To determine the physiologic importance of these functions and sort out which of them accounts for the GSH requirement for viability, we performed a comprehensive analysis of yeast cells depleted of or containing toxic levels of GSH. Both conditions triggered an intense iron-starvation-like response and impaired the activity of extra-mitochondrial ISC enzymes, but did not impact thiol-redox maintenance, except high glutathione levels that altered oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. While iron partially rescued the ISC maturation and growth defects of GSH-depleted cells, genetic experiments indicated that unlike thioredoxin, glutathione could not support by itself the thiolredox duties of the cell. We propose that glutathione is essential by its requirement in ISC assembly but only serves as a thioredoxin back up in cytosolic thiol-redox maintenance. Glutathione high physiologic levels are thus meant to insulate its function in iron metabolism from variations of its concentration during redox stresses, a model challenging the traditional view of it as prime actor in cytosolic thiol-redox control.Our preliminary data on the distribution of GSH inside cells collected by monitoring the redox state of rxYFP targeted to different cell compartments (ER, Matrix, Cytosol and IMS) in HGT1 cells indicate a specific transport of GSH into the ER and export of GSSG out of it. We were able to characterize two ABC transporters on which their deletion modify the redox state of the ER to more oxidizing and result in accumulation of higher GSSG content compared to WT. These data were confirmed by looking to the redox state of the PDI1 and ERO1 (WT and hyper active), all together suggest a role of these transporters in GSSG export from the ER, and that GSH flux between the different compartments is highly regulated.

Les peptides et protéines amyloïdes sont impliqués dans de nombreuses pathologies regroupées sous le terme d'amyloses. Ces protéines, dans des conditions encore mal connues, se replient en feuillets β croisés et s'assemblent en fibres. Afin de comprendre les principes physico-chimiques impliqués dans ce processus, nous avons conçu des modèles de fibres amyloïdes par la synthèse d'édifices peptidiques basés sur la séquence du peptide β amyloïde. Ils se composent de deux ou quatre fragments amyloïdes mutés, linéaires ou cyclisés, que nous avons liés à un châssis décapeptide cyclique. Ces édifices se replient en feuillets β croisés et s'assemblent en protofilaments de 5 à 6 nm de diamètre. A l'aide de la modélisation moléculaire, nous avons montré que le repliement en boucle de type brin β-boucle-brin β et la création d'un cœur hydrophobe sont nécessaires pour la formation des feuillets β croisés parallèles. Ces édifices sont des modèles très prometteurs pour la compréhension du mécanisme de formation des fibres amyloïdes.<br />Parmi les stratégies thérapeutiques développées récemment pour lutter contre les amyloses, l'inhibition de la formation des dépôts amyloïdes a été largement étudiée. Au cours de nos travaux, nous avons développé des inhibiteurs de la fibrillogénèse par la présentation de plusieurs exemplaires de molécules hydrophobes sur un cyclodécapeptide. Cette stratégie a pour but de créer une zone d'interaction avec le peptide β amyloïde suffisamment importante pour perturber son auto-association. Nous avons montré, par la réalisation d'expériences de polymérisation du peptide Aβ40, que ces composés sont des inhibiteurs très efficaces par comparaison avec les dérivés monomériques. Ces résultats confirment l'intérêt de cette stratégie pour interférer avec le phénomène de formation des fibres amyloïdes.

La thyroperoxydase humaine (hTPO) est l'enzyme clé de la biosynthèse des hormones <br />thyroïdiennes, impliquées dans de nombreux processus biologiques. Cette hémo- <br />glycoprotéine membranaire de type I est exprimée à la surface apicale des thyrocytes où elle <br />exerce ses fonctions d'iodation de certains résidus de tyrosine de la thyroglobuline et de <br />couplage de ces iodotyrosines pour former les hormones thyroïdiennes T3 et T4. <br />Lors de sa biosynthèse, la hTPO subit des modifications post-transcriptionnelles par <br />épissage alternatif du précurseur de l'ARNm. Trois isoformes de l'enzyme étaient connues : <br />la TPO1 (ADNc complet), la TPO2 et la TPO3 engendrées par épissage alternatif des exons <br />10 et 16 du précurseur de l'ARNm de la TPO. Dans cette thèse, nous avons identifié et <br />quantifié par PCR, cinq nouvelles isoformes toutes induites par des épissages alternatifs : la <br />TPO4 (sans exon 14), la TPO5 (sans exon 8), la TPO6 (sans exons 10, 12, 13, 14 et 16), la <br />TPO2/4 (sans exons 10 et 14), et la TPO2/3 (sans exons 10 et 16). Ces isoformes sont plus ou <br />moins stables, actives ou non et transportées correctement ou non jusqu'à la membrane <br />plasmique. <br />Nous avons également démontré, comme pour d'autres cas de pathologie cancéreuse, <br />l'augmentation des phénomènes d'épissage alternatif de la hTPO en association avec une <br />diminution globale du taux d'expression transcriptionnel de la protéine dans les différents <br />types de cancers thyroïdiens. <br />La hTPO subit également des modifications co- et post-traductionnelles. Elle interagit <br />en particulier avec les « protéines chaperons » du réticulum endoplasmique (RE), qui aident <br />les protéines nouvellement synthétisées à se replier correctement et font partie du “contrôle de <br />qualité” du RE. On sait que la hTPO est largement retenue au niveau du réticulum <br />endoplasmique et subissait un processus de dégradation faisant intervenir d'une part le <br />protéasome et d'autre part des protéases du RE. Le repliement correct de la hTPO nécessite <br />des interactions avec la calnexine (CNX) et la calreticuline. Dans cette thèse, nous montrons <br />que la co-surexpression de la CNX et de ERp57, impliquée dans la formation des ponts <br />disulfures des protéines interagissant avec la CNX, n'augmente pas la proportion des formes <br />correctement repliées, ce qui suggère l'implication d'autres protéines chaperons et/ou de <br />catalyseurs de repliement dans le processus de maturation de la hTPO. Nous montrons qu'à <br />l'inverse de la CNX, l'interaction avec une autre protéine chaperon appelée BiP, diminue le <br />repliement de la hTPO et entraîne la protéine vers la dégradation, suggérant ainsi que BiP <br />pourrait être un des senseurs de la dégradation de la hTPO. <br />Nous avons aussi montré que la thyroperoxydase purifiée à partir de thyroïde humaine <br />ou exprimée dans les CHO subit un clivage endoprotéolytique dans sa partie N-terminale. <br />L'enzyme impliquée dans ce clivage appartient vraisemblablement à la famille des protéines <br />convertases, endoprotéases impliquées dans la maturation de nombreux précurseurs de <br />pro-récepteurs et glycoprotéines de surface. A l'instar d'une autre protéine de la famille des <br />peroxydases, la myéloperoxydase humaine, la proséquence de la hTPO agit comme une <br />protéine chaperon interne en facilitant le repliement correct de la protéine. <br />Ces résultats éclairent davantage notre connaissance des mécanismes impliqués dans la <br />maturation de la hTPO et expliquent l'hétérogénéité de la TPO exprimée dans la thyroïde <br />humaine.

Cette thèse se décompose en deux parties indépendantes. Notre objectif dans la première partie est d'étudier le comportement asymptotique des $U$-statistiques, basées sur des noyaux d'ordre 2, échantillonnées par une marche aléatoire. Plus précisément, on se donne $(S_n)_(n \in \N)$ une marche aléatoire sur $\Z^d$, $d \geq 1$ et $(\xi_x)_(x \in \Z^(d))$ une collection de variables aléatoires indépendantes, identiquement distribuées, indépendante de $(S_n)_(n \in \N)$. On note $\mu$ la loi de $\xi_0$ et l'on désigne par $h : \R^2\ra \R$, une fonction mesurable, symétrique, telle que $h \in L^2(\mu\otimes\mu)$. On s'intéresse au comportement asymptotique de la suite de processus, $$ \cU_n(t)=\sum_(i,j=0)^([nt])h(\xi_(S_i), \xi_(S_j)), \quad t\in[0,1], \quad n=0,1,\ldots, $$ à valeurs dans $\cD([0,1])$, l'espace des fonctions c.à.l.à.g. définies sur $[0,1]$, muni de la topologie de Skorohod. Cabus et Guillotin ont obtenu la distribution asymptotique de ces objets, dans le cas où la marche aléatoire, $(S_n)_(n \in \N)$, est récurrente sur $\Z^2$, ainsi que dans le cas où elle est transiente sur $\Z^d$, pour $d\geq3$. Elles ont également conjecturé la forme de la distribution limite, dans le cas de la marche aléatoire simple, symétrique, sur $\Z$. Dans le cas où $\Sn$ appartient au domaine d'attraction d'une loi stable d'indice $1<\alpha\leq2$, nous prouvons deux théorèmes limites fonctionnels, décrivant le comportement asymptotique de $\(\cU_n, n=1,2,\ldots\)$. Nous démontrons ainsi, la conjecture de Cabus et Guillotin. Par ailleurs, nous donnons une nouvelle preuve de leurs résultats.\\ Dans une seconde partie, nous étudions le comportement asymptotique du temps d'atteinte de deux versions d'un algorithme d'évolution simplifié, modélisant le repliement d'une protéine : le $(1+1)$-EA sur le problème LeadingOnes. Pour chaque algorithme nous donnons une loi des grands nombres, un théorème central limite et nous comparons la performance des deux modèles.\\

La mise en conformation de l'α et β tubulines en hétérodimeres polymérisables nécessite l'intervention de cinq protéines " Tubulin Binding Cofactors " (TBCA a TBCE) dont TBCC qui joue un rôle indispensable. Dans des cellules humaines d'adénocarcinome mammaire, nous avons modifié le niveau d'expression de TBCC et nous avons montre que ceci avait un impact sur le contenu des fractions de tubuline, la dynamique des microtubules ainsi que sur le phénotype et chimiosensibilité des cellules. La distribution en cycle cellulaire et les durées de la mitose et de la phase S ont été altérées. La modification de TBCC avait un faible effet sur la vitesse de prolifération in vitro par contre les cellules présentaient des différences significatives de croissance tumorale in vivo. Les réponses aux agents antimicrotubulaires et à la gemcitabine ont montrées une chimiosensibilité dépendante de la distribution en cycle cellulaire. Tous ces résultats montrent l'importance de la régulation du contenu en tubulines et l'impact de ceci sur le comportement de la cellule en général et vis-à-vis des traitements.

La mise en conformation de l'α et β tubulines en hétérodimeres polymérisables nécessite l'intervention de cinq protéines " Tubulin Binding Cofactors " (TBCA a TBCE) dont TBCC qui joue un rôle indispensable. Dans des cellules humaines d'adénocarcinome mammaire, nous avons modifié le niveau d'expression de TBCC et nous avons montre que ceci avait un impact sur le contenu des fractions de tubuline, la dynamique des microtubules ainsi que sur le phénotype et chimiosensibilité des cellules. La distribution en cycle cellulaire et les durées de la mitose et de la phase S ont été altérées. La modification de TBCC avait un faible effet sur la vitesse de prolifération in vitro par contre les cellules présentaient des différences significatives de croissance tumorale in vivo. Les réponses aux agents antimicrotubulaires et à la gemcitabine ont montrées une chimiosensibilité dépendante de la distribution en cycle cellulaire. Tous ces résultats montrent l'importance de la régulation du contenu en tubulines et l'impact de ceci sur le comportement de la cellule en général et vis-à-vis des traitements.

Un polypeptide néosynthétisé est capable de trouver rapidement le chemin vers sa structure tri-dimensionnelle finale, en passant par des intermédiaires partiellement structurés. L'acquisition d'information sur le rôle et l'importance de ces intermédiaires est rendue difficile parce qu'ils se forment très rapidement pendant la réaction de repliement et que cette période de temps n'est pas accessible aux appareils de mélange usuels.<br />L'objet de cette thèse était de caractériser les évènements cinétiques initiaux du repliement des protéines, notamment de l'apomyoglobine (apoMb), en utilisant des appareils de mélange ultra-rapide. Un appareil de type stopped-flow équipé d'une micro-cuve a permis de diminuer le temps mort de ce type de mélangeur. Une réaction bimoléculaire (NATA et NBS), à permis d'évaluer le temps mort à 400±10 µs, dans un mode d'utilisation permettant de suivre simultanément le signal de fluorescence et le signal de dichroïsme circulaire dans l'UV lointain. L'apoMb est une protéine particulièrement intéressante pour l'étude des évènements précoces du repliement des protéines. Le stopped-flow ultra rapide, a permis de suivre des cinétiques (k jusqu'à 1500 s-1) et montré que chaque étape précédemment identifiée, conduisant l'apoMb de sa forme dépliée à sa forme native (soit les réactions UIa, IaIb, et IbN), présente les caractéristiques typiques d'une réaction à deux états, hautement coopérative.<br />Nous avons étudié l'effet d'osmolytes sur les cinétiques et sur la stabilité à l'équilibre des formes U, I et N de l'apoMb. Des études cinétiques en présence de sucrose ont permis d'observer le comportement de la réactions UIa. Ces résultats indiquent que le sucrose déstabilise de manière relative la forme U et l'état de transition de la réaction UIa, par rapport à la forme Ia. L'étape limitante ne correspondrait donc pas à une compaction de la chaîne peptidique. Dans les mêmes conditions, l'étude de la transition IbN permet d'observer que l'état de transition présente des caractéristiques proches de Ib. Ces résultats, décrivant l'effet osmophobique sur l'intermédiaire I, ainsi que des résultats préliminaires de l'effet d'encombrement moléculaire sur le repliement du cytochrome C, sont discutés dans ce mémoire.

La reconnaissance moléculaire constitue l'une des questions fondamentales les plus discutées dans le domaine de la chimie supramoléculaire. Cette thèse présente la conception, la synthèse et l'étude des propriétés de capsules hélicoïdales auto-organisées par repliement d'oligoamides aromatiques. Ces récepteurs sont constitués d'une chaîne oligomérique se repliant en hélice et comprenant une séquence d'unités codant pour des diamètres différents. Le repliement de l'oligomère donne naissance à une cavité pouvant accueillir des molécules invitées. La grande modularité des séquences, permettant une évolution contrôlée des structures des foldamères, donne lieu à la reconnaissance sélective et anticipée de substrats d'intérêts biologiques. Le phénomène d'encapsulation a été mis en évidence en solution par spectroscopie RMN et CD, et dans le solide par diffraction des rayons X.

Il est essentiel pour chaque organisme d’avoir la possibilité de réguler ses fonctions afin de permettre sa survie et d’améliorer sa capacité de se reproduire en divers habitats. Avec l’information disponible, il semble que les organismes consacrent une partie assez importante de leur matériel génétique à des fonctions de régulation. On peut envisager que certains mécanismes de régulation ont persisté dans le temps parce qu’ils remplissent bien leurs rôles. Les premières études sur les procaryotes ont indiqué qu’il y avait peu de mécanismes de régulation exerçant le contrôle des gènes, mais il a été démontré par la suite qu’une variété de ces mécanismes est utilisée pour la régulation de gènes et d’opérons. En particulier, les opérons bactériens impliqués dans la biosynthèse des acides aminés, l’ARNt synthétase, la dégradation des acides aminés, les protéines ribosomales et l’ARN ribosomal font l’objet d’un contrôle par l’atténuation de la transcription. Ce mécanisme d’atténuation de la transcription diffère d’autres mécanismes pour la génération de deux structures différentes de l’ARNm, où l’une de ces structures réprime le gène en aval, et l’autre permet de continuer la transcription/traduction. Dans le cadre de cette recherche, nous nous sommes intéressé au mécanisme d’atténuation de la transcription chez les procaryotes où aucune molécule ne semble intervenir comme facteur de régulation, en me concentrant sur la régulation des opérons bactériens. Le but principal de ce travail est de présenter une nouvelle méthode de recherche des riborégulateurs qui combine la recherche traditionnelle des riborégulateurs avec la recherche structurale. En incorporant l’étude du repliement de l’ARNm, nous pouvons mieux identifier les atténuateurs répondant à ce type de mécanisme d’atténuation. Ce mémoire est divisé en quatre chapitres. Le premier chapitre présente une revue de la littérature sur l’ARN et un survol sur les mécanismes de régulation de l’expression génétique chez les procaryotes. Les chapitres 2 et 3 sont consacrés à la méthodologie utilisée dans cette recherche et à l’implémentation du logiciel TA-Search. Enfin, le chapitre 4 expose les conclusions et les applications potentielles de la méthode. / It is essential for each organism to have the possibility to regulate its functions to allow its survival and improve its capacity to reproduce in different environments. With the information available, it is apparent that most organisms dedicate an important piece of their genetic material to regulating functions. We could think that certain regulating mechanisms have most likely persisted over time because they fulfilled their roles. The first prokaryotes studies indicated that there are few regulating mechanisms that take control over genes, but it has been proven that a variety of these mechanisms are used in the regulation of genes and operons. In particular, the bacterial operons involved in the biosynthesis of amino acids, tRNA synthetase, the degradation of amino acids, the ribosomal proteins and RNA ribosomal could be controlled by transcription attenuation. This mechanism of regulation differs from others for the creation of two different structures of the mRNA where one of these structures represses the gene in 3’ and the other one allows the transcription/translation to continue. In this work, I’m interested in the mechanism of transcription attenuation in prokaryotes where no molecule appears to act as a regulatory factor. In particular, I’m interested in the regulation of bacterial operons. The principal goal of this work is to present a new method for detecting riboswitches that combines the traditional research of these elements with the structural research by incorporating the study of mRNA folding. This thesis is divided into four chapters. Chapter 1 is a review of the literature on RNA and an overview of the regulatory mechanism of gene expression in prokaryotes. Chapter 2 and 3 present the method developed for this work and its implementation in new software, TA-Search. Finally, Chapter 4 is dedicated to providing a discussion and conclusion for this work.

Mon travail de thèse porte sur la protéine AhPDF1 de la plante Arabidopsis halleri. AhPDF1 est une défensine de 51 résidus, riche en cystéines qui participe à la défense de la plante en jouant un rôle antifongique. La défensine AhPDF1 possède 8 cystéines impliquées dans ses 4 ponts disulfure, elle présente un repliement en CSαβ. Des travaux récents sur AhPDF1 ont permis d'identifier une nouvelle fonction : la tolérance aux métaux lourds, en particulier la tolérance au zinc. L'objectif général du projet dans lequel s'intègre ma thèse est donc de comprendre, au niveau atomique et en lien avec l'état d'oxydation des cystéines, le mécanisme par lequel les défensines de plantes confèrent la tolérance au zinc. Dans une majeure partie de ma thèse j'ai travaillé à la production de la défensine AhPDF1 d'abord dans Escherichia coli puis dans Pichia pastoris. J'ai ensuite mis au point la synthèse chimique de la protéine AhPDF1 et optimisé l'étape la plus délicate, celle du repliement oxydatif. Après avoir produit la défensine AhPDF1 en quantité et qualité suffisante, j'ai réalisé son étude structurale par RMN. De plus cette structure m'a servi de base pour modéliser, par homologie, toutes les autres défensines actuellement identifiées d'Arabidopsis halleri et Arabidopsis thaliana. Enfin, j'ai appris à maîtriser les conditions qui permettent de conserver la protéine dans un état partiellement réduit et j'ai réalisé les premiers essais de chélation de la défensine avec le zinc.