Les microtubules-qui définissent la forme des axones, des cils et des flagelles, et qui servent de rails pour le transport intracellulaire-subissent de fortes contraintes exercées par les forces intracellulaires. La structure des microtubules et leur rigiditépeuvent en théorie être affectées par des contraintes physiques. Cependant, il reste à établir comment les microtubules tolèrent de telles forces et quelles sont les conséquences de ces forces sur la structure des microtubules. En utilisant un dispositif demicrofluidique, j’ai pu montrer que la rigidité des microtubules diminue progressivementà chaque cycle de courbure induit par des contraintes hydrodynamiques.Comme dans d'autres exemples de fatigue des matériaux, l'application de contraintes mécaniques sur des défauts pré-existants le long des microtubules est responsable de la génération de dommages plus étendus. Ce processus rend les microtubules moins rigides.J’ai pu aussi montrer que les microtubules endommagés peuvent se réparer en intégrant de nouveaux dimères de tubuline à leur surface et de récupérer ainsi leur rigidité initiale. Nos résultats démontrent que les microtubules sont des matériaux biologiquesayant des propriétés d’auto-réparation, et que la dynamique des microtubules ne se produit pas exclusivement à leurs extrémités. La mise en évidence de ces nouvelles propriétés permet de montrer comment les microtubules peuvent s’adapter à des contraintesmécaniques. / Microtubules—which define the shape of axons, cilia and flagella, and provide tracks for intracellular transport—can be highly bent by intracellular forces, and microtubule structure and stiffness are thought to be affected by physical constraints. Yet how microtubules tolerate the vast forces exerted on them remains unknown. Here, by using a microfluidic device, we show that microtubule stiffness decreases incrementally with each cycle of bending and release. Similar to other cases of material fatigue, the concentration of mechanical stresses on pre-existing defects in the microtubule lattice is responsible for the generation of more extensive damage, which further decreases microtubule stiffness. Strikingly, damaged microtubules were able to incorporate new tubulin dimers into their lattice and recover their initial stiffness. Our findings demonstrate that microtubules are ductile materials with self-healing properties, that their dynamics does not exclusively occur at their ends, and that their lattice plasticity enables the microtubules’ adaptation to mechanical stresses.

Les agents ciblant les microtubules sont des médicaments anticancéreux efficaces. Leur utilisation dans le cadre d’un traitement combiné avec des rayonnements ionisants est également une stratégie prometteuse. Cependant, l’apparition de résistances aux produits chimiques et aux radiations nécessite de rechercher d'autres types de traitements. Nos laboratoires ont récemment décrit deux médicaments qui ciblent directement ou indirectement les microtubules. Premièrement, un analogue du 2-méthoxyestradiol, un poison de fuseau se liant à des microtubules et provoquant la formation de fuseaux mitotiques anormaux. Il s'agit du 2-éthyl-3-O-sulphamoyle-estra-1,3,5 (10) 16-tétraène (ESE-16). Deuxièmement, le 9-benzoyloxy-5,11-diméthyl-2H, 6H-pyrido [4,3-b] carbazol-1-one (LimPyr1), un nouvel inhibiteur des LIM kinases induisant indirectement la stabilisation des microtubules. Il a été démontré récemment que LimPyr1 est actif sur les modèles de cancer du sein résistants au taxol. En tant que médicaments ciblant les microtubules, les deux agents, ESE-16 et LimPyr1, induisent des défauts mitotiques. Nous émettons donc l’hypothèse qu’ils pourraient sensibiliser les cellules aux radiations. Le but de ce projet de thèse était de vérifier cette hypothèse et, plus précisément, de déterminer si de faibles doses de ESE-16 et de LimPyr1 pourraient augmenter l'apoptose et retarder la réparation nucléaire induite par le rayonnement dans les cellules du cancer du sein in vitro.Différentes lignées cellulaires cancéreuses, les cellules MCF-7, MDA-MB-231 et BT-20, ont été exposées à ESE-16 et à LimPyr1 pendant 24 heures avant un rayonnement de 8 Gy. Les effets de ces combinaisons thérapeutiques ont été comparés à ceux obtenus à partir de cellules exposées aux composés seuls ou aux seules radiations. L'activation des voies de survie et des voies apoptotiques intrinsèques a été étudiée. Les résultats ont révélé une augmentation de la signalisation de la survie et de la mort dans les cellules exposées aux traitements individuels. Les traitements combinés ont diminué la survie des cellules alors que la signalisation apoptotique augmentait, entraînant une augmentation de l'apoptose. En outre, les traitements combinés ont augmenté de manière significative la présence de micronoyaux dans les cellules BT-20, indiquant une augmentation des dommages à l'ADN. Les cellules MCF-7 et MDA-MB-231 présentent une formation de micronoyaux similaire lorsqu'elles sont exposées à la combinaison de traitements ou au rayonnement uniquement. La phosphorylation de H2AX (γH2AX) (normalement augmentée lors de dommages à l'ADN) et l'expression de Ku70 (nécessaire pour la réparation de l'ADN) étaient diminuées dans les cellules de cancer du sein prétraitées 2 heures après l'irradiation par rapport aux cellules exposées à l'irradiation uniquement. L'expression de H2AX et Ku70 est cependant significativement accrue 24 heures après irradiation des cellules prétraitées par rapport aux cellules exposées aux traitements individuels. Des expériences portant sur la réponse adaptative ont révélé que LimPyr1 diminuait le développement de la résistance aux radiations en augmentant la perméabilité transmembranaire mitochondriale et en générant des ROS, un mécanisme qui n'est pas observé dans cellules traitées par ESE-16. Nous avons également observé une communication intercellulaire entre les cellules exposées au rayonnement et les cellules non exposées via l'effet induit par le rayonnement.En conclusion, le blocage mitotique partiel induit par ESE-16 et LimPyr1 rend les chromosomes plus exposés aux dommages dus aux radiations, comme l'indique l'augmentation de la présence de micronoyaux. De plus, les deux composés diminuent la signalisation et le trafic des protéines de protection et de dommages à l'ADN. En outre, LimPyr1 empêche le développement de résistances aux radiations dans les cellules exposées aux radiations. / Microtubule targeting agents are effective anti-cancer drugs. Their use as part of a combined treatment modality with ionising radiation is also a promising strategy. However, the emergence of resistance to chemical and radiation requires searching for alternative treatments. Our laboratories have recently described two drugs that directly or indirectly target the microtubules. Firstly, an analogue of 2-methoxyestradiol, a spindle poison binding to microtubules and causing the formation of abnormal mitotic spindles. This is 2-ethyl-3-O-sulphamoyl-estra-1,3,5 (10) 16-tetraene (ESE-16). Secondly, 9-benzoyloxy-5,11-dimethyl-2H, 6H-pyrido [4,3-b] carbazol-1-one (LimPyr1), a novel inhibitor of LIM kinases indirectly inducing microtubule stabilization. It has been recently shown that LimPyr1 is active on taxol-resistant breast cancer models. As microtubule-targeting drugs, both agents, ESE-16 and LimPyr1, induce mitotic defects. We thus hypothesize that they could sensitize cells to radiation. The aim of this PhD project was to test that hypothesis and, more specifically, to investigate whether low-dose ESE-16 and LimPyr1 could increase apoptosis and delay nuclear repair induced by radiation in breast cancer cells in vitro.Various cancer cell lines, MCF-7-, MDA-MB-231- and BT-20 cells, were exposed to ESE-16 and LimPyr1 for 24-hours prior to 8 Gy radiation. The effects of these combination therapies were compared to those obtained from cells exposed to the compounds alone or only to radiation. The activation of the survival and intrinsic apoptotic pathways were investigated. Results revealed an increase in survival and -death signaling in cells exposed to the individual treatments. The combination treatments decreased the cell survival while apoptotic signaling was increased, resulting in increased apoptosis. Furthermore, the combination treatments significantly increased the presence of micronuclei in BT-20 cells, indicating an increase in DNA damage. MCF-7- and MDA-MB-231 cells displayed similar micronuclei formation when exposed to the combination treatments or radiation only. Phosphorylation of H2AX (γH2AX) (normally increased upon DNA damage) and Ku70 expression (required for DNA repair) were decreased in pretreated breast cancer cells 2 hours after irradiation compared to cells exposed to irradiation only. The expression of H2AX and Ku70, however, is significantly increased 24 hours after irradiation of the pretreated cells relative to the cells exposed to the individual treatmentsExperiments investigating the adaptive response revealed that LimPyr1 decreased radiation resistance development by increasing the permeability of the mitochondrial transmembrane (flow cytometry measuring Mitocapture™) and the generation of ROS (flow cytometry employing hydroethidine), a mechanism not observed in ESE-16 pre-treated cells. We also observed an intercellular communication between cells exposed to radiation and non-exposed cells via the radiation induced bystander effect.In conclusion, the anti-mitotic effect of ESE-16 and LimPyr1 renders the chromosomes more exposed to radiation damage, as assessed by the increased occurrence of micronuclei. Moreover, both compounds decrease the signaling and trafficking of DNA damage and repair proteins. Additionally, LimPyr1 prevented the development of radiation resistance in cells exposed to radiation.

Dans cette thèse, des méthodes de la physique statistique hors équilibre sont utilisées pour décrire deux processus intracellulaires. Le transport bidirectionnel sur les microtubules est décrit à l'aide d'un gaz sur réseau stochastique quasi-unidimensionnel. Deux espèces de particules sautent dans des directions opposées en interagissant par exclusion. La présence habituelle d'accumulations de particules peut être supprimée en rajoutant la dynamique du réseau, c'est-à-dire de la microtubule. Un modèle simplifié pour la dynamique du réseau produit une transition de phase vers un état homogène avec un transport très efficace dans les deux directions. Dans la limite thermodynamique, une propriété de l'état stationnaire limite la longueur maximale des accumulations. La formation de voies peut être causée par des interactions entre particules. Néanmoins, ces mécanismes s'avèrent peu robustes face à une variation des paramètres du modèle. Dans presque tous les cas, la dynamique du réseau a un effet positif et bien plus important sur le transport que la formation de voies. Par conséquent, la dynamique du réseau semble un point-clé pour comprendre la régulation du transport intracellulaire. La dernière partie introduit un modèle pour la dynamique d'une microtubule sous l'action d'une protéine qui favorise les sauvetages. Des phénomènes intéressants de vieillissement apparaissent alors, et devraient être observables dans des expériences. / This thesis uses methods and models from non-equilibrium statistical physics to describe intracellular processes. Bidirectional microtubule-based transport within axons is modeled as a quasi-one-dimensional stochastic lattice gas with two particle species moving in opposite directions under mutual exclusion interaction. Generically occurring clusters of particles in current models for intracellular transport can be dissolved by additionally considering the dynamics of the transport lattice, i.e., the microtubule. An idealized model for the lattice dynamics is used to create a phase transition toward a homogenous state with efficient transport in both directions. In the thermodynamic limit, a steady state property of the dynamic lattice limits the maximal size of clusters. Lane formation mechanisms which are due to specific particle-particle interactions turn out to be very sensitive to the model assumptions. Furthermore, even if some particle-particle interaction is considered, taking the lattice dynamics into account almost always improves transport. Thus the lattice dynamics seems to be the key aspect in understanding how nature regulates intracellular traffic. The last part introduces a model for the dynamics of a microtubule which is limited in its growth by the cell boundary. The action of a rescue-enhancing protein which is added to the growing tip of a microtubule and then slowly dissociates leads to interesting aging effects which should be experimentally observable.

Le développement du cortex cérébral résulte de processus de prolifération, neurogenèse, migration et différenciation cellulaire qui sont contrôlés génétiquement. Les malformations corticales qui résultent d'anomalies de ces processus sont associées à l'épilepsie et la déficience intellectuelle. Nous avons étudié la souris mutante HeCo (heterotopic cortex), qui présente une hétérotopie sous-cortical bilatérale (neurones présents dans la substance blanche) et nous avons identifié la présence d'une mutation sur le gène Eml1 (Echinoderm Microtubule-associated protein-Like 1). De plus, des mutations du gène EML1 ont été identifiées chez des patients atteints d'une forme sévère et rare d'hétérotopie. Dans le cerveau embryonnaire des souris HeCo, des progéniteurs ont été identifiés en dehors de la zone de prolifération, ce qui représente une nouvelle cause de cette malformation. Nous avons étudié la fonction d'Eml1 dans les progéniteurs de la glie radiaire, qui sont clés au cours de la corticogenèse. Nous avons montré qu'Eml1 se localise dans le fuseau mitotique où elle est susceptible de réguler la dynamique des microtubules. Nos données suggèrent qu'Eml1 peut jouer un rôle dans la régulation de la longueur du fuseau puisque celle-ci est perturbée dans les cellules de la glie radiaire chez la souris HeCo. Ceci pourrait représenter la cause primaire de leur ectopie. Nous avons analysé le nombre et la taille des cellules en métaphase dans la partie apicale de la zone ventriculaire où ont lieu les mitoses. Nous proposons ici de nouveaux mécanismes qui régissent l'organisation des progéniteurs dans la zone ventriculaire au cours du développement cortical normal et pathologique. / The cerebral cortex develops through genetically regulated processes of cellular proliferation, neurogenesis, migration and differentiation. Cortical malformations represent a spectrum of heterogeneous disorders due to abnormalities in these steps, and associated with epilepsy and intellectual disability. We studied the HeCo (heterotopic cortex) mutant mouse, which exhibits bilateral subcortical band heterotopia (SBH), characterized by many aberrantly positioned neurons in the white matter. We found that Eml1 (Echinoderm Microtubule-associated protein-Like 1) is mutated in these mice. Screening of EML1 in heterotopia patients identified mutations giving rise to a severe and rare form of atypical heterotopia. In HeCo embryonic brains, progenitors were identified outside the normal proliferative ventricular zone (VZ), representing a novel cause of this disorder. We studied Eml1 function in radial glial progenitors (RGCs), which are important during corticogenesis generating other subtypes of progenitors and post-mitotic neurons, and serving as guides for migrating neurons. We showed that Eml1 localizes to the mitotic spindle where it might regulate microtubule dynamics. My data suggest a role in the establishment of the steady state metaphase spindle length. Indeed, HeCo RGCs in the VZ showed a perturbed spindle length during corticogenesis, and this may represent one of the primary mechanisms leading to abnormal progenitor behavior. I also analyzed cell number and metaphase cell size at the apical side of the VZ, where mitosis occurs. I thus propose new mechanisms governing normal and pathological VZ progenitor organization and function during cortical development.

La mise en conformation de l'α et β tubulines en hétérodimeres polymérisables nécessite l'intervention de cinq protéines " Tubulin Binding Cofactors " (TBCA a TBCE) dont TBCC qui joue un rôle indispensable. Dans des cellules humaines d'adénocarcinome mammaire, nous avons modifié le niveau d'expression de TBCC et nous avons montre que ceci avait un impact sur le contenu des fractions de tubuline, la dynamique des microtubules ainsi que sur le phénotype et chimiosensibilité des cellules. La distribution en cycle cellulaire et les durées de la mitose et de la phase S ont été altérées. La modification de TBCC avait un faible effet sur la vitesse de prolifération in vitro par contre les cellules présentaient des différences significatives de croissance tumorale in vivo. Les réponses aux agents antimicrotubulaires et à la gemcitabine ont montrées une chimiosensibilité dépendante de la distribution en cycle cellulaire. Tous ces résultats montrent l'importance de la régulation du contenu en tubulines et l'impact de ceci sur le comportement de la cellule en général et vis-à-vis des traitements.

La mise en conformation de l'α et β tubulines en hétérodimeres polymérisables nécessite l'intervention de cinq protéines " Tubulin Binding Cofactors " (TBCA a TBCE) dont TBCC qui joue un rôle indispensable. Dans des cellules humaines d'adénocarcinome mammaire, nous avons modifié le niveau d'expression de TBCC et nous avons montre que ceci avait un impact sur le contenu des fractions de tubuline, la dynamique des microtubules ainsi que sur le phénotype et chimiosensibilité des cellules. La distribution en cycle cellulaire et les durées de la mitose et de la phase S ont été altérées. La modification de TBCC avait un faible effet sur la vitesse de prolifération in vitro par contre les cellules présentaient des différences significatives de croissance tumorale in vivo. Les réponses aux agents antimicrotubulaires et à la gemcitabine ont montrées une chimiosensibilité dépendante de la distribution en cycle cellulaire. Tous ces résultats montrent l'importance de la régulation du contenu en tubulines et l'impact de ceci sur le comportement de la cellule en général et vis-à-vis des traitements.

La mise en conformation de l’α et β tubulines en hétérodimeres polymérisables nécessite l’intervention de cinq protéines « Tubulin Binding Cofactors » (TBCA a TBCE) dont TBCC qui joue un rôle indispensable. Dans des cellules humaines d’adénocarcinome mammaire, nous avons modifié le niveau d’expression de TBCC et nous avons montre que ceci avait un impact sur le contenu des fractions de tubuline, la dynamique des microtubules ainsi que sur le phénotype et chimiosensibilité des cellules. La distribution en cycle cellulaire et les durées de la mitose et de la phase S ont été altérées. La modification de TBCC avait un faible effet sur la vitesse de prolifération in vitro par contre les cellules présentaient des différences significatives de croissance tumorale in vivo. Les réponses aux agents antimicrotubulaires et à la gemcitabine ont montrées une chimiosensibilité dépendante de la distribution en cycle cellulaire. Tous ces résultats montrent l’importance de la régulation du contenu en tubulines et l’impact de ceci sur le comportement de la cellule en général et vis-à-vis des traitements / The proper folding pathway of α and β-tubulin into the α/β-tubulin heterodimers involve five Tubulin Binding Cofactors (TBCA to TBCE). TBCC plays a crucial role in the formation of polymerization-competent the α/β-tubulin heterodimers. To evaluate the impact of microtubule mass and dynamics on the phenotype and chemosensitivity of breast cancer cells, we targeted TBCC in human breast adenocarcinoma and developed variants of breast cancer cells with modified content of TBCC. We have shown that the modifications in TBCC expression level influenced tubulin fraction distribution and microtubule dynamics. Cell cycle distribution and the durations of mitosis and S-phase were altered. The proliferation rate in vitro was slightly modified whereas in vivo the TBCC variants presented major differences in tumor growth capacity. Chemosensitivity to antimicrotubule agents (paclitaxel and vinorelbine) as well as to gemcitabine was observed to be dependent on the cell cycle distribution of the TBCC variants. These results underline the essential role of fine tuned regulation of tubulin content in tumor cells and the major impact of dysregulation of tubulin dimer content on tumor cell phenotype, cell cycle progression and response to chemotherapy. A better understanding of how the microtubule cytoskeleton is dysregulated in cancer cells would greatly contribute to a better understanding of tumor cell biology and characterization of resistant phenotypes

Des mutations hétérozygotes faux-sens dans le gène de la tubuline gamma TUBG1, ont été identifiées dans le contexte des malformations du développement cortical, associées à une déficience intellectuelle et à l'épilepsie. Ici, nous avons étudié par la technique d’électroporation in-utero et par des études in vivo, l’effet de quatre de ces variantes sur le développement cortical. Nous montrons que les mutations dans TUBG1 affectent le positionnement neuronal dans la plaque corticale, en perturbant la locomotion des neurones nouvellement nés, mais sans affecter la neurogenèse. Nous proposons que la γ-tubuline mutante affecte le fonctionnement global de ses complexes, et en particulier leur rôle dans la régulation de la dynamique des microtubules. De plus, nous avons développé un modèle de souris knock-in Tubg1Y92C/+ et évalué les conséquences de la mutation sur le développement cortical, les caractéristiques neuroanatomiques et le comportement. Les souris mutantes présentent une microcéphalie globale, des anomalies du néocortex et de l'hippocampe, des altérations du comportement et une susceptibilité épileptique. Ainsi, nous montrons que les souris Tubg1Y92C/+ miment au moins partiellement le phénotype humain et représentent donc un modèle pertinent pour d'autres investigations de la physiopathologie des malformations du développement cortical. / Missense heterozygous variants in the gamma tubulin gene TUBG1 have been linked to malformations of cortical development, associated with intellectual disability and epilepsy. Here, we investigated through in-utero electroporation and in-vivo studies, how four of these variants affect cortical development. We show that TUBG1 mutants affect neuronal positioning within the cortical wall, by a disrupting the locomotion of newly born neurons but without affecting neurogenesis. We propose that mutant γ-tubulin affects overall functioning of γ-tubulin complexes, and in particular their role in the regulation of microtubule dynamics. Additionally, we developed a knock-in Tubg1Y92C/+ model and assessed consequences of the mutation on cortical development, neuroanatomical features and behaviour. Mutant mice present with global microcephaly, neocortical and hippocampal abnormalities, behavioural alterations and epileptic susceptibility. Thus, we show that Tubg1Y92C/+ mice partially mimic the human phenotype and therefore represent a relevant model for further investigations of the physiopathology of malformations of cortical development.