Des mutations du gène ARX (aristaless-related homeobox gene) ont été identifiées dans un large spectre de désordres neurologiques précoces, incluant ou non des malformations cérébrales, le plus souvent associés à des épilepsies. Il est proposé que le gène ARX, codant pour un facteur de transcription, joue un rôle primordial au cours du développement cérébral, notamment sur la migration des neurones GABAergiques, mais son implication au cours de la mise en place du système nerveux central reste cependant encore mal connue. L’objectif de ce travail a été d’étudier le rôle du gène ARX et les conséquences de ses mutations sur le développement cérébral dans le but de mieux comprendre ces pathologies. Dans un premier temps, nous avons étudié l’effet d’une mutation particulière du gène, la mutation ARX(CGC)7, une expansion polyalanine retrouvée principalement dans des pathologies sans malformation cérébrale mais avec des épilepsies, tels que les syndromes de West ou d’Ohtahara. Des analyses réalisées sur une lignée de souris knock-in pour cette mutation (GCG)7 et sur des rats après électroporation in utero ont montré que la migration neuronale des neurones glutamatergiques et GABAergiques ainsi que la maturation des neurones GABAergiques ne sont pas altérées par cette mutation. De façon intéressante, nos données suggèrent que les épilepsies observées chez les souris knock-in résulteraient plutôt d’une réorganisation du réseau glutamatergique. Etant donné que le gène ARX n’est pas exprimé dans les neurones glutamatergiques, l’ensemble de ce travail suggère donc que les épilepsies chez les souris knock-in pour la mutation (GCG)7 sont la conséquence d’une altération développementale secondaire à la mutation initiale du gène, et ceci aurait d’importantes répercussions thérapeutiques qui requièrent d’avantages d’études. Des expériences nous ont ensuite permis d’étudier l’effet de plusieurs mutations du gène ARX sur la morphologie des interneurones in vitro. Celles-ci ont montré que les mutations d’ARX n’engendrent pas une localisation subcellulaire anormale de la protéine dans les interneurones en culture. De façon intéressante, ces expériences suggèrent que la morphologie des interneurones est altérée seulement par certaines mutations, notamment les mutations P353R et Dup24. Ces données soulignent ainsi l’importance d’étudier de façon spécifique chaque mutation du gène pour expliquer les mécanismes engendrant l’hétérogénéité phénotypique liée aux mutations d’ARX. L’ensemble de ces travaux contribuent à une meilleure compréhension du rôle du gène ARX dans le développement cortical et à une meilleure caractérisation des mécanismes physiopathologiques des désordres neurologiques précoces liés aux mutations de ce gène. / Several mutations in ARX gene (aristaless-related homeobox gene) have been found in a large spectrum of infantile neurological disorders, with or without cerebral malformation, but frequently linked to epilepsy. It has been proposed that ARX, coding for a transcription factor, plays a crucial role in brain development, especially in migrating interneurons, but its involvement in nervous system development still remains to be clarified. The aim of this work has been to study the role of ARX gene and the consequences of ARX mutations on cerebral development in order to better understand these pathologies.We have first investigated the effects of an ARX polyalanine expansion, the mutation (GCG)7, which was found in pathologies without brain malformation but associated to epilepsy, such as West and Ohtahara syndromes. Analysis performed on knock-in mice for this mutation and in utero electroporated rat brains have shown that this mutation doesn’t alter neither glutamatergic and GABAergic neuronal migration, nor GABAergic neuron maturation. Interestingly, our data suggest that epilepsy observed in knock-in mice would result rather from a reorganization of glutamatergic networks. Since ARX gene is not expressed in excitatory neurons, our work suggests that epilepsy observed in knock-in mice is the consequence of developmental alterations secondary to the initial mutation, and this would have crucial therapeutic implications that require additional investigations. In vitro experiments have then allowed us to study the effect of several ARX mutations on interneurons morphology. These experiments have shown no abnormal subcellular localization of ARX protein following transfection of these different mutations in cultured interneurons. Interestingly, our data show that interneuron morphology is altered only by some mutations, particularly the P353R and the Dup24 ARX mutations. Our data underline the importance to study specifically each mutation in order to explain mechanisms generating phenotypic heterogeneity linked to ARX mutations.Taken together, this study contributes to a better understanding of ARX involvement in cerebral development and to a better characterization of pathophysiological mechanisms linked to ARX mutations.

Le développement du cortex cérébral se déroule selon des étapes bien définies qui sont essentielles à la formation d’un cerveau fonctionnel. La perturbation de l’une ou plusieurs de ces étapes peut conduire à des malformations neuro-développementales, responsables de différents troubles cognitifs, d’épilepsies ou encore de déficience intellectuelle. De nombreuses mutations dans des gènes codant pour les tubulines ou bien les kinésines, sont retrouvées chez des individus présentant diverses anomalies neuro-développementales. Bien que les kinésines soient impliquées dans le développement cortical, les mécanismes fonctionnels par lesquels elles conduisent aux malformations demeurent encore méconnus. Mon travail de thèse identifie la kinésine Kif21b, jusqu’alors peu connue, comme étant essentielle au développement cortical. Nous montrons que Kif21b régule la migration neuronale dans le cortex et identifions quatre variants chez des individus présentant des malformations neuro-développementales. Nous montrons que l’expression ectopique des variants chez la souris et le poisson zèbre récapitulent les phénotypes observés chez ces patients. / The development of the cerebral cortex is a highly regulated process that is crucial for the establishment of functional cortical networks. Disruption of one or several of these steps can lead severe neurodevelopmental disorders that are associated with intellectual disabilities, epilepsies and cognitive impairment. Over the past few years, several genetic mutations in genes encoding either tubulin or microtubule-associated motors such as kinesins, have been found in individuals with neurodevelopmental disorders. Although kinesins have been found to be essential for a proper cortical development, the exact functions of kinesins in these processes are still poorly understood. My work clearly identified Kif21b, a poorly-known kinesin, as a novel key regulator of cortical development both in mouse and human. We show that Kif21b regulates both radial and tangential migration of cortical neurons, and identify four KIF21B variants in individuals presenting neurodevelopmental disorders. We show that ectopic expression of variants recapitulate phenotypes both in mice and zebrafish.

Les malformations du développement cortical (MDC) résultent d’altérations au niveau de différentes étapes de la corticogénèse telles que la prolifération, la migration et la différenciation neuronale et sont généralement associées à des épilepsies pharmaco-résistantes et à des déficiences intellectuelles sévères. Les causes génétiques des MDC restent encore inconnues dans de nombreux cas, nous avons donc réalisé le séquençage de l’exome entier de nombreux patients présentant des MDC et les analyses ont permis de mettre en évidence l’implication des gènes KIF2A et NEDD4L dans les MDC. Dans le cadre de ma thèse, nous proposons de focaliser sur les conséquences cellulaires et neurodéveloppementales résultant des mutations dans les gènes KIF2A et NEDD4L retrouvées chez les patients atteints de MDC. KIF2A code pour une kinésine-13 qui a pour fonction de réguler la dynamique des microtubules (MT) via son activité MT dépolymérase ATP-dépendante aux niveaux des extrémités des MT. L’approche basée sur la technique d’électroporation in utero nous a permis de mettre en évidence le rôle crucial joué par KIF2A dans la régulation de la neurogénèse, la migration neuronale et le positionnement des neurones dans le cortex. En particulier, nos données révèlent que l’expression des mutants KIF2A responsables de MDC entraîne une augmentation du nombre de cellules à l’état de progéniteurs qui est conséquente à un allongement du temps passé dans le cycle cellulaire. Nos premières données cellulaires et au cours du développement montrent que l’expression des mutants KIF2A induit des altérations dans l’intégrité du fuseau mitotique, dans la progression mitotique et également une localisation anormale de KIF2A au niveau du cil primaire. NEDD4L code pour une E3 ubiquitine ligase qui joue un rôle dans l’ubiquitination de nombreux substrats permettant la régulation de leur dégradation et de leur localisation subcellulaire. Dans un premier temps, nos données cellulaires ont montré que les mutants associées à des MDC ont une sensibilité accrue pour la dégradation par le protéasome. De plus, l’approche d’électroporation in utero a permis de montrer que l’expression des mutants NEDD4L ainsi qu’un excès de NEDD4L WT dérégulent la neurogenèse, le positionnement des neurones et le processus de translocation terminal. Des études complémentaires, incluant le traitement à la rapamycine, ont révélé qu’un excès de NEDD4L WT mène à la dérégulation des voies de signalisations mTORC1 et Dab1 tandis que l’expression des mutants est associée à une dérégulation des voies mTORC1 et Akt. L’ensemble de ces résultats renforce donc dans un premier temps l’importance des protéines liées aux MT dans le développement cortical en décrivant le rôle crucial de la kinésine KIF2A dans des mécanismes tels que la dynamique de migration neuronale et dans la régulation du cycle cellulaire des progéniteurs neuronaux. D’autre part, nous fournissons également de nouvelles données permettant de mieux comprendre le rôle critique de NEDD4L dans la régulation des voies mTOR et de leurs contributions dans le développement cortical. / Malformations of cortical development (MCD) result from alterations in different stages of corticogenesis such as proliferation, migration and neuronal differentiation, and are generally associated with drug-resistant epilepsy and severe intellectual disabilities. The genetics causes of MCD remain largely unknown, we have thus performed the whole-exome sequencing of many patients with MCD and reported the identification of multiple pathogenic missense mutations in KIF2A and NEDD4L genes. Within the frame of my thesis project, we propose to focus on the cellular and neurodevelopmental consequences resulting from KIF2A and NEDD4L mutations shown to be involved in MCD. KIF2A is a member of the kinesin-13 family, which rather than regulating cargos transport along microtubules (MT), regulates MT dynamics by depolymerizing MTs. The in utero electroporation approach allowed us to highlight the crucial role of KIF2A in the regulation neurogenesis, neuronal migration and the neuronal positioning in the cortex. Particularly, our data show that the expression of the KIF2A mutants involved in MDC lead to an increase in the number of cells in proliferative state which is a consequence of a prolonged time spent in the cell cycle. Our first cellular data and during development show that the expression of pathogenic KIF2A mutations induce alterations in the mitotic spindle integrity, in the mitotic progression and also an abnormal localization of KIF2A in the primary cilium. NEDD4L encodes a member of the NEDD4 family of HECT-type E3 ubiquitin ligases known to regulate the turnover and function of a number of proteins involved in fundamental cellular pathways and processes. Firstly, cellular and expression data showed sensitivity of MCD-associated mutants to proteasome degradation. Moreover, the in utero electroporation approach showed that PNH-related mutants and excess wild-type NEDD4L affect neurogenesis, neuronal positioning and terminal translocation. Further investigations, including rapamycin-based experiments, found differential deregulation of pathways involved. Excess wild-type NEDD4L leads to disruption of Dab1 and mTORC1 pathways, while MCD-related mutations are associated with deregulation of mTORC1 and AKT activities. Altogether, these results reinforce the importance of MT-related proteins in cortical development describing the crucial role of KIF2A kinesin in mechanisms such as neuronal migration dynamics and neuronal progenitor’s cell cycle regulation. On the other hand, we also provide new data to better understand the critical role of NEDD4L in the regulation of mTOR pathways and their contributions in cortical development.

Le développement du cortex cérébral résulte de processus de prolifération, neurogenèse, migration et différenciation cellulaire qui sont contrôlés génétiquement. Les malformations corticales qui résultent d'anomalies de ces processus sont associées à l'épilepsie et la déficience intellectuelle. Nous avons étudié la souris mutante HeCo (heterotopic cortex), qui présente une hétérotopie sous-cortical bilatérale (neurones présents dans la substance blanche) et nous avons identifié la présence d'une mutation sur le gène Eml1 (Echinoderm Microtubule-associated protein-Like 1). De plus, des mutations du gène EML1 ont été identifiées chez des patients atteints d'une forme sévère et rare d'hétérotopie. Dans le cerveau embryonnaire des souris HeCo, des progéniteurs ont été identifiés en dehors de la zone de prolifération, ce qui représente une nouvelle cause de cette malformation. Nous avons étudié la fonction d'Eml1 dans les progéniteurs de la glie radiaire, qui sont clés au cours de la corticogenèse. Nous avons montré qu'Eml1 se localise dans le fuseau mitotique où elle est susceptible de réguler la dynamique des microtubules. Nos données suggèrent qu'Eml1 peut jouer un rôle dans la régulation de la longueur du fuseau puisque celle-ci est perturbée dans les cellules de la glie radiaire chez la souris HeCo. Ceci pourrait représenter la cause primaire de leur ectopie. Nous avons analysé le nombre et la taille des cellules en métaphase dans la partie apicale de la zone ventriculaire où ont lieu les mitoses. Nous proposons ici de nouveaux mécanismes qui régissent l'organisation des progéniteurs dans la zone ventriculaire au cours du développement cortical normal et pathologique. / The cerebral cortex develops through genetically regulated processes of cellular proliferation, neurogenesis, migration and differentiation. Cortical malformations represent a spectrum of heterogeneous disorders due to abnormalities in these steps, and associated with epilepsy and intellectual disability. We studied the HeCo (heterotopic cortex) mutant mouse, which exhibits bilateral subcortical band heterotopia (SBH), characterized by many aberrantly positioned neurons in the white matter. We found that Eml1 (Echinoderm Microtubule-associated protein-Like 1) is mutated in these mice. Screening of EML1 in heterotopia patients identified mutations giving rise to a severe and rare form of atypical heterotopia. In HeCo embryonic brains, progenitors were identified outside the normal proliferative ventricular zone (VZ), representing a novel cause of this disorder. We studied Eml1 function in radial glial progenitors (RGCs), which are important during corticogenesis generating other subtypes of progenitors and post-mitotic neurons, and serving as guides for migrating neurons. We showed that Eml1 localizes to the mitotic spindle where it might regulate microtubule dynamics. My data suggest a role in the establishment of the steady state metaphase spindle length. Indeed, HeCo RGCs in the VZ showed a perturbed spindle length during corticogenesis, and this may represent one of the primary mechanisms leading to abnormal progenitor behavior. I also analyzed cell number and metaphase cell size at the apical side of the VZ, where mitosis occurs. I thus propose new mechanisms governing normal and pathological VZ progenitor organization and function during cortical development.

La migration radiaire est un des processus clefs de la corticogenèse menant à l’établissement d’un cortex en six couches chez les mammifères. La compréhension de ce mécanisme complexe est nécessaire à une meilleure appréhension du développement cortical. Dans ce travail de thèse, j’ai étudié la migration des neurones pyramidaux du cortex sous deux angles distincts. La 1ère partie se place d’un point de vue développemental en appréciant comment le positionnement laminaire résultant d’une migration normale ou anormale affecte la maturation neuronale. La 2nde partie se concentre sur une pathologie migratoire, l’hétérotopie en bande sous-corticale, et les altérations cognitives parfois associées à cette malformation. Pour ces deux projets, la migration neuronale a été altérée chez le rat par knockdown (KD) in utero de la doublecortine (Dcx), un effecteur majeur de la migration. Les neurones positionnés anormalement présentent une orientation incorrecte, un arbre dendritique moins développé, une spinogenère réduite et une altération morpho-fonctionnelle de la synaptogenèse glutamatergique. De plus, notre étude a mis en évidence l’implication de Dcx dans la dendritogenèse et la régulation fine des synapses glutamatergiques in vivo. Enfin, nous avons utilisé les rats Dcx-KD comme modèle d’hétérotopie en bande afin d’étudier comment un déficit de migration neuronale impacte le fonctionnement du cortex. La caractérisation comportementale, réalisée à l’aide d’une large gamme de tests, n’a pas mis en évidence de déficits majeurs des capacités motrices, somatosensorielles ou cognitives chez ces animaux. / Radial migration is one of the key processes leading to the formation of a six-layered cortex in mammals. Understanding this mechanism is necessary to get a better grasp of cortical development. During my PhD, I studied neuronal migration of pyramidal neurons from two different points of views. The 1st part is related to fundamental biology and assesses how laminar misplacement resulting from migration failure influences neuronal maturation. The 2nd one focuses on pathology by investigating a migration disorder, subcortical band heterotopia, and associated cognitive deficits. For both projects, neuronal migration was impaired in rat through in utero knockdown (KD) of doublecortin (Dcx), a major effector of cortical migration. Misplaced neurons display an abnormal orientation, a simplified dendritic arbor, a decreased spinogenesis and morpho-functional alterations of glutamatergic synaptogenesis. Moreover, our study shows that Dcx plays a role in dendritogenesis, in shaping spine morphology and in fine-tuning glutamatergic synaptogenesis. Finally, we used Dcx-KD rats as an animal model of subcortical band heterotopia to assess how migration failure would impact cortical functions. The behavioral characterization carried out through a wide range of tests did not bring to light any major shortcoming regarding motor, somatosensory or cognitive abilities in these animals. Therefore, although Dcx-KD rats display a SBH and develop spontaneous seizures, it does not seem to recapitulate cognitive deficits found in patients.

Des mutations hétérozygotes faux-sens dans le gène de la tubuline gamma TUBG1, ont été identifiées dans le contexte des malformations du développement cortical, associées à une déficience intellectuelle et à l'épilepsie. Ici, nous avons étudié par la technique d’électroporation in-utero et par des études in vivo, l’effet de quatre de ces variantes sur le développement cortical. Nous montrons que les mutations dans TUBG1 affectent le positionnement neuronal dans la plaque corticale, en perturbant la locomotion des neurones nouvellement nés, mais sans affecter la neurogenèse. Nous proposons que la γ-tubuline mutante affecte le fonctionnement global de ses complexes, et en particulier leur rôle dans la régulation de la dynamique des microtubules. De plus, nous avons développé un modèle de souris knock-in Tubg1Y92C/+ et évalué les conséquences de la mutation sur le développement cortical, les caractéristiques neuroanatomiques et le comportement. Les souris mutantes présentent une microcéphalie globale, des anomalies du néocortex et de l'hippocampe, des altérations du comportement et une susceptibilité épileptique. Ainsi, nous montrons que les souris Tubg1Y92C/+ miment au moins partiellement le phénotype humain et représentent donc un modèle pertinent pour d'autres investigations de la physiopathologie des malformations du développement cortical. / Missense heterozygous variants in the gamma tubulin gene TUBG1 have been linked to malformations of cortical development, associated with intellectual disability and epilepsy. Here, we investigated through in-utero electroporation and in-vivo studies, how four of these variants affect cortical development. We show that TUBG1 mutants affect neuronal positioning within the cortical wall, by a disrupting the locomotion of newly born neurons but without affecting neurogenesis. We propose that mutant γ-tubulin affects overall functioning of γ-tubulin complexes, and in particular their role in the regulation of microtubule dynamics. Additionally, we developed a knock-in Tubg1Y92C/+ model and assessed consequences of the mutation on cortical development, neuroanatomical features and behaviour. Mutant mice present with global microcephaly, neocortical and hippocampal abnormalities, behavioural alterations and epileptic susceptibility. Thus, we show that Tubg1Y92C/+ mice partially mimic the human phenotype and therefore represent a relevant model for further investigations of the physiopathology of malformations of cortical development.

Le cortex cérébral est composé d’un grand nombre de types de neurones organisés radialement en couches cellulaires et tangentiellement en aires corticales fonctionnellement distinctes. Son développement est régulé par des signaux fonctionnant comme morphogènes sécrétés par des centres organisateurs situés à la périphérie du télencéphale dorsal. Ces morphogènes contrôlent l’expression dans les progéniteurs corticaux de gènes codant pour des facteurs de transcription qui régulent la prolifération, la différenciation et la spécification des progéniteurs corticaux. Les cascades de gènes impliquées dans la mise en place du cortex cérébral dans lesquelles ces signaux et facteurs de transcription interviennent restent cependant actuellement mal connues.<p>Les gènes Dmrt3 et Dmrt5 appartiennent à une famille de gènes fortement conservée évolutivement codant pour des facteurs de transcription à doigt de zinc connus pour leur rôle dans le développement sexuel. Des résultats obtenus dans le laboratoire ayant montré que Dmrt5 joue un rôle crucial dans la neurogenèse au niveau du système olfactif chez le xénope, j’ai voulu savoir, dans un premier temps, si la fonction de Dmrt5 dans la neurogenèse était une fonction ancestrale. Pour répondre à cette question, j’ai recherché des gènes Dmrts chez une espèce de Cnidaire, Nematostella vectensis, et ai étudié leur expression au cours du développement. L’un d’entre-eux, NvDmrtB, est fortement exprimé dans le système nerveux et s’est avéré être requis pour la différenciation des cellules nerveuses chez N. vectensis, suggérant que les gènes Dmrts avaient déjà un rôle dans la neurogenèse dans l’ancêtre commun des Bilatériens et des Cnidaires.<p>Par ailleurs, d’autres travaux ont montré que chez la souris les gènes Dmrt5 et Dmrt3 sont exprimés dans le cerveau en développement au niveau du télencéphale dorsal. Afin d’approcher leur fonction dans le développement cortical, j’ai analysé leur expression au cours du développement embryonnaire, caractérisé les anomalies de développement du cortex cérébral des souris knockout Dmrt5-/- et Dmrt3-/- ainsi que des souris double knockout Dmrt3-/-;Dmrt5-/- et étudié leur régulation. Mes résultats ont montré que Dmrt3 et Dmrt5 sont coexprimés dans les progéniteurs corticaux en gradient avec un maximum d’expression du côté caudo-médian. J’ai également observé que l’absence de Dmrt5 induit une réduction de la taille des vésicules télencéphaliques et que les structures de la partie caudo-médiane du cortex telles que le plexus choroïde et l’hippocampe sont altérées ainsi que les aires visuelle et somato-sensorielle. Au niveau moléculaire, mes résultats ont montré que Dmrt5 est requis pour l’expression de différents gènes codant pour les signaux Wnt et Bmp sécrétés au niveau de la région caudo-médiane des vésicules télencéphaliques, et qu’il contrôle négativement Pax6 et positivement Emx2, des déterminants respectivement de l’identité rostro-latérale et caudo-médiane du cortex cérébral. Bien que la taille des vésicules télencéphaliques n’apparaisse pas affectée chez les souris Dmrt3-/-, l’expression de différents composants de la voie Wnt et celle d'Emx2 et Pax6 est légèrement altérée, comme chez les souris Dmrt5-/-. Chez les souris double knock-out Dmrt3-/-;Dmrt5-/-, une réduction de la taille du cortex et des altérations de l’expression des gènes similaires et plus sévères que celle des souris Dmrt5-/- ont été observées. Nous avons également mis en évidence que l’expression de Dmrt3 est réduite chez les souris Dmrt5-/- et que inversement celle de Dmrt5 est légèrement augmentée chez les souris Dmrt3-/-. Enfin, nous avons observé que l’expression de ces deux gènes est dépendante du facteur de transcription Gli3 et que seul l’expression de Dmrt3 requiert les facteurs de transcription Pax6 et Emx2.<p>Ensemble, nos résultats indiquent que les facteurs de transcription Dmrt5 et Dmrt3 contrôlent le développement de la partie caudo-médiane du cortex, Dmrt5 agissant en amont de Dmrt3. Ils suggèrent également que ces facteurs y joueraient des rôles partiellement redondants en régulant l’expression de cibles communes tels les gènes Wnt3a et Pax6.! / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished