Comprendre l’évolution des espèces, et notamment l’adaptation locale, est un enjeu majeur dans le contexte des changements globaux actuels. Certaines espèces végétales se développent à la fois dans des environnements présentant de fortes concentrations en zinc, plomb et cadmium (populations métallicoles, M), et sur des sols non pollués (populations non-métallicoles, NM). Ces espèces, appelées pseudo-métallophytes, montrent des caractéristiques adaptives très étudiées depuis quelques années : la tolérance et l’hyperaccumulation de métaux lourds. Afin de mieux comprendre l’adaptation d’Arabidopsis halleri aux milieux métallifères, nous avons conduit une étude sur un ensemble de populations M et NM. Parce que l’adaptation nécessite notamment des variations phénotypiques et qu’elle résulte de l’action de pressions de sélection caractéristiques d’un milieu, nous avons utilisé une approche où écologie, phénotypage et génétique se rejoignent. Nous mettons en évidence que (1) d’autres facteurs environnementaux que les métaux distinguent les populations et pourraient agir comme des pressions de sélection sur l’accumulation et la tolérance au zinc, (2) séparer systématiquement les populations en M/NM ne semble pas judicieux pour étudier l’adaptation locale des populations, (3) les réponses des plantes sont traits et environnement-dépendantes, (4) l’architecture génétique de la tolérance au zinc est un ensemble d’effets additifs et épistatiques et enfin plus globalement (5) nous suggérons que l’adaptation aux milieux métallifères a évolué en réponse à de multiples pressions de sélection qui ont conduit à la mise en en place de tolérance à de multiples facteurs écologiques. / In the context of global changes, understanding the evolution of species, and especially local adaptation, is a major challenge. Some species are present in polluted areas where zinc, cadmium and leab are present in high and toxic concentrations (metallicolous populations, M) but also in non-polluted areas (non-metallicolous populations, NM). They are called pseudo-metallophytes and are metal tolerant, and sometimes metal hyperaccumulating. In order to understand better the adaptation of Arabidopsis halleri to polluted areas we studied M and NM populations at a local scale. Because the adaptation implies some phenotypic variations and results from the action of selective pressures we used an ecological, phenotypical and genetical approach. We showed that (1) populations differed not only by metal concentrations but also by other environmental parameters which could act as selective pressures on zinc tolerance and accumulation, (2) separating populations in M or NM groups is not adequate to study local adaptation, (3) plant responses are trait and environmental dependant, (4) the genetic architecture of zinc tolerance is a network of epistatic and additive effects and more globally (5) we suggest that the adaptation to metalliferous environments has evolved in response to a lot of selective pressures which have led to multi-tolerance to numerous ecological factors.

Les habitats naturels sont de plus en plus détruits et fragmentés par l'expansion urbaine et les activités humaines. La fragmentation des espaces naturels et agricoles par les bâtiments et les nouvelles infrastructures affecte la taille, la connectivité et la qualité des habitats. Les populations d’organismes vivants sur ces territoires anthropisés sont alors plus isolées. Or, la différenciation entre populations d’un même organisme dépend de processus démographiques et génétiques tels que la dérive génétique, le flux génétique, la mutation et la sélection naturelle. La persistance et le développement des populations dans des conditions environnementales modifiées dépendent de mécanismes de tolérance. Dans ce contexte, l'introduction de contaminants tels que des métaux dans l'environnement peut influencer l'évolution des plantes et des animaux en modifiant les forces évolutives et en créant des différences entre populations. Dans ce travail, l’attention a été portée sur les conséquences génétiques de la pollution métallique sur deux espèces, le ver de terre Lumbricus terrestris et une plante modèle Arabidopsis halleri. Deux approches différentes ont été utilisées pour étudier la réponse génétique à la contamination métallique : une approche de génétique des populations chez L. terrestris et une approche de génétique quantitative chez A. halleri. Tout d’abord, il s’est agi d’identifier et de valider de nouveaux marqueurs microsatellites chez L. terrestris. Ensuite, ces marqueurs ont été utilisés afin de caractériser la diversité génétique neutre chez des vers collectés sur des sites agricoles et urbanisés. Parallèlement, l'architecture génétique de la tolérance et de l'hyperaccumulation de Zn chez A. halleri a été explorée à l’aide d’un croisement intraspécifique entre une population métallicole et une population non métallicole. Une densité élevée de marqueurs SNP a été utilisée pour procéder à l'étape de cartographie QTL. / Natural habitats are more and more destructed and fragmented by urban expansion and human activities. The fragmentation of natural and agricultural areas by buildings and new infrastructures affects the size, connectivity and the quality of habitats. The populations of organisms inhabiting these anthropized territories are then more isolated. However, differentiation between populations of the same organism depends on demographic and genetic processes such as genetic drift, gene flow, mutation and natural selection. Only species that have developed special tolerance mechanisms can persist under changed environmental conditions. The introduction of contaminants such as metals in the environment may influence plants and animals evolution by modifying the evolutionary forces and thus generating differences between populations. In this work, attention was focused on the genetic consequences of metallic pollution on two species, the earthworm Lumbricus terrestris and the plant model Arabidopsis halleri. Two different approaches have been used to study the genetic response to metallic contamination: a population genetic approach was performed in L. terrestris and a quantitative genetic approach was carried on in A. halleri. First, it was a question of identifying and validating new microsatellite markers in L. terrestris. These markers were then used to characterize the neutral genetic diversity in worms collected from agricultural and urban sites. Secondly, genetic architecture of Zn tolerance and Zn hyperaccumulation was conducted investigated for the first time using an intraspecific crossing between metallicolous and non-metallicolous individuals of A. halleri. High density of SNP markers was used to proceed to the QTL mapping step.

La maintenance des voies navigables par dragage génère de grands volumes de sédiments, souvent contaminés en métaux. Pour certains d’entre eux, un traitement par phytoextraction pourrait être envisagé. Le premier volet de ce travail vise à étudier le devenir du Cd présent dans un sédiment de curage contaminé par des métaux lors de la culture d’A. halleri, plante hyperaccumulatrice de Zn et Cd. Pour cela, un suivi des teneurs en Cd a été réalisé dans le sédiment, les parties aériennes de la plante et les lixiviats lors de la culture en pot. La présence de plantes diminue la quantité de Cd lixivié, mais ne modifie ni la fraction échangeable ni le pool phytodisponible en Cd. La spéciation a été étudiée par spectroscopie EXAFS et µXANES, la localisation par µXRF et MEB-EDX, et la biodisponibilité par DGT et extraction au Ca(NO3)2. Avant culture, le Cd est présent sous forme d’un sulfure mixte de Zn, Cd et Fe. Après 5 mois de culture, cette espèce est totalement oxydée en présence de plantes et presque totalement dans les pots sans plante. Les espèces de Cd néoformées sont des complexes Cd-acides organiques et du Cd-phosphate. Le second volet de ce travail porte sur les mécanismes d’accumulation du Cd dans les parties aériennes d’A. halleri. Après culture en hydroponie, l’analyse des parties aériennes par autoradiographie en utilisant 109Cd montre que le métal est transféré aussi bien dans les feuilles jeunes que les matures, ces dernières montrant un enrichissement des tissus périphériques. L’analyse des feuilles par spectroscopie EXAFS a montré que le Cd était lié principalement à des ligands organiques de type COOH/OH, et de façon minoritaire à des ligands de type thiols. / The cleaning of waterways by regular dredging generates great volumes of sediments which often contain large amounts of metals. For some of them, a treatment by phytoextraction could be considered. The first part of this work focuses on the fate of Cd present in a metal-polluted dredged sediment during the culture of Arabidopsis halleri, a Zn and Cd hyperaccumulating plant. In this purpose, a five month pot experiment was done. Cd contents in the sediment, in the aerial parts of plant and in the leachates were measured each month in planted and non planted pots. The presence of plants decreases the amount of leached Cd, but does not influence the Cd exchangeable fraction and the Cd phytoavailable pool. Cd speciation in the sediment was studied by EXAFS and µXANES spectroscopy, Cd localization by µXRF and SEM-EDX, and Cd bioavailability by DGT and Ca(NO3)2 extraction. Before culture, Cd is present as mixed Zn, Cd and Fe sulphide of. After 5 months of culture, this species is totally oxidized in presence of plants and almost totally in the control pot without plant. Secondary Cd species include Cd- organic acid complexes and Cd-phosphate. The second part of this work focuses on the mechanisms of Cd accumulation in the aerial parts of A. halleri. After hydroponic culture, the study of the aerial parts by autoradiography using 109Cd showed that Cd was stored both in young and mature leaves, the latter showing a metal enrichment in the peripheral parts. The EXAFS study of the leaves showed that Cd was predominantly bound to COOH/OH–type organic ligands, and to a minor extent to thiol ligands

Cette étude a tenté de fournir une meilleure description et compréhension de l'origine et de l'évolution de la tolérance et de la capacité d'accumulation vis-à-vis du zinc dans les populations de l'espèce pseudométallophyte Arabidopsis halleri. La recherche a été réalisée à partir de 15 populations métallicoles (M) et non-métallicoles (NM) du sud de la Pologne. Les analyses physico-chimiques des sols et des plantes ont été effectuées afin de caractériser les habitats et les comportements des individus. Les analyses génétiques ont visé à décrire la structure génétique des populations d'A. halleri et à reconstruire leur histoire par une analyse phylogéographique. Les tests de tolérance et d'accumulation réalisés en conditions contrôlées sur les mêmes individus ont recherché les relations entre ces deux traits. Nous avons observé une variance des propriétés du sol et du comportement des populations plus forte dans les sites M; les 2 types des sites diffèrent de manière significative pour les concentrations en métaux lourds ainsi que pour d'autres paramètres physico-chimiques. L'analyse de la structuration génétique neutre menée à partir de 10 marqueurs nucléaires microsatellites a révélé un regroupement des populations en fonction de leur origine géographique. En outre, pour la première fois, nous avons montré qu'il existe des populations NM fondées à partir de populations M. L'analyse de la structuration génétique sélectionnée menée en conditions contrôlées montre que les populations NM sont moins tolérantes et accumulent significativement plus de Zn que les populations M. En revanche aucune relation entre ces traits n'a pu être détectée au niveau des individus eux mêmes. / This study attempted to provide a better description and understanding of the origin and the evolution of Zn tolerance and accumulation ability in Arabidopsis halleri populations from southern Poland. The research was carried out on 15 populations from both metalliferous (M) and non-metalliferous (NM) sites. Physic-chemical analyses of field soil and plant samples were performed in order to characterize A. halleri habitats and plants' behavior. Genetic analyses aimed to resolve genetic structure and to reconstruct phylogeography of A. halleri populations from investigated area. Tolerance and accumulation tests in controlled conditions aimed to check if relationships between tolerance and accumulation of heavy metals abilities exist in studied species. Variation of soil properties and population behavior within M sites was higher than within NM and both types of sites differed significantly in terms of heavy metal concentration as well as other physic-chemical parameters. The neutral genetic structure assessed with 10 nuclear microsatellite markers showed that populations were clustered according to their geographic location. Moreover, for the first time it was shown that NM populations might be founded from M populations. The selected genetic structure assessed in controlled conditions showed that NM populations are less tolerant and accumulated Zn to significantly higher concentration as compared to M populations. Nevertheless no relationship between traits was detected at the level of the plant individuals.

Les milieux métallifères d’origine anthropique sont des habitats particulièrement stressants pour les êtres vivants du fait des fortes concentrations en métaux lourds et des changements environnementaux profonds qui y sont présents. Certaines espèces, dites métallophytes, sont capables de se développer dans ces milieux extrêmes. Parmi ces espèces, les pseudométallophytes (qui peuvent se développer à la fois dans des sites pollués et dans des sites non pollués) constitue des modèles particulièrement intéressants pour étudier l’adaptation locale et l’influence des différences forces évolutives dans la différentiation phénotypique entre populations. Arabidopsis halleri est une espèce pseudométallophyte modèle pour l’étude de la tolérance et de l’hyperaccumulation des métaux du fait de sa proximité avec l’espèce prééminente A. thaliana. Des études préalables sur la tolérance et l’hyperaccumulation du zinc chez cette espèce ont suggéré une possible évolution des populations métallicoles sous l’effet des fortes concentrations en métaux. Notre objectif a donc été de mieux comprendre les mécanismes évolutifs prenant place dans ces populations. Pour cela nous avons proposé d’utiliser la génomique des populations ainsi que l’expérimentation en milieu contrôlé et ce à une échelle locale. Nous avons tout d’abord cherché des traces de sélection dans le génome de cette espèce par une approche de criblage génomique sur 820 marqueurs AFLP. Nous avons pu identifier des locus potentiellement sous sélection dans les populations métallicoles qui constituent de bons candidats pour l’adaptation aux sites métallifères. De manière intéressante, certains candidats sont spécifiques à des populations ce qui suggère une évolution convergente ou des pressions de sélection différentes entre les sites. Une partie de ces candidats a été cartographiée chez A. thaliana dans le but de définir des gènes candidats. Nous avons dans un deuxième temps cherché à comprendre l’influence des différentes forces évolutives dans la distribution de la tolérance au zinc chez A. halleri. La tolérance au zinc de populations a été caractérisée par des mesures morphologiques et physiologiques et l’influence de la sélection par une approche Qst/Fst. Nos résultats suggèrent que, pour les populations échantillonnées, la tolérance au zinc augmente dans les populations métallicoles sous l’effet de la sélection. Cette sélection s’exerçant potentiellement sur la variabilité présente dans les populations non métallicoles ancestrales. Enfin, la dernière partie de cette étude s’intéresse à l’association entre les génotypes et les phénotypes de la tolérance au zinc. / Due to the high concentration of heavy metals and the important environmental modifications, ecological conditions of metalliferous sites are very stressing for most organisms. A few plant species, coined “metallophyte”, have acquired the capacity to grow on heavy metal contaminated soils. Among this group, the pseudometallophyte species (able to grow on contaminated as well as on non contaminated soils) constitute highly relevant models to study local adaptation and relative influence of evolutionary forces in shaping phenotypic differentiation among populations The pseudometallophyte plant Arabidopsis halleri is a model species for tolerance and hyperaccumulation of heavy metal because it is a close relative of the pre-eminent species A. thaliana. Previous studies on heavy metal tolerance and hyperaccumulation of A. halleri suggested evolution of metallicolous populations in response to high level of metal exposure. In order to investigate the evolutionary processes in neighboring metallicolous and non-metallicous A. halleri populations, we adopted population genomics and phenotyping approaches. First we explored the A. halleri genome to detect signatures of directional selection. We performed a genome-wide scan analysis using 820 AFLP markers. We identified some loci potentially under selection in metallicolous populations that constitute high-quality candidates for general adaptation to metalliferous sites. Interestingly, some candidates were population specifics, suggesting the possibility of convergent evolution or existence of different selection pressure in the different sites. Some of these candidates were mapped on A. thaliana genome to identify candidate genes. Our second objective was to evaluate the contribution of selection versus other forces in shaping distribution of zinc tolerance in A. halleri. We measured morphological and physiological traits to estimate zinc tolerance and role of selection was inferred using Qst/Fst approach. Our results suggest that, in the sampled populations, zinc tolerance has been increased in metallicolous populations through selection on standing variation within local non-metallicolous ancestral populations. The last part of this study focuses on looking for a link between genotype and phenotype of zinc tolerance.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第20211号 / 理博第4296号 / 新制||理||1617(附属図書館) / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)教授 工藤 洋, 教授 髙林 純示, 教授 田村 実 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM

Mon travail de thèse porte sur la protéine AhPDF1 de la plante Arabidopsis halleri. AhPDF1 est une défensine de 51 résidus, riche en cystéines qui participe à la défense de la plante en jouant un rôle antifongique. La défensine AhPDF1 possède 8 cystéines impliquées dans ses 4 ponts disulfure, elle présente un repliement en CSαβ. Des travaux récents sur AhPDF1 ont permis d’identifier une nouvelle fonction : la tolérance aux métaux lourds, en particulier la tolérance au zinc. L’objectif général du projet dans lequel s’intègre ma thèse est donc de comprendre, au niveau atomique et en lien avec l’état d’oxydation des cystéines, le mécanisme par lequel les défensines de plantes confèrent la tolérance au zinc. Dans une majeure partie de ma thèse j’ai travaillé à la production de la défensine AhPDF1 d’abord dans Escherichia coli puis dans Pichia pastoris. J’ai ensuite mis au point la synthèse chimique de la protéine AhPDF1 et optimisé l’étape la plus délicate, celle du repliement oxydatif. Après avoir produit la défensine AhPDF1 en quantité et qualité suffisante, j’ai réalisé son étude structurale par RMN. De plus cette structure m’a servi de base pour modéliser, par homologie, toutes les autres défensines actuellement identifiées d’Arabidopsis halleri et Arabidopsis thaliana. Enfin, j’ai appris à maîtriser les conditions qui permettent de conserver la protéine dans un état partiellement réduit et j’ai réalisé les premiers essais de chélation de la défensine avec le zinc. / My thesis focuses on the AhPDF1 plant defensin from Arabidopsis halleri. AhPDF1 is a 51-residue, cysteine-rich protein involved in the plant defense, and playing an antifungal role. AhPDF1 defensin has eight cysteins involved in its four disulfide bridges, and presents a folding in CSαβ. Recent work on AhPDF1 allowed to identify a new function : the tolerance to heavy metals, especially zinc tolerance. The overall objective of the project that fits my thesis is to understand, at the atomic level and in relation to the oxidation state of cysteins, the mechanism by which the plant defensins confer zinc tolerance. In a major part of my thesis I worked on the production of AhPDF1 defensin first in Escherichia coli and in Pichia pastoris. Then, I developed the chemical synthesis of AhPDF1 and optimized the most delicate step of the oxidative folding. After producing AhPDF1 defensin in sufficient quantity and quality, I realized its structural study by NMR. Furthermore, this structure was used as starting structure, for modeling by homology all other defensins currently identified from Arabidopsis halleri and Arabidopsis thaliana. Finally, I learnt how to master the conditions that maintain the protein in a partially reduced state in order to achieve the first assay of zinc chelation with defensin.

Analyse génétique de la tolérance au cadmium dans l'espèce Arabidopsis halleri: contribution du CAX1Résumé de la thèseDans les milieux contaminés par les excès en éléments traces métalliques, de rares plantes peuvent accumuler ces éléments a de très fortes concentrations sans symptômes de toxicité. Parmi elles, Arabidopsis halleri, proche parente d' A. thaliana, hyperaccumule le Zn et le Cd. C’est une espèce modèle pour étudier l'homéostasie métallique et l'adaptation aux environnements extrêmes. Alors qu’un ensemble de mécanismes moléculaires permettent d’expliquer l’hyperaccumulation de Zn, la compréhension de la tolérance et de l’accumulation du Cd est bien moins connue. Une analyse de liaison génétique dans A. halleri a permis d'identifier un locus de caractère quantitatif (QTL) majeur co-localisant avec HMA4 et deux autres QTL. HMA4 codant pour une pompe a métaux, impliquée dans la translocation du Cd des racines a la partie aérienne et dans la distribution de ce métal dans les feuilles, a pu être validé par ARN interférence.L'objectif de ce projet est de contribuer a la compréhension de la tolérance au Cd dans A. halleri en identifiant de nouveaux déterminants génétiques.Par cartographie fine, CAX1, codant pour un antiport calcium/proton, a été identifié comme gène candidat pour le second QTL majeur impliqué dans la tolérance au Cd dans A. halleri.Les analyses d’expression de CAX1 dans trois espèces d’Arabidopsis, tolérantes ou sensibles au Cd, et dans la descendance de croisements entre A. halleri et l’espèce sensible A. lyrata, l’étude d’un mutant «knock-out» dans Arabidopsis et des analyses biochimiques ont confirmé l’implication de CAX1 dans la tolérance au cadmium. En séquestrant le calcium dans la vacuole, CAX1 participe a limiter l’accumulation des espèces réactives de l’oxygène (ROS) induite par un excès de Cd et a limiter la toxicité du Cd. Ce rôle est observable lorsque les plantes sont cultivées a basse concentration de calcium. A plus hautes concentrations de calcium, l’expression de CAX1 est induite dans les trois espèces étudiées et ne présente plus de difference entre A. halleri et A. lyrata. En accord avec ce résultat, la detection du locus de caractère quantitatif co-localisant avec CAX1 disparaît lorsque la concentration de calcium augmente dans le milieu. Néanmoins, le rôle de CAX1 dans la tolérance aux stress oxydatifs est observable quelle que soit la concentration en calcium utilisée.L’ensemble des résultats soutiennent un rôle encore inexploré de CAX1 dans les plantes. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第19536号 / 理博第4196号 / 新制||理||1602(附属図書館) / 32572 / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)教授 工藤 洋, 教授 田村 実, 教授 石田 厚 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第19917号 / 理博第4217号 / 新制||理||1606(附属図書館) / 33003 / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)教授 工藤 洋, 教授 長谷 あきら, 教授 鹿内 利治 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM