L'oxydation des résidus cystéines est une modification biochimique très répandue survenant dans tous les compartiments des cellules eucaryotes. Ce phénomène sert le repliement oxydatif des protéines dans le réticulum endoplasmique (RE), l'importation de protéines dans l'espace intermembranaire de la mitochondrie (IMS). De plus, il a un rôle régulateur dans la matrice mitochondriale et dans le cytosol où il contrôle l’activité des enzymes et des protéines de signalisation et de régulation. Dans tous ces procédés, la réversibilité de l'oxydation des résidus Cys est une caractéristique essentielle. Deux systèmes oxydoréductase puissants existent : les voies de glutathion (GSH) et la thiorédoxine ; ils catalysent la réduction des ponts disulfure, et contrôlent la plupart des processus cellulaires thiol-redox dépendant. Cependant, en dépit d'énormes connaissances portant sur leur enzymologie, peu est connu sur les caractéristiques physiologiques de ces systèmes chez les eucaryotes. Pour déterminer l'importance physiologique de ces systèmes et indiquer lequel est à la base de l'exigence du GSH pour la viabilité, nous avons effectué une analyse complète des cellules de levure épuisée ou contenant des niveaux toxiques de GSH. Les deux conditions déclenchent une réponse « iron-starvation-like » et une altération de l'activité des enzymes d’assemblage des centres fer-soufre (Iron sulfure cluster : ISC) extra-mitochondriales. Cependant, elles n’ont pas d'impact sur l’entretien thiol redox, à l’exception des niveaux élevés de glutathion qui ont altéré le repliement oxydatif des protéines dans le reticulum endoplasmique. Alors que le fer sauve partiellement la maturation des ISC et les défauts de croissance des cellules appauvries eh GSH, des expériences génétiques ont indiqué que, contrairement à la thiorédoxine, le glutathion ne peut pas assurer par lui-même les fonctions thiol-redox de la cellule. Nous proposons que le glutathion soit essentiel par son exigence dans l’assemblage des centres fer-soufre, mais ne serve comme backup que pour maintenir l’état thiol-redox de la cellule. Des niveaux physiologiques élevés de GSH sont ainsi destinés à isoler sa fonction dans le métabolisme du fer des variations de sa concentration pendant le stress redox, ce qui constitue un modèle contestant la vision traditionnelle du GSH comme acteur primordial du contrôle thiol-redox cytosolique.Nos données préliminaires sur la distribution de GSH dans les cellules recueillies par lasurveillance de l'état redox de rxYFP ciblée pour différents compartiments cellulaires (RE,Matrice, cytosol et IMS) dans les cellules HGT1 indiquent un transport spécifique du GSH vers le RE et l'exportation de GSSG de ce compartiment. Nous avons pu caractériser deuxtransporteurs ABC dont la suppression modifie le RE plus oxydant et entraîne une accumulation de GSSG par rapport aux cellules sauvages. Ces données ont été confirmées par le suivi de l'état redox de PDI1 et ERO1 (WT et hyper active). Elles suggèrent un rôle de ces transporteurs dans l'exportation du GSSG du la RE, et que le flux de GSH entre les différents compartiments est très régulé. / Cys residue oxidation is a widespread biochemical modification occurring in all eukaryotic cells compartments. It serves oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum (ER), protein import in the intermembrane space of mitochondria (IMS), and it has a regulatory role in the mitochondrial matrix and in the cytosol where it controls enzymes and signaling regulatory proteins activity. In all these processes, reversibility of Cys residue oxidation is a crucial feature. Two potent oxidoreductase systems, the glutathione (GSH) and thioredoxin pathways, catalyze disulfide bond reduction, and presumably control most thiol-redox-dependent cellular processes. However, despite tremendous knowledge of their enzymology, little is known about the physiological features of these systems in eukaryotes. To determine the physiologic importance of these functions and sort out which of them accounts for the GSH requirement for viability, we performed a comprehensive analysis of yeast cells depleted of or containing toxic levels of GSH. Both conditions triggered an intense iron-starvation-like response and impaired the activity of extra-mitochondrial ISC enzymes, but did not impact thiol-redox maintenance, except high glutathione levels that altered oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. While iron partially rescued the ISC maturation and growth defects of GSH-depleted cells, genetic experiments indicated that unlike thioredoxin, glutathione could not support by itself the thiolredox duties of the cell. We propose that glutathione is essential by its requirement in ISC assembly but only serves as a thioredoxin back up in cytosolic thiol-redox maintenance. Glutathione high physiologic levels are thus meant to insulate its function in iron metabolism from variations of its concentration during redox stresses, a model challenging the traditional view of it as prime actor in cytosolic thiol-redox control.Our preliminary data on the distribution of GSH inside cells collected by monitoring the redox state of rxYFP targeted to different cell compartments (ER, Matrix, Cytosol and IMS) in HGT1 cells indicate a specific transport of GSH into the ER and export of GSSG out of it. We were able to characterize two ABC transporters on which their deletion modify the redox state of the ER to more oxidizing and result in accumulation of higher GSSG content compared to WT. These data were confirmed by looking to the redox state of the PDI1 and ERO1 (WT and hyper active), all together suggest a role of these transporters in GSSG export from the ER, and that GSH flux between the different compartments is highly regulated.

Mon travail de thèse porte sur la protéine AhPDF1 de la plante Arabidopsis halleri. AhPDF1 est une défensine de 51 résidus, riche en cystéines qui participe à la défense de la plante en jouant un rôle antifongique. La défensine AhPDF1 possède 8 cystéines impliquées dans ses 4 ponts disulfure, elle présente un repliement en CSαβ. Des travaux récents sur AhPDF1 ont permis d'identifier une nouvelle fonction : la tolérance aux métaux lourds, en particulier la tolérance au zinc. L'objectif général du projet dans lequel s'intègre ma thèse est donc de comprendre, au niveau atomique et en lien avec l'état d'oxydation des cystéines, le mécanisme par lequel les défensines de plantes confèrent la tolérance au zinc. Dans une majeure partie de ma thèse j'ai travaillé à la production de la défensine AhPDF1 d'abord dans Escherichia coli puis dans Pichia pastoris. J'ai ensuite mis au point la synthèse chimique de la protéine AhPDF1 et optimisé l'étape la plus délicate, celle du repliement oxydatif. Après avoir produit la défensine AhPDF1 en quantité et qualité suffisante, j'ai réalisé son étude structurale par RMN. De plus cette structure m'a servi de base pour modéliser, par homologie, toutes les autres défensines actuellement identifiées d'Arabidopsis halleri et Arabidopsis thaliana. Enfin, j'ai appris à maîtriser les conditions qui permettent de conserver la protéine dans un état partiellement réduit et j'ai réalisé les premiers essais de chélation de la défensine avec le zinc.

Mon travail de thèse porte sur la protéine AhPDF1 de la plante Arabidopsis halleri. AhPDF1 est une défensine de 51 résidus, riche en cystéines qui participe à la défense de la plante en jouant un rôle antifongique. La défensine AhPDF1 possède 8 cystéines impliquées dans ses 4 ponts disulfure, elle présente un repliement en CSαβ. Des travaux récents sur AhPDF1 ont permis d’identifier une nouvelle fonction : la tolérance aux métaux lourds, en particulier la tolérance au zinc. L’objectif général du projet dans lequel s’intègre ma thèse est donc de comprendre, au niveau atomique et en lien avec l’état d’oxydation des cystéines, le mécanisme par lequel les défensines de plantes confèrent la tolérance au zinc. Dans une majeure partie de ma thèse j’ai travaillé à la production de la défensine AhPDF1 d’abord dans Escherichia coli puis dans Pichia pastoris. J’ai ensuite mis au point la synthèse chimique de la protéine AhPDF1 et optimisé l’étape la plus délicate, celle du repliement oxydatif. Après avoir produit la défensine AhPDF1 en quantité et qualité suffisante, j’ai réalisé son étude structurale par RMN. De plus cette structure m’a servi de base pour modéliser, par homologie, toutes les autres défensines actuellement identifiées d’Arabidopsis halleri et Arabidopsis thaliana. Enfin, j’ai appris à maîtriser les conditions qui permettent de conserver la protéine dans un état partiellement réduit et j’ai réalisé les premiers essais de chélation de la défensine avec le zinc. / My thesis focuses on the AhPDF1 plant defensin from Arabidopsis halleri. AhPDF1 is a 51-residue, cysteine-rich protein involved in the plant defense, and playing an antifungal role. AhPDF1 defensin has eight cysteins involved in its four disulfide bridges, and presents a folding in CSαβ. Recent work on AhPDF1 allowed to identify a new function : the tolerance to heavy metals, especially zinc tolerance. The overall objective of the project that fits my thesis is to understand, at the atomic level and in relation to the oxidation state of cysteins, the mechanism by which the plant defensins confer zinc tolerance. In a major part of my thesis I worked on the production of AhPDF1 defensin first in Escherichia coli and in Pichia pastoris. Then, I developed the chemical synthesis of AhPDF1 and optimized the most delicate step of the oxidative folding. After producing AhPDF1 defensin in sufficient quantity and quality, I realized its structural study by NMR. Furthermore, this structure was used as starting structure, for modeling by homology all other defensins currently identified from Arabidopsis halleri and Arabidopsis thaliana. Finally, I learnt how to master the conditions that maintain the protein in a partially reduced state in order to achieve the first assay of zinc chelation with defensin.