Les viroïdes sont des agents pathogènes subviraux qui infectent des plantes importantes en agriculture. Jusqu’à aujourd’hui, une trentaine d’espèces ont été découvertes. Celles-ci sont composées d’un brin d’ARN circulaire de longueur variant selon l'espèce de 245 à 400 nucléotides qui ne codent pour aucune protéine. Chaque viroïde dépend de sa structure pour interagir avec son hôte et effectuer toutes les étapes de son cycle biologique. Il est donc de la plus haute importance de bien la connaître. À ce jour, la plupart des études présentent la structure des viroïdes par une prédiction bio-informatique. Au début de mes études, les structures de seulement deux viroïdes étaient connues en solution. Leurs structures avaient été étudiées par cartographie enzymatique ou chimique, cependant ces techniques sont longues et fastidieuses. Malgré cela, des motifs importants et non prédits par les prédictions bio-informatiques ont été découverts. Ces résultats ont renforcé la nécessité de découvrir la structure des viroïdes en solution. C’est pour cette raison que la structure de chaque espèce de viroïdes a été étudiée dans cette thèse. Pour relever ce défi, la technique de SHAPE a été adaptée pour la cartographie rapide et précise des viroïdes. L’efficacité de la technique a été confirmée en comparant les résultats obtenus par SHAPE avec ceux des viroïdes étudiés précédemment. Par la suite, les deux polarités de toutes les espèces de la famille des Avsunviroidae ont été caractérisées. De plus, les structures des membres de la seconde famille de viroïdes nommée Pospiviroidae ont aussi été étudiées. En dernier lieu, lors d'infections virales chez la plante, des particules à ARN circulaire et simple brin peuvent co-infecter les plantes avec certains virus ; ce sont des ARN satellites. Étant très semblables aux viroïdes, deux représentants ont été étudiés afin de comparer leurs structures à celles des viroïdes. Chaque ARN cartographié en solution a précisé de façon non négligeable le modèle de la structure secondaire par rapport à ceux proposés par la prédiction bio-informatique seule. De plus, des motifs tertiaires ont aussi été trouvés pour quelques-uns de ces ARN. L’ensemble du travail a aussi permis de proposer des améliorations à la classification des viroïdes et de classer de nouvelles espèces. Pour terminer, ce compendium de structures des viroïdes servira de point de départ pour étudier les motifs structuraux importants pour leur biologie.

Du fait de la complexité du repliement de l'ARN en général et des mécanismes impliqués dans ce processus, il est actuellement impossible de prédire la structure tridimensionnelle et encore moins le chemin réactionnel d'un ARN en se basant uniquement sur sa séquence primaire. Ces deux questions fondamentales doivent être adressées pour comprendre ce qui se passe dans une cellule et pouvoir un jour être capable de créer de novo des molécules d'ARN avec une structure et une activité précise. L'objectif de ce travail est de mieux comprendre les forces permettant d'obtenir une structure tridimensionnelle et les mécanismes impliqués dans le chemin réactionnel d'un ARN modèle hautement structuré: le ribozyme de l'hépatite D humaine (ribozyme HDV). L'idée est que s'il est possible de comprendre dans les moindres détails une structure complexe, ces informations pourront être utilisées pour la prédiction de structures plus simples. Premièrement, il s'agit de trouver quels sont les changements conformationnels du chemin réactionnel et dans quel ordre ils ont lieu. Une fois le chemin réactionnel connu, il devient possible de générer des mutants formant des intermédiaires stables entre chaque changement conformationnel. L'étude thermodynamique de ces mutants permet de dresser le profil énergétique du chemin réactionnel. Finalement, la modélisation permet de suivre l'évolution de la structure tertiaire et ainsi vérifier différentes hypothèses. Ensemble, ces approches ont permis de comprendre comment le ribozyme HDV atteint sa structure tridimensionnelle, quel chemin réactionnel il emprunte et quelle est l'étape limitante.

Les viroïdes sont de petites molécules d'ARN simple-brins circulaires qui infectent les plantes et induisent une variété de symptômes.Les viroïdes ne codent pour aucune protéine, mais possèdent une structure secondaire complexe qui leur permet d'accomplir différentes fonctions et d'interagir avec diverses composantes de leur hôte. Pour compléter leur cycle de réplication, les viroïdes doivent nécessairement interagir avec des protéines de leur hôte. Quelques protéines ont déjà été identifiées pour se lier à certains viroïdes. Toutefois, avant le début de mes études aucune protéine n'était connue pour interagir avec le viroïde de la mosaïque latente du pêcher (PLMVd). Notre laboratoire s'intéresse justement au PLMVd, un viroïde de la famille des Avsunviroidae qui se répliquent à l'intérieur des chloroplastes des plantes de pêcher infectés. Ce viroïde se réplique plus précisément par un mécanisme en cercle-roulant symétrique, ce qui implique que ses deux polarités utilisent exactement le même mécanisme et possèdent donc plusieurs caractéristiques similaires. Toutefois, quelques légères différences biochimiques avaient été recensées entre les deux polarités. Par le passé, l'équipe de notre laboratoire a déterminé la structure secondaire de la polarité positive à l'aide de différentes techniques. Afin de comparer les deux polarités, il devenait important de procéder à l'analyse de la structure secondaire de la polarité négative. Grâce à cette étude, des similitudes et des différences entre les deux ont pu être localisées. Ces résultats seront essentiels pour la poursuite de plusieurs études sur PLMVd. Par exemple, cette structure sera certainement utile pour étudier la liaison de différents partenaires protéiques ainsi que pour l'analyse des petits ARN interférents provenant de PLMVd. Une analyse plus approfondie de la structure secondaire et tertaire des deux polarités de PLMVd a été amorcée par la méthode d'acylation sélective de l'hydroxyle de l'ARN analysée par extension d'amorce (SHAPE). Cette étude a permis de comparer la structure de deux variants et a permis d'identifier de nouveaux motifs, tel qu'un cruciforme à l'intérieur de la tige P11 et un pseudonoeud entre les boucles L1 et L11. Une analyse informatique de toutes les séquences connues de PLMVd a été réalisée et a permis de vérifier le potentiel de ce pseudonoeud pour tous les variants de PLMVd. Par la suite, une étude sur des interactions possibles entre PLMVd et des protéines provenant de feuilles de pêcher a été entreprise. Lors de cette recherche, différentes méthodes de détection des interactions ARN-protéine ont été utilisées, certaines sans succès. L'approche faisant appel à des hybridations de type northwestern fut profitable et permis d'identifier quelques protéines cellulaires capables d'interagir avec PLMVd. La caractérisation de certaines interactions a par la suite été réalisée pour permettre de mieux définir la liaison du facteur d'élongation 1-alpha (eEF1A) sur PLMVd. Finalement, différents projets satellites ont été initiés et concernent l'implication de certains éléments de structure de PLMVd in vivo. Ils seront décrits au dernier chapitre. Ces travaux ont été réalisés en collaboration avec un groupe de recherche de Belgique et ont mené à l'inoculation de plusieurs mutants de PLMVd.

Le virus de l'hépatite delta humaine (VHD) est un petit virus d'ARN circulaire qui infecte plus de 15 millions d'individus à travers le monde. Ce virus code pour un seul ARN messager (ARNm) et celui-ci génère deux isoformes de l'antigène delta (HDAg), des protéines essentielles au VHD. Le ribozyme delta reconnaît son substrat d'ARN par appariement de paires de bases et la séquence reconnue est : une pyrimidine, suivie d'une guanosine et de six autres nucléotides (PyGN[indice inférieur 6]). Il est théoriquement possible de modifier le domaine de reconnaissance du substrat du ribozyme delta afin d'inactiver n'importe quel substrat d'ARN portant le PyGN[indice inférieur 6]. Le ribozyme delta et d'autres ribozymes possèdent donc un potentiel thérapeutique énorme pour l'inactivation d'ARN indésirables tels que les ARN viraux ou oncogènes. L'objectif de ce projet de recherche est de développer des ribozymes delta qui inactivent l'ARNm du VHD et d'approfondir les connaissances sur la spécificité de reconnaissance du substrat par le ribozyme delta."--Résumé abrégé par UMI.

La pause transcriptionnelle marquée par les ARN polymérases (RNAP) est un mécanisme clé pour réguler l'expression des gènes dans tous les règnes de la vie et est une condition préalable à la terminaison de la transcription. Le facteur de transcription bactérien essentiel NusA stimule à la fois la pause et la terminaison de la transcription, jouant ainsi un rôle central. Ici, je présente des reconstructions par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à une seule particule de NusA lié à des complexes d'élongation en présence et en absence d’ARN en épingle à cheveux dans le canal de sortie de l'ARN. Les structures révèlent quatre interactions entre NusA et RNAP qui suggèrent comment NusA stimule le repliement de l’ARN, la pause et la terminaison de la transcription. Un intermédiaire de translocation asymétrique de l'ARN et de l'ADN convertit le site actif de l'enzyme en un état inactif, fournissant une explication structurelle pour l'inhibition de la catalyse. La comparaison de RNAP à différentes étapes de la mise en pause donne un aperçu de la nature dynamique du processus et du rôle de NusA en tant que facteur de régulation. / Transcriptional pausing by RNA polymerases (RNAPs) is a key mechanism to regulate gene expression in all kingdoms of life and is a prerequisite for transcription termination. The essential bacterial transcription factor NusA stimulates both pausing and termination of transcription, thus playing a central role. Here, I present single-particle electron cryo-microscopy (cryo-EM) reconstructions of NusA bound to paused elongation complexes with and without a pause-enhancing hairpin in the RNA exit channel. The structures reveal four interactions between NusA and RNAP that suggest how NusA stimulates RNA folding, pausing, and termination. An asymmetric translocation intermediate of RNA and DNA converts the active site of the enzyme into an inactive state, providing a structural explanation for the inhibition of catalysis. Comparing RNAP at different stages of pausing provides insights on the dynamic nature of the process and the role of NusA as a regulatory factor.

La mise en évidence des mécanismes de sélection agissant sur les données génomiques structurées (ARN, Protéines, ADN...) nécessite l'élaboration de modèles de séquences. Une fois un tel modèle élaboré, il est possible, au prix d'une analyse mathématique parfois complexe ou par le biais de la<br />génération aléatoire, d'évaluer la significativité d'un phénomène observé. Tout d'abord, nous nous intéressons aux propriétés des grammaires pondérées, un formalisme particulièrement adapté à la modélisation de la structure des ARN, dérivant des algorithmes de génération aléatoire efficaces implémentés au sein du prototype GenRGenS. Nous abordons le calcul automatique des pondérations réalisant des valeurs observées pour les paramètres du modèle, ainsi qu'une implémentation basée sur une approche optimisation. Dans un second temps, nous abordons la modélisation de la structure secondaire d'ARN. Après quelques rappels de biologie moléculaire, nous proposons plusieurs modèles basés sur des grammaires pondérées permettant la génération de structures d'ARN réalistes. L'utilisation d'un algorithme d'optimisation permet le calculer des pondérations correspondant à certaines familles d'ARN. Nous proposons enfin un algorithme d'extraction de structure secondaire maximale dans une structure générale, qui permet de profiter des données récentes issues de la cristallographie. Le dernier chapitre de cette thèse s'intéresse à l'analyse d'un algorithme de recherche de similarité heuristique, dont la sensibilité s'avère étroitement liée à la probabilité de présence d'un motif au sein de marches aléatoires particulières, les chemins culminants. Ces marches restent positives, et atteignent une altitude maximale en leur dernier pas. Nous proposons un algorithme récursif de génération aléatoire pour ces chemins. En combinant des techniques issues de la combinatoire énumérative, l'analyse asymptotique et la théorie des langages, nous dérivons des algorithmes de génération aléatoire par rejet linéaires dans de nombreux cas.

Le ribozyme VS de Neurospora catalyse des réactions de clivage et de ligation d’un lien phosphodiester spécifique essentielles à son cycle de réplication. Il est formé de six régions hélicales (I à VI), qui se divisent en deux domaines, soit le substrat (SLI) et le domaine catalytique (tiges II à VI). Ce dernier comprend deux jonctions à trois voies qui permettent de reconnaître le substrat en tige-boucle de façon spécifique. Ce mode de reconnaissance unique pourrait être exploité pour cibler des ARN repliés pour diverses applications. Bien que le ribozyme VS ait été caractérisé biochimiquement de façon exhaustive, aucune structure à haute résolution du ribozyme complet n’a encore été publiée, ce qui limite la compréhension des mécanismes inhérents à son fonctionnement. Précédemment, une approche de divide-and-conquer a été initiée afin d’étudier la structure des sous-domaines importants du ribozyme VS par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) mais doit être complétée. Dans le cadre de cette thèse, les structures de la boucle A730 et des jonctions III-IV-V et II-III-VI ont été déterminées par spectroscopie RMN hétéronucléaire. De plus, une approche de spectroscopie RMN a été développée pour la localisation des ions divalents, tandis que diverses approches de marquage isotopique ont été implémentées pour l’étude d’ARN de plus grandes tailles. Les structures RMN de la boucle A730 et des deux jonctions à trois voies révèlent que ces sous-domaines sont bien définis, qu’ils sont formés de plusieurs éléments structuraux récurrents (U-turn, S-turn, triplets de bases et empilement coaxial) et qu’ils contiennent plusieurs sites de liaison de métaux. En outre, un modèle du site actif du ribozyme VS a été construit sur la base des similarités identifiées entre les sites actifs des ribozymes VS et hairpin. Dans l’ensemble, ces études contribuent de façon significative à la compréhension de l’architecture globale du ribozyme VS. De plus, elles permettront de construire un modèle à haute résolution du ribozyme VS tout en favorisant de futures études d’ingénierie. / The Neurospora VS ribozyme catalyzes the cleavage and the ligation of a specific phosphodiester bond, which is essential for its replication cycle. It is formed of six helical regions (I to VI) that are divided in two domains: the substrate (SLI) and the catalytic domain (stems II-VI). The latter contains two three-way junctions that allow recognition of the stem-loop substrate in a specific manner. This unique mode of substrate recognition could be exploited to target folded RNAs for diverse applications. Even though the VS ribozyme has been extensively characterized biochemically, no high-resolution structure of the complete ribozyme has been published yet and this limits our mechanistic understanding. A divide-and-conquer approach was previously initiated to study the structure of the important subdomains of the VS ribozyme by nuclear magnetic resonance (NMR), but this approach needs to be completed. In this thesis, the structures of the A730 loop, the III-IV-V junction and the II-III-VI junction were determined by heteronuclear NMR spectroscopy. Moreover, a unique NMR approach was developed for localizing divalent metal ions, whereas several isotope-labeling strategies were implemented to facilitate the study or large RNA molecules. The NMR structures of the A730 loop and the two three-way junctions reveal that these subdomains are well defined, that they are formed by several recurrent structural elements (U-turn and S-turn motifs, base triples and coaxial stacking) and that they contain several metal-binding sites. Interestingly, structural similarities were identified between the VS and hairpin ribozymes, which allowed the modeling of the VS ribozyme active site. In summary, these studies significantly contribute to a better understanding of the global architecture of the VS ribozyme. In addition, they will allow the construction of a high-resolution model of the complete VS ribozyme and facilitate future engineering studies.