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Étude du chemin réactionnel du ribozyme de l'hépatite D humaine

Reymond, Cédric January 2009 (has links)
Du fait de la complexité du repliement de l'ARN en général et des mécanismes impliqués dans ce processus, il est actuellement impossible de prédire la structure tridimensionnelle et encore moins le chemin réactionnel d'un ARN en se basant uniquement sur sa séquence primaire. Ces deux questions fondamentales doivent être adressées pour comprendre ce qui se passe dans une cellule et pouvoir un jour être capable de créer de novo des molécules d'ARN avec une structure et une activité précise. L'objectif de ce travail est de mieux comprendre les forces permettant d'obtenir une structure tridimensionnelle et les mécanismes impliqués dans le chemin réactionnel d'un ARN modèle hautement structuré: le ribozyme de l'hépatite D humaine (ribozyme HDV). L'idée est que s'il est possible de comprendre dans les moindres détails une structure complexe, ces informations pourront être utilisées pour la prédiction de structures plus simples. Premièrement, il s'agit de trouver quels sont les changements conformationnels du chemin réactionnel et dans quel ordre ils ont lieu. Une fois le chemin réactionnel connu, il devient possible de générer des mutants formant des intermédiaires stables entre chaque changement conformationnel. L'étude thermodynamique de ces mutants permet de dresser le profil énergétique du chemin réactionnel. Finalement, la modélisation permet de suivre l'évolution de la structure tertiaire et ainsi vérifier différentes hypothèses. Ensemble, ces approches ont permis de comprendre comment le ribozyme HDV atteint sa structure tridimensionnelle, quel chemin réactionnel il emprunte et quelle est l'étape limitante.
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When mRNA folding rules gene expression : lessons from type I toxin-antitoxin systems / Lorsque le repliement de l’ARNm gouverne l’expression des gènes : leçons tirées des systèmes toxine-antitoxine de type I

Masachis Gelo, Sara 18 October 2018 (has links)
Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont de petits modules génétiques largement présents dans les génomes bactériens. Ils codent pour une petite protéine toxique et une antitoxine. Ils sont classés en six types en fonction de la nature et du mode d'action de l'antitoxine. Ce travail a porté sur l'étude du type I, pour lequel l'antitoxine est un ARN antisens qui cible l'ARNm de la toxine afin de réprimer son expression. Au cours de cette thèse, nous avons étudié le système aapA3/IsoA3, codé sur le chromosome du pathogène gastrique humain Helicobacter pylori. À ce jour, la plupart des systèmes TA ont été étudiés à l'aide de systèmes d'expression artificiels, qui ne permettent pas de caractériser la régulation transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle. En utilisant la létalité induite par l’expression chromosomique de la toxine obtenue en absence d’antitoxine, nous avons développé une sélection génétique de mutants suppresseurs révélés par séquençage haut-débit. Cette approche, appelée FASTBAC-Seq, nous a permis de cartographier une myriade de déterminants de toxicité localisés dans les régions codantes et non codantes du gène de la toxine AapA3. En particulier, certaines de ces mutations ont révélé l'existence de tige-boucles ARN transitoires qui agissent de manière co-transcriptionnelle pour empêcher l'initiation de la traduction pendant la synthèse de l'ARNm codant pour la toxine. Ces structures ARN métastables fonctionnelles sont nécessaires pour découpler les processus de transcription et de traduction et permettent la présence de ces gènes toxiques sur le chromosome bactérien. Bien que les ARNm non traduits deviennent rapidement instables, nos travaux ont également révélé l'existence de deux tige-boucles protectrices situées aux deux extrémités de l'ARNm. Ces structures secondaires empêchent des activités exonucléolytiques agissant en 5' et 3'. Dans l’ensemble, notre travail met en évidence les conséquences de la forte pression de sélection pour limiter l'expression des toxines sous laquelle évoluent les systèmes TA. Cela nous a permis de mieux comprendre l’influence du repliement secondaire des ARNm, non seulement lors de la régulation posttranscriptionnelle, mais aussi co-transcriptionnelle de l’expression de cette famille particulière de gènes. Ces caractéristiques de régulation basées sur l'ARN peuvent être exploitées à l'avenir pour des applications biotechnologiques (p. ex., production accrue de protéines par stabilisation d'ARNm) ou biomédicales (p.ex., développement de stratégies antimicrobiennes alternatives pour l'activation de la synthèse de toxines). / Toxin-antitoxin (TA) systems are small genetic modules widely present in bacterial genomes. They usually code for a small toxic protein and its cognate antitoxin and can be classified into six types depending on the nature and mode of action of the antitoxin. This work focuses on the study of type I, for which the antitoxin is an antisense RNA that targets the toxin mRNA to inhibit its expression. We characterized the aapA3/IsoA3 system, encoded on the chromosome of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. To date, most TAs have been studied using artificial expression systems, which do not allow the characterization of transcriptional or post-transcriptional regulation. Taking advantage of the lethality induced by the toxin chromosomal expression in the absence of antitoxin, we developed a high-throughput genetic selection of suppressor mutations revealed by Next-Generation Sequencing. This approach, named FASTBAC-Seq, allowed us to map a myriad of toxicity determinants located in both, coding and noncoding regions, of the aapA3 toxic gene. More precisely, some suppressor mutations revealed the existence of transient RNA hairpins that act co-transcriptionally to prevent translation initiation while the toxinencoding mRNA is being made. Such functional RNA metastable structures are essential to uncouple the transcription and translation processes and allow the presence of these toxic genes on bacterial chromosomes. Although untranslated mRNAs become rapidly unstable, our work also revealed the presence of two protective stem-loops located at both mRNA ends that prevent from both, 5’ and 3’ exonucleolytic activity. Altogether, our work evidenced the consequences of the strong selection pressure to silence toxin expression under which the TAs evolve, and highlighted the key role of mRNA folding in the co- and post-transcriptional regulation of this family of genes. These RNA-based regulatory mechanisms may be exploited in the future for biotechnological (e.g., increased protein production through mRNA stabilization) or biomedical (e.g., development of alternative antimicrobial strategies aiming at the activation of toxin synthesis) applications.

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