Legionella pneumophila est responsable d'une forme de pneumonie, la legionellose ou de maladie du légionnaire. Entre 2012 et 2015, les cas annuels ont grimpé de 5848 à 7069 en Europe, la France, l’Allemagne, l’Italie et l’Espagne correspondant à 69% du total. De façon inquiétante, la mortalité était de 8,2% faisant de cette maladie un réel enjeu de santé publique. Un facteur de virulence produit par cette bactérie est la protéine RtxA (~700 kDa) de la famille des protéines RTX (Repeats in ToXin) sécrétée via un système de sécrétion de type 1. Dans ce travail, in vitro, la protéase périplasmique LapG clive la partie N-terminale de RtxA au sein d'un motif di-alanine (position 108-109). La construction de mutants déficients dans l’expression de LapG et LapD a révélé une localisation de RtxA sous le contrôle de ces deux protéines, mécanisme semblable au modèle LapA décrit chez P. fluorescens. Un mutant lapG maintient RtxA à la surface de cellules, à l’opposé d’un mutant ?lapD. Nous avons identifié des systèmes homologues T1SS/LapDG dans de nombreuses espèces Legionella ainsi que d’autres gammaproteobactéries. Concernant la virulence de L. pneumophila, les mutants déficients pour le T1SS (lssBD/tolC) étaient plus altérés dans leur virulence que des mutants du système LapDG. Nous avons également montré, grâce à des expériences de compétition, que L. pneumophila semble cibler les cellules hôtes via la protéine RtxA. L’utilisation d’anticorps spécifiques anti-RtxA nous a permis de détecter RtxA à la surface des cellules hôtes, mais aussi de réduire de la virulence de L. pneumophila, suggérant un rôle important de RtxA lors du processus d’infection, bien que non limitant / Legionella pneumophila is the causative agent of a form of pneumonia called legionellosis or Legionnaires’ disease. Between 2012 and 2015, the reported European cases of legionellosis increased from 5,848 to 7,069 cases per year where France, Germany, Italy and Spain accounted for 69% of the reported cases. Worryingly, the case fatality of incidents was 8.2% making this disease a considerable health concern. One virulence factor produced by this bacterium is a large protein (~700 kDa) belonging to the RTX (Repeats in ToXin) family called RtxA secreted by the type 1 secretion system. The hereby work reveals that, in vitro, LapG periplasmic protease cleaves RtxA N-terminus in the middle of a di-alanine motif (a.a. 108-109). We also show using lapG and lapD mutant strains, that RtxA release is controlled by these two proteins similar to Pseudomonas fluorescenes LapA. We observed that a strain lacking LapG protease maintains RtxA on the cell surface, while a strain lacking LapD does not exhibit cell surface RtxA. Interestingly, we identified the presence of homologous potential T1SS/LapDG systems in many Legionella species and other Gammaproteobacteria. Regarding L. pneumophila virulence, our work showed that mutants for L. pneumophila T1SS (lssBD/tolC) were more disruptive to its virulence than lapG/lapD mutants. We also hypothesize, by challenging infection, that L. pneumophila might be actively targeting its host via RtxA. Additionally, by observing rtxA mutants as well as detecting RtxA on host surface briefly after inoculation and attenuating virulence by using anti RtxA antibodies, we assume an important but not limiting role for this protein in the infection process

Mycobacterium abscessus est une mycobactérie à croissance rapide, et un pathogène opportuniste responsable d’infections pulmonaires notamment chez les patients atteints de la mucoviscidose, et d’infections cutanéomuqueuses. La source de contamination pourrait être environnementale mais des contaminations interhumaines ne sont pas exclues. Les amibes environnementales pourraient jouer un rôle de réservoir. M. abscessus est capable de résister aux mécanismes de défense bactéricides des phagocytes environnementaux et humains. Le génome complet de M. abscessus a été séquencé mettant en évidence de nombreux facteurs de virulence non mycobactériens. Certains sont des facteurs de virulence connus dans le monde bactérien, comme la phospholipase C ou le facteur de captation du magnésium MgtC. Ces facteurs ont été montré induits en présence d’amibes, mais ne peuvent à eux seuls expliquer la survie intracellulaire et la virulence de M. abscessus. Nous avons donc, au cours de ce projet, criblé une banque de mutants générée par transposition chez M. abscessus, à la recherche de mutants dénués de croissance intracellulaire en amibes et macrophages. Cette approche a permis d’identifier, de façon majeure, 5 gènes du locus ESX-4 de M. abscessus codant un système de sécrétion de type VII avec tous ces composants cœur conservés. Pour mieux comprendre la contribution d’ESX-4 dans la survie intracellulaire de M. abscessus, un mutant obtenu par double recombinaison au sein du gène eccB4 dans la souche type de M. abscessus (ΔeccB4) a été construit. EccB4 est un élément structurel central du système de sécrétion codé par ESX-4. ΔeccB4 présente un défaut de survie au sein des cellules, lié à déficit de blocage de l’acidification phagosomale ainsi qu’un défaut de dégradation de la membrane phagosomale, empêchant un contact phagosome-cytosol. Ce travail a permis de révéler pour la première fois dans le monde mycobactérien le rôle d’un locus ancestral de sécrétion ESX-4 au sein d’une mycobactérie. L’étude des protéines secrétées par ce locus est actuellement en cours au laboratoire, afin d’envisager des approches thérapeutiques et vaccinales pour contrer cette mycobactérie multirésistante aux antibiotiques. / Mycobacterium abscessus is a fast growing mycobacterium, and an opportunistic pathogen responsible for lung infections particularly in patients with cystic fibrosis, and for mucocutaneous infections. The source of contamination could be environmental but human-to-human contaminations are not excluded. Environmental amoeba could play a role as a reservoir. M. abscessus is able to resist to the bactericidal defense mechanisms of environmental and human phagocytes. The complete genome of M. abscessus has been sequenced and presents numerous non-mycobacterial virulence factors. Some are known virulence factors in the bacterial world, such as phospholipase C or the magnesium uptake factor MgtC. These factors have been shown to be induced in the presence of amoeba, but cannot alone explain the intracellular survival and virulence of M. abscessus. We thus, in the course of this project, screened a library of mutants generated by transposition in M. abscessus, in search of mutants lacking intracellular growth in amoeba and macrophages. This approach made it possible to identify, in a major way, 5 genes of the ESX-4 locus of M. abscessus encoding a type VII secretion system with all these conserved core components. In order to better understand the contribution of ESX-4 to the intracellular survival of M. abscessus, a mutant obtained by double recombination within the eccB4 gene in the M. abscessus type strain (ΔeccB4) was constructed. EccB4 is a central structural element of the secretion system encoded by ESX-4. ΔeccB4 has a defect of survival within the cells, linked to deficiency of blockage of the phagosomal acidification as well as a defect of degradation of the phagosomal membrane, preventing phagosome-cytosol contact. This work made it possible to reveal for the first time in the mycobacterial world the role of an ancestral locus ESX-4 secretion within a mycobacterium. The study of the proteins secreted by this locus is currently underway in the laboratory, in order to consider therapeutic and vaccine approaches to counter this multiresistant antibiotic mycobacterium.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement exploité par les bactéries à Gram négatif pour sécréter divers facteurs de virulence depuis le périplasme vers le milieu extra-cellulaire. La bactérie phytopathogène Dickeya dadanti (ex. Erwinia chrysanthemi) utilise ce système, appelé Out, pour la sécrétion de pectinases responsable de la maladie de la pourriture molle chez de nombreuses plantes. Les deux composants essentiels du système Out, la protéine de membrane interne OutC et la sécrétine OutD, formant un pore dans la membrane externe, sont impliqués dans la spécificité de sécrétion. L'interaction entre OutC et OutD pourrait assurer l’intégrité structurelle et fonctionnelle du système de sécrétion en reliant les deux membranes. Nous avons entrepris une étude structure-fonction de ces deux composants afin d’identifier et caractériser leurs sites d’interaction et de mieux comprendre leurs rôles. Nous avons appliqué une approche intégrative impliquant une analyse in vivo par cystéine-scanning et pontage disulfure, une analyse in vitro par GST pull down et une analyse structurale d’OutC et OutD et de leurs interactions par RMN. Nos résultats indiquent la présence d'au moins trois sites d'interaction entre les régions périplasmiques d’OutC et d’OutD et suggèrent que ces interactions s’établissent par un mécanisme d’addition des brins β. Nous avons démontré qu’un site situé sur le domaine HR d’OutC pouvait interagir avec deux sites distincts d’OutD suggérant un mode d’interaction alternatif. La présence d’exoprotéines et/ou des composants de membrane interne du système OutE-L-M, modifie différemment l’affinité de ces trois sites d'interaction entre OutC et OutD. Nous proposons que ces interactions alternatives entre divers sites d’OutC et OutD pourraient refléter une succession d’étapes fonctionnelles lors du processus de sécrétion. Pour étudier le mécanisme d’adressage et d’assemblage de la sécrétine OutD dans la membrane externe, nous avons exploité les interactions entre OutD et deux composants auxiliaires du T2SS, la protéine de la membrane interne OutB et la lipoprotéine de la membrane externe OutS. Nous avons montré une interaction directe entre le domaine périplasmique d’OutB et le domaine N0 d’OutD. Une analyse structure-fonction du complexe OutS-OutD a révélé que la pilotine OutS interagit fortement avec 18 résidus à l’extrémité C-terminale de la sécrétine, entraînant la structuration sous forme hélicoïdale de cette région initialement non structurée. Ce travail nous permet de mieux comprendre le mécanisme d’assemblage et de fonctionnement du système de sécrétion de type II. / The type II secretion system (T2SS) is widely exploited by Gram-negative bacteria to secrete diverse virulence factors from the periplasm into the extra-cellular milieu. The phytopathogenic bacterium Dickeya dadanti (ex. Erwinia chrysanthemi) uses this system, named Out, to secrete several cell-wall degrading enzymes that cause soft-rot disease of many plants. The two core components of the Out system, the inner membrane protein OutC and the secretin OutD, which forms a secretion pore in the outer membrane, are involved in secretion specificity. The interaction between OutC and OutD could assure the structural and functional integrity of the secretion system by connecting the two membranes. To understand structure-function relationships between these two components and characterize their interaction sites, we applied an integrative approach involving in vivo cysteine scanning and disulfide cross-linking analysis, truncation analysis of OutC and OutD combined with in vitro GST pull-down, and structural analysis of these proteins and of their interactions by NMR. Our results indicate the presence of at least three interacting sites between the periplasmic regions of OutC and OutD and suggest a β-strand addition mechanism for these interactions. We demonstrated that one site of the HR domain of OutC can interact with two distinct sites of OutD suggesting an alternative mode of their interactions. The presence of exoproteins or/and the inner membrane components of the system OutE-L-M differently alters the affinity of the three OutC-OutD interacting sites. We suggest that successive interactions between these distinct regions of OutC and OutD may have functional importance in switching the secretion machinery between different functional states. To study the mechanism of the targeting and assembly of the secretin OutD into the outer membrane, we exploited the interactions between OutD and two auxiliary proteins, i.e., the inner membrane protein OutB and the outer membrane lipoprotein OutS. We showed a direct interaction between the periplasmic domain of OutB and the N0 domain of OutD. Structure-function analysis of OutS-OutD complex shows that the pilotin OutS binds tightly to 18 residues close to the C-terminus of the secretin subunit causing this unstructured region to become helical on forming the complex. This work allows us to better understand the assembly and function mechanism of the type II secretion system.

Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène impliquée dans la toxi-infection alimentaire à l’origine de la listeriose, une maladie peu fréquente mais avec un taux de mortalité de 25 % chez l’homme. Cette bactérie est capable de former un biofilm lui permettant de mieux résister aux stress environnementaux ainsi qu’aux traitements de décontamination. Une nouvelle stratégie d’analyse génomique a été développée et a permis de cibler des systèmes de sécrétion et des protéines potentiellement impliqués dans la formation de biofilm. L’inactivation de la voie SecA2 entraîne la formation d’un biofilm aérien et par conséquent fragile. Ce morphotype est capable de croître de façon sessile à 20°C sur du polystyrène alors que ce n’est pas le cas pour la souche sauvage. De nouvelles protéines sécrétées de façon SecA2 dépendante ont été identifiées par l’étude de l’exoprotéome du mutant ΔsecA2 en comparaison avec celui de la souche sauvage. Le rôle des lipoprotéines dans la formation de biofilm ainsi que leur maturation par les peptidases signal de type II, LspA et LspB, a également été abordé. La combinaison d'une analyse de l’expression des gènes codant les lipoprotéines au cours de la formation de biofilm avec l’analyse génomique basé sur le sécrétome a permis de cibler trois lipoprotéines, dont LpeA qui serait impliquée dans les phases tardives de formation de biofilm. Enfin, l’importance majeure de LspA dans la maturation des lipoprotéines, a été mise en évidence par l’étude de l’exoprotéome des doubles mutant ΔlgtΔlspA et ΔlgtΔlspB en comparaison avec celui de Δlgt. / Listeria monocytogenes is a foodborne pathogenic bacteria responsible for listeriosis, a rare but high mortality rate disease in humans (25 %). This bacterium can form biofilm allowing a better resistance to environmental stresses as well as decontamination treatments. A new strategy for genomic analysis was developed and allowed to target secretion systems and proteins potentially involved in biofilm formation. Inactivation of the SecA2 pathway leads to the formation of an aerial and fragile biofilm. This morphotype is able to grow in a sessile mode at 20 °C on polystyrene whereas this is not the case for the wild type strain. New proteins secreted in a SecA2 manner were identified by comparing the ΔsecA2 exoproteome to the one of the wild type. The role of lipoproteins in biofilm formation and their maturation by the signal peptidase II, LpsA and LspB, was also tackled. Combining expression analysis of genes encoding lipoproteins during biofilm formation with genomic analysis based on the secretome allowed targeting three lipoproteins, including LpeA, which appeared to be involved in the later stages of biofilm formation. Finally, the importance of LspA in the maturation of lipoproteins,was highlighted by comparing of the double mutant ΔlgtΔlspA and ΔlgtΔlspB exoproteomes to the one of Δlgt.

Les bactéries à Gram négatif sont entourées par une enveloppe cellulaire qui, contrairement aux bactéries à Gram positif, possèdent une organisation membranaire complexe composée d’une membrane interne appelée généralement membrane cytoplasmique, un espace périplasmique contenant une matrice de peptidoglycane et une membrane externe asymétrique constituée d’une monocouche de phospholipides surmontée d’une assise de lipopolysaccharide (LPS). Afin de franchir cette barrière, les bactéries à Gram négatif ont développé différentes voies de sécrétions spécifiques dédiées à l’export des protéines (effecteurs) du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire. Jusqu'à présent, six systèmes de sécrétion ont été identifiés chez ces bactéries. Chez Pseudomonas aeruginosa, une bactérie pathogène opportuniste, le système de sécrétion de type II appelé aussi sécréton Xcp constitue l’un des facteurs principales de sa virulence. Le sécréton Xcp est un complexe macromoléculaire formé par 12 protéines, nommées XcpAO et XcpPC-XcpZM. Ce complexe macromoléculaire est organisé en trois sous-complexes : i) une plateforme d’assemblage ancrée dans la membrane interne formé par les protéines XcpRESFYLZM ii) un pore de sécrétion localisé dans la membrane externe formé par l’oligomérisation d’une protéine appelé la sécrétine XcpQD. Le pore de sécrétion est connecté à la plateforme de la membrane interne par une protéine appelée XcpPC iii) un pseudopilus périplasmique sous forme de fibre hélicoïdale qui est formé par la multimérisation d’une protéine appelée la pseudopiline majeure XcpTG. D’autres protéines appelées les pseudopilines mineures XcpUH-VI-WJ-XK intègrent le pseudopilus. La première partie du travail effectué au cours de cette thèse a eu pour but d’étudier et de comprendre par des approches structurales, biochimiques et biophysiques le mécanisme d’assemblage des pseudopilines en pseudopilus. La deuxième partie de ce travail a porté sur l’étude des réseaux d’interactions entre les substrats sécrétés et les composants de la machinerie Xcp. Durant cette thèse, nous avons ainsi i) identifier grâce à l’étude des interactions protéine-protéine l’existence d’un complexe quaternaire entre les pseudopilines mineures XcpUH-VI-WJ-XK localisées au sommet du pseudopilus ii) déterminer les structures de la pseudopiline majeure XcpTG par RMN et de la pseudopiline mineure XcpWJ par cristallographie aux rayons X iii) déterminer les différents éléments du sécréton qui interagissent avec les exoprotéines du sécréton. Ce réseau d’interaction nous a permis de proposer un modèle de fonctionnement du sécréton qui élucide le cheminement des exoprotéines dans le sécréton afin qu’elles soient exportées vers le milieu extracellulaire. / Gram-negative bacteria are characterized by a complex organization of their cell envelope composed by the inner membrane (IM) called cytoplasmic membrane, the periplasmic space containing a peptidoglycan layer and the outer membrane (OM) covered by the lipopolysaccharide matrix. Gram-negative bacteria have evolved several specialized machines called secretion systems to export their effectors from the intracellular medium to the extracellular milieu or to the host cells. Up to now, at least six secretion systems have been identified. In the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa, the type II secretion system called the Xcp secreton is the major pathway for the release of virulence factors. The Xcp secreton is a macromolecular complex composed by 12 proteins called XcpAO, XcpPC-XcpZM. This machinery is organized in 3 sub-complexes: i) the assembly platform localized in the IM implicating XcpRESFYLZM proteins ii) the OM pore composed by the oligomerization of the secretin XcpQD. The connection between the assembly platform and the secretin is performed by XcpPC anchored in the IM iii) a periplasmic pseudopilus consisting of the multimerization of the so-called major pseudopilin XcpTG. The pseudopilus is a helicoidally filament spanning the periplasmic area and pushing the substrate into the secretin pore. Four other proteins, the minor pseudopilins XcpUH-VI-WJ-XK, were found in the pseudopilus. In the present work we first focused on the study of the pseudopilus components by biochemical, biophysical and structural strategies to understand their assembly. Secondly, we investigate the protein interactome between periplasmic secreton component and secreted substrates. Thus, we revealed the presence of a quaternary complex composed by XcpUH-VI-WJ-XK located at the tip of the pseudopilus. To understand at atomic scale the regulation of the pseudopilus, we determined the structure of two components of the pseudopilus XcpTG by NMR and XcpWJ by X-ray crystallography. Using systematic protein-protein interaction studies between secreton components and purified exoproteins of Pseudomonas aeruginosa, we identified 5 proteins of the secreton able to interact with exoproteins. This interaction network allowed us to propose a model for the secretion process including the sequential steps followed by exoproteins inside the secreton to leave the cell envelop.

L'exoenzyme S, une toxine de type III, de Pseudomonas aeruginosa possède un domaine GAP (GTPase Activating Protein) (ExoSGAP) inhibant les Rho GTPases (Rho, Rac, Cdc42) et la phagocytose dans les cellules de Mammifères en culture. J'ai utilisé une approche de transgenèse chez Drosophila melanogaster en utilisant un système d'expression tissu-spécifique inductible (UAS-Gal4) afin d'exprimer ExoSGAP. Nous avons montré qu'ExoSGAP cible in vivo les Rho GTPases Rho, Rac1, Rac2 et Cdc42. ExoSGAP affecte la résistance des mouches aux infections en inhibant la phagocytose des bactéries par les plasmatocytes, des cellules de type macrophage, mais n'a pas d'effet sur les voies NF-kB. Une approche génétique a permis d'identifier de nouvelles cibles de la toxine, en recherchant des gènes dont la dérégulation modifie le phénotype d'œil ou d'aile induit par l'expression d'ExoSGAP. Nous avons identifié plusieurs gènes pouvant avoir un rôle dans les voies des JNK et NF-kB Ces résultats valident une stratégie d'étude des toxines de type III par transgenèse chez la drosophile.J'ai parallèlement montré la spécificité de la GTPase Rac2 dans la résistance des mouches aux infections bactériennes. Rac2 participe notamment à la phagocytose.<br />Les travaux du Dr. H. Tricoire ont permis d'identifier 180 gènes dont la dérégulation modifie la réponse des mouches à un stress oxydant. J'ai testé 105 de ces lignées pour leur résistance aux infections, afin d'étudier une corrélation possible entre la réponse aux stress oxydant et infectieux. Ce crible a permis de montrer l'implication d'une protéine à domaine lectine PSLR (Pseudomonas Sensitive Lectin Receptor) dans la réponse immunitaire de la drosophile.

Wolbachia est une bactérie Gram(-) intracellulaire symbiote de nombreux arthropodes. Chez A. vulgare, elle entraîne la féminisation des mâles (souche wVul). Nous avons caractérisé le chromosome de wVul (ADN circulaire de 1.75 Mb) qui semble comporter de façon atypique plusieurs opéron rrn et dont les profils de restriction sont différents de ceux des autres souches de Wolbachia. La purification de l'ADN bactérien a permis d'amorcer le séquençage de ce génome. Un système de sécrétion de type IV caractérisé par deux opérons vir a été mis en évidence. L'expression de ces gènes dans les ovocytes et l'étude des protéines impliquées révèlent que ce système pourrait être fonctionnel. Des cartographies bidimensionnelles de profils protéiques de tissus d'individus infectés ou non indiquent des différences d'expression correspondant à des protéines du métabolisme et du cytosquelette de l'hôte surexprimées, et à une RNA hélicase qui pourrait interagir avec le déterminisme du sexe de l'hôte.

Wolbachia est une bactérie Gram(-) intracellulaire modifiant la reproduction de nombreux arthropodes. Chez l'isopode Armadillidium vulgare, la souche wVulC entraîne la féminisation des mâles. Nous avons caractérisé deux opérons vir s'exprimant dans tous les tissus hôtes et codant un système de sécrétion de type IV (T4SS) pouvant permettre d'exporter des effecteurs bactériens vers le cytoplasme de l'hôte. La comparaison des séquences et de l'organisation des gènes de 37 souches de Wolbachia a révélé la forte conservation des deux opérons vir suggérant l'importance du T4SS dans la biologie de la bactérie. Nous avons également identifié, dans le génome en cours de séquençage de wVulC, 66 gènes codant des protéines à domaines ankyrines. Ces motifs forment des sites d'interactions protéine-protéine chez les eucaryotes et sont supposés être impliqués chez Wolbachia dans l'interaction avec des protéines de l'hôte. Nous avons montré qu'une des trois copies du gène pk2 de wVulC, n'est exprimée que chez des souches féminisantes mais chez aucune des 3 souches induisant l'incompatibilité cytoplasmique chez les isopodes terrestres. Ce produit du gène pk2 pourrait être impliqué dans la féminisation de l'hôte. Toutefois, nous avons réalisé des tests d'interaction par double-hybride en levures et par la méthode CRAfT (Cre-recombinase Reporter Assay for Translocation) entre les protéines du T4SS et cinq protéines à domaines ankyrines dont Pk2 afin de savoir si ces dernières étaient sécrétées par ce système. Les résultats montrent qu'aucun des cinq produits de gènes ank testés n'est sécrété par la bactérie mais se révèlent encourageants pour identifier les effecteurs de Wolbachia.

L'expression des gènes codant pour le Système de Sécrétion de Type III (SST3), facteur de virulence majeur de Pseudomonas aeruginosa, est activée par ExsA. Ce facteur de transcription appartient à la famille des régulateurs de type AraC/XylS caractérisés par un domaine de fixation à l'ADN comportant deux motifs hélice-tour-hélice. L'activité de ces protéines est généralement régulée par la fixation d'un ligand sur un domaine supplémentaire non conservé. Ce ligand peut être de nature protéique dans le cas de certains régulateurs contrôlant la synthèse de SST3. Ainsi, l'activité transcriptionnelle de ExsA est inhibée par l'anti-activateur ExsD. L'étude de la fonctionnalité de ExsA et de ses domaines par des approches in vitro et in vivo a révélé que le domaine C-terminal de ExsA est bien le domaine de fixation à l'ADN et que deux monomères se fixent sur le promoteur de l'opéron des gènes de régulation du SST3 (pC). Ce domaine isolé possède une affinité pour pC et une activité transcriptionelle inférieure à celle de ExsA. En effet, la fixation efficace de ExsA sur le promoteur pC requiert sa dimérisation à travers son domaine N-terminal. La dernière hélice  de ce domaine N-ter semble jouer un rôle majeur dans la dimérisation de ExsA. Le deuxième objectif de ma thèse était de comprendre l'interaction entre ExsA et ExsD et d'identifier le mécanisme grâce auquel l'inhibiteur empêche ExsA d'activer la transcription des gènes du SST3. Après co-production des deux protéines, le complexe ExsA/ExsD a été purifié puis caractérisé. ExsA et ExsD forment un complexe hétérodimérique au sein duquel l'inhibiteur empêche le facteur de transcription de se fixer à l'ADN.