Mycobacterium abscessus est une mycobactérie à croissance rapide, et un pathogène opportuniste responsable d’infections pulmonaires notamment chez les patients atteints de la mucoviscidose, et d’infections cutanéomuqueuses. La source de contamination pourrait être environnementale mais des contaminations interhumaines ne sont pas exclues. Les amibes environnementales pourraient jouer un rôle de réservoir. M. abscessus est capable de résister aux mécanismes de défense bactéricides des phagocytes environnementaux et humains. Le génome complet de M. abscessus a été séquencé mettant en évidence de nombreux facteurs de virulence non mycobactériens. Certains sont des facteurs de virulence connus dans le monde bactérien, comme la phospholipase C ou le facteur de captation du magnésium MgtC. Ces facteurs ont été montré induits en présence d’amibes, mais ne peuvent à eux seuls expliquer la survie intracellulaire et la virulence de M. abscessus. Nous avons donc, au cours de ce projet, criblé une banque de mutants générée par transposition chez M. abscessus, à la recherche de mutants dénués de croissance intracellulaire en amibes et macrophages. Cette approche a permis d’identifier, de façon majeure, 5 gènes du locus ESX-4 de M. abscessus codant un système de sécrétion de type VII avec tous ces composants cœur conservés. Pour mieux comprendre la contribution d’ESX-4 dans la survie intracellulaire de M. abscessus, un mutant obtenu par double recombinaison au sein du gène eccB4 dans la souche type de M. abscessus (ΔeccB4) a été construit. EccB4 est un élément structurel central du système de sécrétion codé par ESX-4. ΔeccB4 présente un défaut de survie au sein des cellules, lié à déficit de blocage de l’acidification phagosomale ainsi qu’un défaut de dégradation de la membrane phagosomale, empêchant un contact phagosome-cytosol. Ce travail a permis de révéler pour la première fois dans le monde mycobactérien le rôle d’un locus ancestral de sécrétion ESX-4 au sein d’une mycobactérie. L’étude des protéines secrétées par ce locus est actuellement en cours au laboratoire, afin d’envisager des approches thérapeutiques et vaccinales pour contrer cette mycobactérie multirésistante aux antibiotiques. / Mycobacterium abscessus is a fast growing mycobacterium, and an opportunistic pathogen responsible for lung infections particularly in patients with cystic fibrosis, and for mucocutaneous infections. The source of contamination could be environmental but human-to-human contaminations are not excluded. Environmental amoeba could play a role as a reservoir. M. abscessus is able to resist to the bactericidal defense mechanisms of environmental and human phagocytes. The complete genome of M. abscessus has been sequenced and presents numerous non-mycobacterial virulence factors. Some are known virulence factors in the bacterial world, such as phospholipase C or the magnesium uptake factor MgtC. These factors have been shown to be induced in the presence of amoeba, but cannot alone explain the intracellular survival and virulence of M. abscessus. We thus, in the course of this project, screened a library of mutants generated by transposition in M. abscessus, in search of mutants lacking intracellular growth in amoeba and macrophages. This approach made it possible to identify, in a major way, 5 genes of the ESX-4 locus of M. abscessus encoding a type VII secretion system with all these conserved core components. In order to better understand the contribution of ESX-4 to the intracellular survival of M. abscessus, a mutant obtained by double recombination within the eccB4 gene in the M. abscessus type strain (ΔeccB4) was constructed. EccB4 is a central structural element of the secretion system encoded by ESX-4. ΔeccB4 has a defect of survival within the cells, linked to deficiency of blockage of the phagosomal acidification as well as a defect of degradation of the phagosomal membrane, preventing phagosome-cytosol contact. This work made it possible to reveal for the first time in the mycobacterial world the role of an ancestral locus ESX-4 secretion within a mycobacterium. The study of the proteins secreted by this locus is currently underway in the laboratory, in order to consider therapeutic and vaccine approaches to counter this multiresistant antibiotic mycobacterium.

La première partie de nos travaux a consisté au séquençage de génomes complets de trois souches pathogènes et de trois souches de portage de Staphylococcus lugdunensis pour les comparer aux 15 génomes complets disponibles sur NCBI. Aucun déterminant génétique associé au contexte de virulence ou de portage de S. lugdunensis n’a été identifié. Cependant, nous avons mis en évidence la présence d’éléments génétiques mobiles et des variations dépendantes des complexes clonaux,définis par MultiLocus Sequence Typing, au sein de loci potentiellement associés à la virulence. Des variations ont été observées dans un locus homologue à celui de Staphylococcus aureus codant le système de sécrétion Ess/type VII (SST7). Nous avons mis en évidence huit organisations génétiques chez cette espèce présentant pourtant une structure de population clonale. La seconde partie de nos travaux a consisté à la caractérisation phénotypique et moléculaire du SST7 chez S. lugdunensis par la formation d’un mutant de délétion du gène essC codant une protéine essentielle à la sécrétion. Nos résultats suggèrent que le SST7 serait impliqué dans la translocation de protéines prédites in silico comme impliquées dans la virulence. Néanmoins, dans des modèles de cytotoxicité cellulaire et d’infection du nématode Caenorhabditis elegans, aucune atténuation de la virulence n’a été observée chez la souche mutante malgré une perte de sa capacité à lyser les erythrocytes, comparativement à la souche sauvage. Nos travaux ont également permis de développer et d’évaluer le pouvoir discriminant de trois nouvelles méthodes de typage constituant des outils très prometteurs pour l’épidémiologie moléculaire des infections à S. lugdunensis. / The first part of this study consisted in whole genome sequencing of three pathogenic and three carriage strains of S. lugdunensis and comparison with the 15 genomes available in the NCBI. No genetic determinant was associated to the pathogenic or carriage context. However, we have highlighted the presence of mobile genetic elements and MultiLocus Sequence Typing clonal complex dependent variations within loci potentially associated with virulence. Variations wereobserved in the ess locus homologous to that of Staphylococcus aureus encoding the type VII secretion system (T7SS). We showed eight genetic organizations in this species with a clonal population structure. The second part of our work consisted in a phenotypic and molecular characterization of T7SS in S. lugdunensis by construction of a deletion essC gene mutant. This gene encodes a protein requiredfor protein secretion. Our results suggest that T7SS could be involved in translocation of proteins predicted as implicated in virulence in silico. Nevertheless, no virulence attenuation was observed in cells cytotoxicity assay and Caenorhabditis elegans virulence assays between wild-type and mutant strains which yet has lost the ability to lyse erythrocytes. We also developed and evaluated discriminating power of three new typing methods, which are very promising tools for the molecular epidemiology of S. lugdunensis infections.