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Application des techniques de génotypage à haut débit pour l'étude des communautés fongiques des sols / Using high-throughput genotyping for monitoring communities of soil fungi

Reich, Marlis 28 May 2009 (has links)
Dans les écosystèmes forestiers, les communautés fongiques du sol sont extrêmement diverses et de nombreux facteurs environnementaux structurent et influencent les espèces qui les constituent. Les plantes sont des éléments structurant majeurs des espèces fongiques, car elles sont à l’origine de l’enrichissement des sols en carbone. L’écologie microbienne a fortement bénéficié des apports de la biologie moléculaire, mais l’analyse de la diversité des champignons forestiers à l’échelle du peuplement reste dépendante des outils de génotypage à haut débit. Ainsi, pour permettre l’investigation à large échelle de la diversité fongique et étudier les facteurs structurant de ces communautés, nous avons développé et validé deux générations de phyloarrays basé sur l’identification moléculaire des espèces à partir de l’ADN ribosomal nucléaire. La dernière génération a été mise au point pour identifier simultanément près de 10 000 espèces issues de différents phyla du règne fongique. Pour la première fois, nous avons utilisé ces phylochips pour décrire la richesse fongique des sols forestiers et évaluer l’impact de différents arbres hôtes sur les communautés ectomycorhiziennes et ses dynamiques temporelles. Parallèlement à ce développement technologique, nous avons exploité les très récentes techniques de séquençage massif (pyroséquençage) pour générer et analyser plus de 180 000 séquences, amplifiées à partir d’échantillons d’ADN de sols issus de 6 plantations d’essences forestières différentes. Ces deux nouvelles approches confirment, par des analyses profondes de la diversité fongique, un fort impact de l’essence forestière sur la communauté fongique et une préférence d’hôte chez les espèces mycorhiziennes, comme chez les saprotrophes. A un niveau taxonomique supérieur, nos travaux montrent une distribution relativement homogène des différentes familles du sous-règne Dykaria (ascomycètes et basidiomycètes), marquant également le caractère ubiquiste des ces microorganismes. / In forest ecosystems, fungal communities are highly diverse since several environmental factors influence their richness and structure. Host plant composition is one of the major factors, as the main input of carbohydrates into soil is plant-derived. Ecological research of fungal communities was hindered by the lack of high-throughput diagnostic tools. To ease the large-scale identification of fungi, we have constructed and validated two generations of ribosomal DNA phylochips. The last generation of developed phylochips carried species-specific probes for about 10,000 fungal species spread over the whole fungal kingdom. We applied the developed phylochips to describe the impact of host trees on ectomycorrhizal communities over the time scale of one year. Furthermore, we monitored the diversity of fungal communities under six different host trees by generating over 180,000 sequences using 454 pyrosequencing approach. Results of both techniques revealed a high influence of the different tree species on soil fungal community composition, richnesse and abundance. Furthermore, host preference was observed for most of the ectomycorrhizal and saprotrophic fungi. However, host preference appeared mainly on species level, but not on family level showing also the ubiquistic character of some of the microorganisms.
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Évaluation de marqueurs génétiques du complexe Mycobacterium tuberculosis combinée à l'utilisation d'outils bioinformatiques : apport en épidémiologie et phylogénie de la tuberculose / Evaluation of genetic of Mycobacterium tuberculosis combined with the use of bioinformatics tools : input for epidemiology and phylogeny of tuberculosis

Millet, Julie 07 June 2011 (has links)
Ce travail de thèse intitulé «Evaluation de marqueurs génétiques du complexe Mycobacterium tuberculosis combinée à l'utilisation d'outils bioinformatiques: apport en épidémiologie et phylogénie de la tuberculose» a consisté en la sélection et l'évaluation de marqueurs minisatellites dans le cadre d'études épidémiologiques et phylogénétiques du bacille tuberculeux, Une première partie a ainsi porté sur l'épidémie de tuberculose en Guadeloupe, Martinique, et Guyane française ainsi que dans un pays continental à faible incidence de tuberculose, la Suède, Les résultats montrent les disparités existant entre les populations de patients tuberculeux des 3 départements français d'Amérique (DFA) ainsi que les similitudes génotypiques existant entre les bacilles tuberculeux. Par ailleurs le rôle majeur joué par les cas d'importation dans l'épidémie de tuberculose a été montré aussi bien dans les DFA qu'en Suède. Nous nous sommes ensuite intéressés à une utilisation optimale des minisatellites pour une meilleure discrimination de la famille génotypique émergeante « Beijing» circulant au Japon (Osaka, Kobe et Okinawa), ainsi qu'en Russie. Nous avons constaté le faible pouvoir discriminant du format classique 12-locus MIRU (Mycobacterial lnterspersed Repetitive Units) et proposons plusieurs nouvelles stratégies de typage basées plusieurs marqueurs minisatellites incluant certains locus hypervariables. Enfin, dans un troisième volet, nous avons étudié la diversité génétique des bacilles tuberculeux circulant actuellement dans la Caraïbe. laquelle semble refléter le passé historique très particulier de cette zone géographique au croisement d'une multitude de peuplements. / This thesis entitled "Evaluation of genetic markers of Mycobacterium tuberculosis combined with the use of bioinformatics tools: input for epidemiology and phylogeny of tuberculosis" deals with the selection and evaluation of minisatellite markers in the context of epidemiological and phylogenetic studies of the tubercle bacillus M. tuberculosis. The first part of the present work has focused on the epidemic of tuberculosis in Guadeloupe, Martinique and French Guiana as well as in a low incidence continental country, i.e Sweden. The results show differences between populations of TB patients in the three French Departments of America and similarities between the genotypes of the circulating tubercle bacilli Moreover, results highlight the important role played by imported cases for TB epidemic the three French departments of America and Sweden. ln a second part, minisatellite markers have been evaluated for a better discrimination of strains of the emerging genotype "Beijing" circulating in Japan (Osaka, Kobe and Okinawa), and Russia. A low discriminatory power of classical format 12-locus MIRU (Mycobacterial lnterspersed Repetitive Units) was observed and new combinations of minisatellites have also been proposed including hypervariable locus. Finally, the genetic diversity of tubercle bacilli circulating in the Caribbean was investigated which currently seem to reflect historical past of this very special region at the intersection of a multitude of cultures and peoples.
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Diversité génétique et résistance aux médicaments anti-tuberculeux de Mycobacterium tuberculosis en Chine

Wan, Kanglin 08 October 2007 (has links) (PDF)
Ce manuscrit décrit la distribution géographique des génotypes de Mycobacterium tuberculosis dans une large partie de la Chine, et l'étude d'une éventuelle corrélation avec la vaccination BCG et la résistance aux antibiotiques. La prévalence de la résistance a été analysée dans 10 provinces, et les mutations responsables de la résistance à la rifampicin et à l'INH ont été recherchées. La distribution des différents génotypes a été analysée par spoligotypage, par l'identification de délétions génomiques et par l'analyse du polymorphisme de répétitions en tandem (MLVA). Le génotype Beijing représente 55 à 93% des souches dans les provinces étudiées, avec un gradient allant du Sud vers le Nord de la Chine. Plusieurs autres familles sont identifiées, toutes appartenant à la clade dite " Moderne ". Les familles " Chine 2 " et " Chine 3 " qui représentent l'essentiel des autres souches sont rares en dehors de la Chine. Quelques souches de la famille CAS (Central Asia) sont également rencontrées dans une province et un ancêtre possible de la lignée Beijing dans une autre. La prévalence de la résistance aux antibiotiques a été mesurée parmi plus de 2000 isolats de 10 provinces. Le pourcentage de souches résistantes à au moins une drogue est de 45% et celui des souches multirésistantes est d'environ 29%. En Chine, à la différence d'autres pays, aucune corrélation n'est observée entre le génotype Beijing et la vaccination BCG. La distribution des mutations du gène rpoB a été déterminée ainsi que les mutations responsables de la résistance à l'INH. Aucune mutation n'est observée dans les gènes oxyR et ahpC. Cette étude est la première étude de grande envergure effectuée en Chine sur la diversité génétique de M. tuberculosis et sur les mécanismes de résistance aux antibiotiques.
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Etude phénotypique et génotypique du pou de tête et du pou de corps de l'homme

Veracx, Aurélie 17 September 2012 (has links)
L'objectif de la thèse était d'enrichir les connaissances sur les poux de tête et les poux de corps de l'homme. Les poux de tête vivent et pondent leurs œufs à la base des cheveux et sont très répandus chez les enfants dans les écoles. Les poux de corps vivent dans les vêtements et infestent les personnes de milieux sociaux très défavorisés ne permettant pas une hygiène vestimentaire adéquate. Les poux de corps sont vecteurs de trois grandes maladies : le typhus épidémique, la fièvre des tranchées et la fièvre récurrente à poux. Ces insectes hématophages sont étudiés depuis des décennies afin de déterminer si ils constituent deux écotypes de la même espèce ou deux espèces distinctes. Avant l'avènement des techniques de biologie moléculaire, la taxonomie des poux était basée sur leur morphologie et leur biologie. Bien que les différences biologiques décrites entre les poux de tête et les poux de corps ne sont pas toujours cohérentes, il est légitime de penser que leur séparation physique puisse mener à une différenciation spécifique. Certaines études expérimentales ont cependant montré certains cas de migrations de poux de tête vers les vêtements et inversement. Puis, grâce au séquençage du génome du pou, beaucoup de progrès ont été réalisés ces dernières années sur leur phylogénie. Ainsi, sur base de l'ADN mitochondrial, les poux de l'homme sont séparés en trois Clades phylogénétiques : le Clade A qui comprend à fois des poux de tête et des poux de corps et les Clade B et C qui comprennent uniquement des poux de tête. / The objective of this thesis work was to increase the knowledge of human head lice and body lice. Head lice live and lay their eggs at the base of hair shaft and are found frequently in school going children. Body lice live in clothes and are usually associated with low income persons that do not have adequate clothes hygiene. Body lice are the vector of three major diseases: epidemic typhus, trench fever and relapsing fever. These blood feeding insects have been studied over the past decades to determine whether they are two ecotypes of the same species or two distinct species. Before the advent of molecular biology, taxonomical classification of lice was based on their morphology and biological activities. Although described biological differences between head lice and body lice are not always consistent, their physical separation could lead to species differentiation. However, some experimental studies have shown that in certain cases head lice could migrate to the clothes and vice versa. In the recent years many progress were made in the body louse genome sequencing, and further their phylogenetic classification. Thus, on the basis of mitochondrial DNA, human lice are classified into three phylogenetic clades: Clade A that comprise both head lice and body lice and the Clades B and C that comprise only head lice. This phylogenetic organization clustered into three clades surprisingly shows that head lice of Clade A are closer to body lice than to head lice of Clade B or C. Since body lice serve as vectors of several diseases, in view of this, it is crucial to understand human lice epidemiology.
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The how and the why of ventral branches evolution between Drosophila santomea and Drosophila yakuba : genetic basis, natural variation and plasticity of a shape difference linked to speciation / Le comment et le pourquoi de l’évolution des branches ventrales entre Drosophila santomea et Drosophila yakuba : bases génétiques, variation naturelle et plasticité d’une différence de forme liée à la spéciation

Peluffo, Alexandre E. 04 September 2017 (has links)
La thèse aborde le problème de l’évolution de la forme à travers l’exemple d’une différence de forme de branches ventrales mâles liée à l’isolement reproducteur chez deux espèces soeurs : Drosophila yakuba et Drosophila santomea. L’objectif de ce travail est d’identifier les gènes impliqués dans l’évolution de cette différence de forme ainsi que les causes évolutives de cette différence entre espèces. Dans une première partie, la thèse interroge la notion de “gène” et sa recherche. Puis sont caractérisées, dans un cadre formel, les questions de type "comment" et "pourquoi" et leur lien avec la distinction causes prochaines/causes ultimes ou évolutives. Ces réflexions philosophiques sont ensuite reliées à l’Evo-Devo et au projet expérimental. Dans la deuxième partie, par morphométrie géométrique et une nouvelle méthode de génotypage à haut débit, le MSG, nous identifions un locus de 2.7 méga-bases situé sur le chromosome 3L comme étant impliqué dans l’évolution de la forme des branches ventrales entre D. yakuba et D. santomea. Ces résultats sont mis en perspective avec notre analyse quantitative de la variation de forme dans plusieurs souches naturelles, souches de laboratoire et souches élevées à différentes températures qui apportent des indices sur les causes évolutives de cette différence de forme / The thesis tackles the problem of the evolution of shape through the example of a shape difference in the male ventral branches linked to reproductive isolation in two sister species: Drosophila yakuba and Drosophila santomea. The goal is to identify the genes involved in the evolution of this shape difference and the evolutionary causes of such difference. In a first part, the thesis interrogates the concept of “gene” and its search. Then are scientifically characterized the “how” and “why” questions and their link with the distinction of proximal/ultimate, or evolutionary, causes; these philosophical grounds are then linked to Evo-Devo and the experimental work presented in the thesis. In a second part, through geometric morphometrics and a new high-throughput genotyping method, MSG, we identify a loci of 2.7 mega-bases located on chromosome 3L as involved in the evolution of the shape of ventral branches between D. yakuba and D. santomea. These results are linked to our quantitative analysis of shape variation in multiple natural and laboratory strains and strains reared at different temperatures which bring light into the evolutionary causes of this shape difference
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Aspects épidémiologiques et caractérisation moléculaire des souches du virus de l’hépatite E (VHE) au Burkina Faso / EPIDEMIOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERIZATION OF HEPATITIS E VIRUS (HEV) STRAINS IN BURKINA FASO

Traoré, Kuan Abdoulaye 02 June 2015 (has links)
Le virus de l’hépatite E (VHE) est l’agent causal d’une partie des hépatites aigues ou fulminantes qui surviennent essentiellement dans les pays en voie de développement (Afrique, Asie) ou le VHE de génotype 1 semble présenter un profil endémique ponctué de bouffées épidémiques souvent liées à des déplacements de populations (catastrophe climatique ou conflits) (Lui et al., 2013). Récemment il a été montré que ce virus était largement distribué dans des réservoirs animaux (génotype 3 et 4) et la cause d’un grand nombre d’infections zoonotiques aussi bien dans les pays du nord que du sud. Dans la plupart des cas, il s'agit d'une infection spontanément résolutive avec une clairance virale rapide, mais il peut évoluer vers des formes plus sévères avec un niveau de mortalité variant de 1 à 4% dans la population générale et à près de 20% chez la femme enceinte lors des flambées épidémiques (OMS, 2014). Au Burkina Faso, très peu de données existent sur la prévalence chez l’homme, l'épidémiologie moléculaire du VHE ou la présence de ce virus dans le réservoir animal principal que constituent les porcs. De plus, l’ignorance de la population quant aux causes de cette infection d’origine alimentaire, est un facteur de risque qu’on ne peut pas ignorer. L’objectif de ce travail est donc d’améliorer notre connaissance sur cet agent des hépatites. La première partie de notre étude s’est consacrée à l’évaluation de la séroprévalence du VHE chez les donneurs de sang et les femmes venant en consultation prénatale à Ouagadougou. Au total plus de 1700 échantillons de sérums de volontaires ont été collectés dans les banques de sang et centres médicaux: entre 2010 et 2012, sur les 178 donneurs de sang et 189 femmes enceintes testés, 19,1% [IC95, 13,3-24,9%] et 11,6% [IC95, 7,1-16,2%] étaient respectivement positifs aux IgG anti-VHE. Ces taux élevés sont peut-être associé au faible statut socioéconomique et à l’absence de réseaux d’assainissement des eaux (Traoré et al., 2012). En 2014, 3,19% [IC95, 1,70-4,68%] des 533 donneurs de sang testé sont positifs pour des IgM anti-VHE. Ces résultats montrent un risque résiduel transfusionnel non négligeable associé à une transmission à bas bruit et confirme l’intérêt d’identifier la ou les sources de ce virus. La seconde partie de ce travail a été de vérifier le rôle d’une source zoonotique des infections à VHE, via l’évaluation du VHE (par sérologie et typage moléculaire après PCR) dans le réservoir potentiel que sont les porcs et la population à risques exposé à ce réservoir (bouchers et éleveurs). Pour cela nous avons réalisé un recensement des sites de ventes de porcs et évalué la consommation d’animaux. Un taux de séroprévalence de 76% [IC95, 67,6-84,4%] a été mesuré dans une cohorte de 100 bouchers de Ouagadougou avec un facteur de risque de séropositivité 3 fois plus élevé par rapport à la population générale (OR = 3,46 [95%CI 2,85 – 4,21] p <0.001). Les IgG anti-VHE chez les porcs abattus ont été estimés à 80% IC95 [72-87%]. Cette forte prévalence confirme une circulation silencieuse du VHE dans l’élevage porcin au Burkina Faso comme en témoigne l'échantillon positif de foie pour l’ARN VHE qui soutient fermement le risque de zoonose. L’analyse des séquences des produits de PCR des foies de porcs positifs pour VHE a révélé la présence de VHE génotype 3 et 99,8 % d'homologie avec les souches Yaounde et Madagascar. En conclusion, notre étude, la première caractérisation moléculaire des souches du VHE au Burkina, montre la présence de souches VHE génotype 3 dans des régions ou seul le génotype 1 avait été identifié jusqu’alors (Tchad, Maroc). L’évaluation du risque transfusionnel associé nécessite des études complémentaires afin d’évaluer le bénéfice/coût de l'ajout de dépistage du VHE dans les examens de routines des banques de sang, afin de garantir la sécurité du receveur de sang. / The hepatitis E virus (HEV) is causative agent several acute or fulminant hepatitis which mainly occur in developing countries where HEV genotype 1 or 2 appears to have a endemic profile punctuated with epidemic outbreaks (Africa, Asia) (Lui et al., 2013). Genotype 3 and 4 distributed widely in animal reservoirs, were the cause many zoonotic infection in northern and southern countries. In most cases, it is a self-limited infection with rapid viral clearance, but it can evolve into more severe forms with a mortality level ranging from 1 to 4% in the general population to nearly 20% in pregnancy during outbreaks (WHO, 2014). In Burkina Faso, very little epidemiological data are available on HEV. The objective of this work is to improve our understanding of this agent hepatitis. The first part of our study was devoted to the evaluation HEV seroprevalence among blood donors and women attending antenatal care in Ouagadougou. In total more than 1,700 volunteers serum samples were collected in blood banks and medical centers in Burkina Faso. Between 2010 and 2012 on 178 blood donors and 189 pregnant women tested, 19.1% [CI95, 13.3-24.9%] and 11.6% [CI95, 7.1-16.2%], were respectively positive for anti-HEV IgG. These high rates in the general population may be associated a low income and the poor hygienic status (Traoré et al., 2012). In 2014, 3.19% [CI95, 1.70-4.68%] on 525 blood donors tested, were positive for anti-HEV IgM. These results indicate a residual risk for transfusion, probably associated with silent infections and confirm the importance to identify the sources of the virus. The second part of this work was 1) to assess HEV infection among humans in Burkina Faso by exploring the HEV seroprevalence in a high risk population, i.e., butchers; 2) to explore a possible pig-to-human zoonotic transmission cycle by assessing the HEV seroprevalence in slaughter swine; and 3) to identify the genotype of HEV circulating in pigs. The global HEV prevalence among Ouagadougou butchers was estimated to 76%, CI95 [67, 63–84.37%] with a significant risk factor, 3 times higher compared with the general population (OR = 3.46 [95%CI 2.85 - 4.21] p <0.001). IgG anti-HEV in pigs older than 6 months of age were estimated at 80% CI95 [72-87%]. This high prevalence confirms the presence and active circulation HEV among domestic pigs in Burkina Faso as evidenced by the positive sample of liver for HEV RNA which strongly supports the risk of zoonosis. Phylogenetic analyses revealed that genotype 3 HEV is circulating among swine population in Burkina. A similarity >98% was found between swHEV-BF from Yaounde and Madagascar. This data showed for the first time the role of swine in introduction of new HEV in African population. In conclusion, these results latter sign a persistent introduction of HEV infection in the population and hence deserved to be taken in account in transfusion associated risk. Further assessments of the transfusion risk associated require an evaluation of the cost/benefit ratio for the addition of routine HEV RNA screening to the panel of tests on donated blood, to guarantee transfusion safety for the recipient.
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CONTRIBUTION A L'ETUDE DE LA DIVERSITE GENETIQUE BACTERIENNE ET A LA CARACTERISATION DE BACTERIES PRESENTES DANS DES PRELEVEMENTS ATMOSPHERIQUES

Prieur, Agnès 04 September 2001 (has links) (PDF)
La détection, voire l'identification, de bactéries dans l'air trouve une large application dans le domaine civil (diagnostic médical, surveillance de la qualité des aliments, de l'eau, de l'air ou du sol,...) et militaire (défense biologique). L'objectif principal de cette thèse a été, d'une part, d'étudier la diversité génétique de Bacillus anthracis et, d'autre part, d'analyser la composition bactérienne de prélèvements atmosphériques. L'identification précise de souches de B. anthracis (étude de la diversité de cette espèce bactérienne) repose, d'une part, sur une approche par typage de répétitions en tandem et, d'autre part, sur une approche par typage de mutations ponctuelles. Les résultats obtenus par ces deux méthodes indépendantes sont en accord. Cependant, les répétitions en tandem apportent une bien meilleure résolution. L'étude de la composition bactérienne de l'air participe à la validation d'un système de détection. Celui-ci doit être capable de caractériser en moins d'une heure, la présence de quelques bactéries par litre d'air de l'environnement. Le protocole développé ici permet de détecter 1 pg d'ADN pur en moins de deux heures, sans faire appel à une étape d'amplification génique. L'analyse du bruit de fond atmosphérique tire parti de ce protocole, à l'exception de quelques modifications qui permettent d'analyser un plus grand nombre d'échantillons. Les résultats de quatre collectes soulignent que le bruit de fond atmosphérique peut varier de demi-heure en demi-heure. Le seuil de sensibilité de la méthode est d'environ 100 bactéries par litre d'air.
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Modèles expérimentaux de traitement in vitro et épidémiologie moléculaire chez les poux humains / Experimental Models of Treatment in Vitro and Molecular Epidemiology on Human Lice

Sangaré, Abdoul Karim 11 December 2015 (has links)
Les poux humains (Pediculus humanus) sont des ectoparasites hématophages, ayant vécu avec leur hôte pendant des milliers d’années. Durant cette thèse, nous avons d’abord élaboré une large bibliographie nous permettant de rédiger une revue, puis d’apporter des réponses à certains nombres de questions restées en suspens à travers le traitement de certaines thématiques qui nous semblaient importantes. En effet, nous avons (i) démontré que les poux de tête et les poux de corps en Afrique peuvent être infectés par B. quintana quand les patients vivent dans des conditions économiques pauvres et sont aussi exposés aux poux de corps; identifié pour la première fois le clade mitochondrial des poux de tête du Mali, Kenya, Congo et Madagascar, et confirmé celui du Sénégal, Algérie, Ethiopie, Rwanda et Burundi, (ii) démontré que les poux de tête et les poux de corps chez les SDF doublement infestés appartiennent à la même population de poux de corps, et dans les conditions d’infestation massive, les poux de corps peuvent migrer et coloniser les cheveux et vice-versa, (iii) prouvé la nécessité de réaliser des enquêtes épidémiologiques nationales sur la pédiculose dans les régions du Mali, (iv) démontré par le modèle in vitro que la doxycycline a un effet direct sur la bactérie endosymbionte du pou Candidatus Riesia pediculicola via le mycetome. Ce dernier travail nous a permis de mettre en exergue l’efficacité synergique des antibiotiques + ivermectine permettant de lutter plus efficacement l’infestation des poux et éviter l’apparition de résistance. Ce travail a fait l’objet de dépôt d’un brevet. / Human lice (Pediculus humanus) are bloodsucking ectoparasites, having lived with their host for thousands of years. During this thesis, we first developed an extensive bibliography allowing us to write a review and provide answers to certain number of questions remained pending through treating some thematic that seemed us significant. Indeed, we have (i) demonstrated that head and body lice in Africa can be infected with B. quintana when patients live in poor economic conditions and are also exposed to body lice; identified for the first time the mitochondrial clade of lice Mali, Kenya, Congo and Madagascar, and confirmed that of Senegal, Algeria, Ethiopia, Rwanda and Burundi, (ii) demonstrated that head and body lice in SDF doubly infected belong to the same population of body lice, and under conditions of massive infestation, body lice can migrate and colonize the hair and vice versa, (iii) proved the need to make national epidemiological surveys on pediculosis in areas of Mali, (iv) demonstrated by in vitro model that doxycycline has a direct effect on endosymbiont bacteria of louse Candidatus Riesia pediculicola via mycetoma. This last work allowed us to highlight the synergistic efficacy of ivermectin + antibiotics to fight more effectively the infestation of lice and avoid the appearance of resistance. This work was subject of a patent.
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The Development, Validation and Implementation of a Broad-Based ADME Genotyping Assay into Research and Clinical Trials

Brown, Andrew M.K. 12 1900 (has links)
Afin d’adresser la variabilité interindividuelle observée dans la réponse pharmacocinétique à de nombreux médicaments, nous avons créé un panel de génotypage personnalisée en utilisant des méthodes de conception et d’élaboration d’essais uniques. Celles-ci ont pour but premier de capturer les variations génétiques présentent dans les gènes clés impliqués dans les processus d'absorption, de distribution, de métabolisme et d’excrétion (ADME) de nombreux agents thérapeutiques. Bien que ces gènes et voies de signalement sont impliqués dans plusieurs mécanismes pharmacocinétiques qui sont bien connues, il y a eu jusqu’à présent peu d'efforts envers l’évaluation simultanée d’un grand nombre de ces gènes moyennant un seul outil expérimental. La recherche pharmacogénomique peut être réalisée en utilisant deux approches: 1) les marqueurs fonctionnels peuvent être utilisés pour présélectionner ou stratifier les populations de patients en se basant sur des états métaboliques connus; 2) les marqueurs Tag peuvent être utilisés pour découvrir de nouvelles corrélations génotype-phénotype. Présentement, il existe un besoin pour un outil de recherche qui englobe un grand nombre de gènes ADME et variantes et dont le contenu est applicable à ces deux modèles d'étude. Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé un panel d’essais de génotypage de 3,000 marqueurs génétiques ADME qui peuvent satisfaire ce besoin. Dans le cadre de ce projet, les gènes et marqueurs associés avec la famille ADME ont été sélectionnés en collaboration avec plusieurs groupes du milieu universitaire et de l'industrie pharmaceutique. Pendant trois phases de développement de cet essai de génotypage, le taux de conversion pour 3,000 marqueurs a été amélioré de 83% à 97,4% grâce à l'incorporation de nouvelles stratégies ayant pour but de surmonter les zones d'interférence génomiques comprenant entre autres les régions homologues et les polymorphismes sous-jacent les régions d’intérêt. La précision du panel de génotypage a été validée par l’évaluation de plus de 200 échantillons pour lesquelles les génotypes sont connus pour lesquels nous avons obtenu une concordance > 98%. De plus, une comparaison croisée entre nos données provenant de cet essai et des données obtenues par différentes plateformes technologiques déjà disponibles sur le marché a révélé une concordance globale de > 99,5%. L'efficacité de notre stratégie de conception ont été démontrées par l'utilisation réussie de cet essai dans le cadre de plusieurs projets de recherche où plus de 1,000 échantillons ont été testés. Nous avons entre autre évalué avec succès 150 échantillons hépatiques qui ont été largement caractérisés pour plusieurs phénotypes. Dans ces échantillons, nous avons pu valider 13 gènes ADME avec cis-eQTL précédemment rapportés et de découvrir et de 13 autres gènes ADME avec cis eQTLs qui n'avaient pas été observés en utilisant des méthodes standard. Enfin, à l'appui de ce travail, un outil logiciel a été développé, Opitimus Primer, pour aider pour aider au développement du test. Le logiciel a également été utilisé pour aider à l'enrichissement de cibles génomiques pour d'expériences séquençage. Le contenu ainsi que la conception, l’optimisation et la validation de notre panel le distingue largement de l’ensemble des essais commerciaux couramment disponibles sur le marché qui comprennent soit des marqueurs fonctionnels pour seulement un petit nombre de gènes, ou alors n’offre pas une couverture adéquate pour les gènes connus d’ADME. Nous pouvons ainsi conclure que l’essai que nous avons développé est et continuera certainement d’être un outil d’une grande utilité pour les futures études et essais cliniques dans le domaine de la pharmacocinétique, qui bénéficieraient de l'évaluation d'une longue liste complète de gènes d’ADME. / In order to better assess the inter-individual variability observed in a patient’s pharmacokinetic response to many medications, we have created a custom genotyping panel that uses unique assay designs to analyze variation present in key genes involved in the absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME) of many therapeutic agents. These genes and pathways involved in most pharmacokinetic mechanisms are well known. However, as yet, there has been little effort to develop tools that can interrogate a large number of variations in most known drug metabolizing genes simultaneously within a single experimental tool. Pharmacogenomic research has historically been conducted using two approaches: targeted studies that screen a small number of specific functional markers to identify known metabolic status phenotypes, and genome-wide studies that identify novel genetic correlations with drug response phenotypes. Thus, a gap currently exists for a targeted ADME research tool that can evaluate a large number of key ADME genes and variants in a format that can be applicable to both types of study designs. As part of this thesis, we have developed a 3000 SNP broad based ADME genotyping panel that can address this need. Genes and markers for the genotyping panel were selected in collaboration with many groups from both academia and the pharmaceutical industry in an effort to capture all pertinent genes and metabolic pathways that have been implicated in drug metabolism. The final assay design was composed of over 3000 markers in 181 genes. Over three phases of iterative development, the assay conversion rate for the 3000 markers was improved from 83.0% to 97.4% through the incorporation of novel design strategies to overcome areas of genomic interference such as regions of homology and underlying polymorphisms. Accuracy of the assay was validated by screening more than 200 samples of known genotype with a concordance of 99%. Additionally, data from the assay has also been compared to data from different technological platforms and has an overall concordance of 99.5%. The effectiveness of the design strategy was demonstrated in the successful utilization of the assay in the screening of over 1000 samples which identified several novel pharmacogenetic associations between ADME variations and adverse drug reactions in children. Another goal of this thesis was to demonstrate what added benefit/utility the 3000 SNP ADME panel would have when compared to currently available genotyping assays. Using 150 extensively investigated liver samples, the broad based assay was not only able to detect and validate 13 previously reported cis eQTLs in ADME genes but further identified an additional 13 novel ADME cis eQTLs that had never been observed before, doubling the number previously identified using standard methods on the same samples. Finally, in support of this work, a number of bioinformatic tools had to be developed to help expedite this research. These tools have been further refined and are currently being used to assist with enrichment of genomic targets for next generation sequencing experiments. In conclusion, this work has led to a better understanding of ADME genetics and the nuances of assaying ADME genes. The content and designs of the developed assay sets it apart from currently available commercial assays that contain only functional markers in a small number of genes or do not have adequate coverage across ADME genes. The assay has the ability to play a significant role in pharmacogenomic studies to identify known and novel pharmacogenomic biomarkers. These will lead to improved biomarkers that will help better stratify pharmaceutical clinical trial populations or assist physicians to select better, more personalized, efficacious and safer therapies for their patients.
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Syndromes myélodysplasiques de novo et secondaires à un traitement anti-cancéreux : recherche de marqueurs génétiques de susceptibilité individuelle / Therapy-related myelodysplastic syndromes : identification of genetic markers of individual susceptibility

Dubois, Julie 21 December 2012 (has links)
Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont des hémopathies myéloïdes clonales évoluant vers une leucémie aiguë (LA). Les SMD et LA secondaires, survenant après traitement par chimiothérapie et/ou radiothérapie, ont un pronostic très péjoratif. Cependant seule une partie des sujets exposés aux traitements cytotoxiques développent un SMD secondaire, ce qui suggère une composante génétique dans la susceptibilité individuelle au risque de développer un SMD secondaire. Les objectifs de ce travail ont été d’identifier des polymorphismes génétiques de type SNP (Single Nucleotide Polymorphism) significativement associés à des caractères cliniques et biologiques des SMD tel leur caractère secondaire. Une « puce » à façon a sélectionné 384 SNP de fréquence allélique supérieure à 10 % impliqués dans la réparation de l’ADN, le métabolisme, le transport et la détoxication des xénobiotiques. L’ADN constitutionnel de 65 patients atteints de SMD primaire et secondaire a été recueilli et génotypé pour ces 384 SNP. La seule association significative par test exact de Fisher (p = 0,009 après correction de Benjamini-Hochberg) a été observée pour le caractère secondaire des SMD et la présence de l’allèle variant de MGMT (MéthylGuanine MéthylTransférase) sur deux SNP en déséquilibre de liaison, rs2308321 (Ile143Val) et rs2308327 (Lys178Arg). Nous avons recherché le caractère prédictif de la présence de l’allèle variant de MGMT pour le risque de SMD/LA secondaire chez des patientes ayant reçu un traitement cytotoxique pour un cancer du sein, et ayant développé une LA secondaire. Enfin, nous avons construit des lignées cellulaires stables, isogéniques, exprimant soit la forme sauvage soit la forme variante de MGMT. Les études fonctionnelles par tests de cytotoxicité, co-cultures à long terme et étude des demi-vies des protéines, sous traitement alkylant, montrent respectivement des différences de sensibilité, de prolifération ou de dégradation entre les formes variante et sauvage de MGMT. / Myelodysplastic syndromes (MDS) are clonal hematopoietic disorders evolving toward acute myeloid leukaemia (AML). Therapy-related MDS and AML occur after chemo- and/or radiotherapy for previous cancer and have a very poor outcome. However, only a minimal proportion of patients exposed to anticancer drugs develop secondary MDS, suggesting a genetic component in individual susceptibility. The aim of our study was to identify gene polymorphisms significantly associated with MDS in patients. We have selected 384 SNPs (single nucleotide polymorphisms) with allele frequency >10% in genes involved in DNA repair and drug metabolism and transport. DNA extracts were obtained from blood and cheek samples from a population of 65 MDS patients, and the 384 SNPs were genotyped. We analysed the associations existing between each genotype and several pathological features, especially the treatment-related character of MDS. The Fisher exact test with Benjamini-Hochberg correction for multiple testing was applied for statistical analysis. The only significant association (p = 0.009 after correction) was observed for the treatment-related character of MDS and the presence of a variant allele in MGMT (methylguanine methyltransferase, a gene involved in DNA repair), characterised by two SNPs in complete linkage disequilibrium: rs2308321 (Ile143Val) and rs2308327 (Lys178Arg). An epidemiological study was performed to assess the predictive value of the variant allele in MGMT for the development of secondary acute leukaemia among patients treated for breast cancer. We have constructed isogenic stable cell lines expressing either the wild-type or the variant allele of MGMT. Functional studies (analysis of response to alkylating agents, allele quantification of mixed cultures of wild-type and variant cells and half-lives study of the proteins) show differences in sensitivity to DNA-damaging agents, proliferative capacity and MGMT rate of degradation between the wild-type and the variant MGMT.

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