La tuberculose est une maladie ancienne et ré-émergente qui constitue un véritable problème de santé publique dans le monde. L’émergence de la tuberculose à souches de M. tuberculosis multirésistantes et ultrarésistantes aux antituberculeux en plus de la pandémie du VIH/Sida, représentent un défi majeur dans la lutte contre la tuberculose pour son contrôle et son élimination. Ce contrôle de la tuberculose nécessite des mesures en santé publique et au niveau de l’individu. Ces mesures concernent la disponibilité et l’accessibilité à des tests de diagnostic rapides, des traitements efficaces et des outils de surveillance et de contrôle.Nos travaux concernent la recherche, le développement et la validation de méthodes moléculaires multiplexées, souvent basées sur le polymorphisme des loci CRISPR (Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats). Elles sont rapides, à haut débit, moins onéreuses et applicables pour la santé publique (transmission de la tuberculose sensible et multirésistante, évaluation des programmes nationaux de tuberculose) mais aussi pour un meilleur diagnostic dans l’intérêt du patient (antibiogramme moléculaire, identification infra-spécifique). C’est ainsi que nous avons développé et validé le spoligoriftyping (méthode de génotypage combiné à la détection moléculaire de la résistance de M. tuberculosis à la rifampicine), le “TB-SPRINT” (Spoligoriftyping plus la détection moléculaire de la résistance à l’isoniazide) et le sous-typage de M. africanum. Ces différentes méthodes, aux performances (sensibilité/spécificité) satisfaisantes (99/100% pour le spoligoriftyping, 95/100% en moyenne pour le “TB-SPRINT”) ont servi à des études d’épidémiologie moléculaire dans des pays comme le Pakistan, le Nigéria et le Brésil. D’autres travaux en cours portent sur le génotypage basé sur les CRISPR d’autres espèces (Salmonella enterica, Legionella pneumophila) et sur des études de génomique comparative. Nos tests, utilisés en routine, replacent le laboratoire au cœur de la lutte anti-tuberculeuse et permettront d’importantes avancées en Santé Publique et Microbiologie médicale et environnementale. / Tuberculosis (TB) remains a major public health concern worldwide despite all the efforts to fight this disease. The emergence of multi drug and extensively drug resistant TB and the pandemic of HIV/AIDS constitute major threats and challenge for the TB control and eradication. TB control requires measures in public health and in individual level as accessibility to tests for early diagnostic, effective treatment and tools for tuberculosis surveillance and control.The goals of this work were research, development and validation of new molecular multiplexed methods based on polymorphism of the CRISPR (Clustered Regularly Interspersed Palindromic Repeats) loci and single nucleotides polymorphisms. These methods are rapid, high throughput, cheap and can be applied both for public health purposes (transmission of susceptible and multi-drug resistant tuberculosis, evaluation of national TB programs) as for interest of TB patient (drug resistance testing, infra-specific identification). Thus we developed spoligoriftyping and “TB-SPRINT” tests that allow genotyping and rifampicin or rifampicin and isoniazide resistance detection. Another test was developed for subtyping of M. africanum. All these methods had high performances (sensitivity/specificity), 99/100% for the spoligoriftyping and about 95/100% for the “TB-SPRINT” and were applied for molecular epidemiology studies of countries as Nigeria, Brazil and Pakistan. Other ongoing work and developments of genotyping methods are the spoligotyping of L. pneumophila and S. enterica and comparative genomics projects.Used in routine, our methods may play key roles in TB control and would allow important advances in Public Health, in medical and environmental Microbiology.

L'analyse et l'interprétation d''echantillons constitu'es de mélanges d'ADN de plusieurs individus est un défi majeur en science forensique. Lorsqu'un expert de la police scientifique a affaire à un mélange d'ADN il doit répondre à deux questions: d'abord, "combien de contributeurs y a-t-il dans ce mélange ?"et puis, "quels sont les génotypes des individus impliqués ?" Le typage seul de cet ADN ne permet pas toujours de r'epondre 'a ces questions. En effet leproblème est posé d'es lors que plus de deux allèles sont observées à un locus donné, plusieurscombinaisons génotypiques sont alors 'a envisager et il est impossible de déterminer avec certitudele nombre d'individus qui ont contribué au m'elange. De plus, la présence d'anomalies liées àl'analyse de marqueurs g'en'etiques, comme la contamination ou la perte d'all'eles ("drop-out"),peut davantage compliquer l'analyse.Les nombreux d'eveloppements statistiques d'edi'es 'a ces probl'ematiques n'ont pas eu le succ'esescompt'e dans la communaut'e forensique, essentiellement, parce que ces m'ethodes n'ont pas 'et'evalid'ees. Or sans cette validation, les experts de la police scientifique ne peuvent exploiter cesm'ethodes sur des m'elanges issus d'affaires en cours d'investigation.Avant d'ˆetre valid'ees, ces m'ethodes doivent passer par une rigoureuse 'etape d''evaluation.Cette derni'ere soul'eve deux questions: d'abord, la question de la m'ethodologie 'a adopter, puis,celle des outils 'a d'eployer. Dans cette th'ese, nous tentons de r'epondre aux deux questions.D'abord, nous menons des 'etudes d''evaluation sur des m'ethodes d'edi'ees 'a deux questions cl'es: i)l'estimation du nombre de contributeurs 'a un m'elange d'ADN et ii) l'estimation des probabilit'esde "drop-out". En second lieu, nous proposons un logiciel "open-source" qui offre un certainnombre de fonctionnalit'es permettant de faciliter l''evaluation de m'ethodes statistiques d'edi'eesaux m'elanges d'ADN.Cette thèse a pour but d'apporter une r'eponse concr'ete aux experts de la police scientifiqueen leur fournissant 'a la fois une d'emarche m'ethodologique pour l''evaluation de m'ethodes, et lapossibilit'e d'analyser la sensibilit'e de leurs r'esultats au travers d'un outil informatique en libreacc'es.

Afin d’adresser la variabilité interindividuelle observée dans la réponse pharmacocinétique à de nombreux médicaments, nous avons créé un panel de génotypage personnalisée en utilisant des méthodes de conception et d’élaboration d’essais uniques. Celles-ci ont pour but premier de capturer les variations génétiques présentent dans les gènes clés impliqués dans les processus d'absorption, de distribution, de métabolisme et d’excrétion (ADME) de nombreux agents thérapeutiques. Bien que ces gènes et voies de signalement sont impliqués dans plusieurs mécanismes pharmacocinétiques qui sont bien connues, il y a eu jusqu’à présent peu d'efforts envers l’évaluation simultanée d’un grand nombre de ces gènes moyennant un seul outil expérimental. La recherche pharmacogénomique peut être réalisée en utilisant deux approches: 1) les marqueurs fonctionnels peuvent être utilisés pour présélectionner ou stratifier les populations de patients en se basant sur des états métaboliques connus; 2) les marqueurs Tag peuvent être utilisés pour découvrir de nouvelles corrélations génotype-phénotype. Présentement, il existe un besoin pour un outil de recherche qui englobe un grand nombre de gènes ADME et variantes et dont le contenu est applicable à ces deux modèles d'étude. Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé un panel d’essais de génotypage de 3,000 marqueurs génétiques ADME qui peuvent satisfaire ce besoin. Dans le cadre de ce projet, les gènes et marqueurs associés avec la famille ADME ont été sélectionnés en collaboration avec plusieurs groupes du milieu universitaire et de l'industrie pharmaceutique. Pendant trois phases de développement de cet essai de génotypage, le taux de conversion pour 3,000 marqueurs a été amélioré de 83% à 97,4% grâce à l'incorporation de nouvelles stratégies ayant pour but de surmonter les zones d'interférence génomiques comprenant entre autres les régions homologues et les polymorphismes sous-jacent les régions d’intérêt. La précision du panel de génotypage a été validée par l’évaluation de plus de 200 échantillons pour lesquelles les génotypes sont connus pour lesquels nous avons obtenu une concordance > 98%. De plus, une comparaison croisée entre nos données provenant de cet essai et des données obtenues par différentes plateformes technologiques déjà disponibles sur le marché a révélé une concordance globale de > 99,5%. L'efficacité de notre stratégie de conception ont été démontrées par l'utilisation réussie de cet essai dans le cadre de plusieurs projets de recherche où plus de 1,000 échantillons ont été testés. Nous avons entre autre évalué avec succès 150 échantillons hépatiques qui ont été largement caractérisés pour plusieurs phénotypes. Dans ces échantillons, nous avons pu valider 13 gènes ADME avec cis-eQTL précédemment rapportés et de découvrir et de 13 autres gènes ADME avec cis eQTLs qui n'avaient pas été observés en utilisant des méthodes standard. Enfin, à l'appui de ce travail, un outil logiciel a été développé, Opitimus Primer, pour aider pour aider au développement du test. Le logiciel a également été utilisé pour aider à l'enrichissement de cibles génomiques pour d'expériences séquençage. Le contenu ainsi que la conception, l’optimisation et la validation de notre panel le distingue largement de l’ensemble des essais commerciaux couramment disponibles sur le marché qui comprennent soit des marqueurs fonctionnels pour seulement un petit nombre de gènes, ou alors n’offre pas une couverture adéquate pour les gènes connus d’ADME. Nous pouvons ainsi conclure que l’essai que nous avons développé est et continuera certainement d’être un outil d’une grande utilité pour les futures études et essais cliniques dans le domaine de la pharmacocinétique, qui bénéficieraient de l'évaluation d'une longue liste complète de gènes d’ADME. / In order to better assess the inter-individual variability observed in a patient’s pharmacokinetic response to many medications, we have created a custom genotyping panel that uses unique assay designs to analyze variation present in key genes involved in the absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME) of many therapeutic agents. These genes and pathways involved in most pharmacokinetic mechanisms are well known. However, as yet, there has been little effort to develop tools that can interrogate a large number of variations in most known drug metabolizing genes simultaneously within a single experimental tool. Pharmacogenomic research has historically been conducted using two approaches: targeted studies that screen a small number of specific functional markers to identify known metabolic status phenotypes, and genome-wide studies that identify novel genetic correlations with drug response phenotypes. Thus, a gap currently exists for a targeted ADME research tool that can evaluate a large number of key ADME genes and variants in a format that can be applicable to both types of study designs. As part of this thesis, we have developed a 3000 SNP broad based ADME genotyping panel that can address this need. Genes and markers for the genotyping panel were selected in collaboration with many groups from both academia and the pharmaceutical industry in an effort to capture all pertinent genes and metabolic pathways that have been implicated in drug metabolism. The final assay design was composed of over 3000 markers in 181 genes. Over three phases of iterative development, the assay conversion rate for the 3000 markers was improved from 83.0% to 97.4% through the incorporation of novel design strategies to overcome areas of genomic interference such as regions of homology and underlying polymorphisms. Accuracy of the assay was validated by screening more than 200 samples of known genotype with a concordance of 99%. Additionally, data from the assay has also been compared to data from different technological platforms and has an overall concordance of 99.5%. The effectiveness of the design strategy was demonstrated in the successful utilization of the assay in the screening of over 1000 samples which identified several novel pharmacogenetic associations between ADME variations and adverse drug reactions in children. Another goal of this thesis was to demonstrate what added benefit/utility the 3000 SNP ADME panel would have when compared to currently available genotyping assays. Using 150 extensively investigated liver samples, the broad based assay was not only able to detect and validate 13 previously reported cis eQTLs in ADME genes but further identified an additional 13 novel ADME cis eQTLs that had never been observed before, doubling the number previously identified using standard methods on the same samples. Finally, in support of this work, a number of bioinformatic tools had to be developed to help expedite this research. These tools have been further refined and are currently being used to assist with enrichment of genomic targets for next generation sequencing experiments. In conclusion, this work has led to a better understanding of ADME genetics and the nuances of assaying ADME genes. The content and designs of the developed assay sets it apart from currently available commercial assays that contain only functional markers in a small number of genes or do not have adequate coverage across ADME genes. The assay has the ability to play a significant role in pharmacogenomic studies to identify known and novel pharmacogenomic biomarkers. These will lead to improved biomarkers that will help better stratify pharmaceutical clinical trial populations or assist physicians to select better, more personalized, efficacious and safer therapies for their patients.

Les champignons du genre Aspergillus sont des moisissures banales de l'environnement. Elles sont présentes dans le sol et sur des végétaux en décomposition. Les Aspergillus se propagent par l'intermédiaire de spores microscopiques en suspension dans l'air. L'Homme et les animaux sont exposés en permanence aux spores aspergillaires mais les défenses immunes empêchent leur développement dans l'organisme. Lorsque ces défenses sont amoindries, une aspergillose est possible. Dans ce cas, Aspergillus fumigatus et A. flavus sont le plus souvent incriminés. Les oiseaux sont beaucoup plus sensibles que les mammifères et l'environnement représenté par les élevages aviaires est propice à la prolifération des moisissures du genre Aspergillus. L'objectif de ce travail de thèse a été de caractériser la diversité génétique et la sensibilité aux antifongiques d'isolats d'Aspergillus provenant d'élevages aviaires dans la province du Guangxi en Chine. La première partie de la thèse est une analyse bibliographique sur les champignons du genre Aspergillus, les aspergilloses et les caractéristiques de l'élevage aviaire en Chine. Une première enquête a été réalisée dans 3 élevages près de la ville de Nanning et dans un élevage (incluant un éclosoir) à proximité de la ville de Guilin. Des écouvillonnages pharyngés et des prélèvements d'air ont été réalisés pendant plusieurs semaines. Des prélèvements ont également été faits sur des œufs dans l'éclosoir. Cette enquête a montré que le niveau de contamination fongique dépendait du type d'élevage. De nombreux isolats fongiques ont pu être collectés : 188 isolats d'A. fumigatus et 159 isolats d'A. flavus. La seconde partie du travail expérimental a porté sur la caractérisation de la diversité génétique d'A. fumigatus et d'A. flavus. Pour cela, la technique MLVA (multiple locus VNTR analysis) a été utilisée. Pour A. flavus, 8 marqueurs VNTR (variable-number tandem-repeat) ont été sélectionnés et une réaction PCR multiplex a été mise au point. Au total, 91 isolats d'A. flavus, incluant 6 souches de référence, ont été caractérisées avec le panel des 8 marqueurs VNTR. Cette analyse a permis de définir 78 génotypes distincts et un index de discrimination de 0,993. L'analyse de 188 isolats d'A. fumigatus avec 10 marqueurs VNTR a permis de définir 142 génotypes distincts. Certains génotypes d'A. flavus ou d'A. fumigatus sont clairement regroupés dans le nuage de point généré par l'analyse MST (minimum spanning tree). La troisième partie du travail expérimental a porté sur la sensibilité aux antifongiques de 177 isolats d'A. fumigatus. Ces isolats ont été récupérés dans des élevages aviaires en Chine et en France. Les isolats de Chine sont pour la plupart sensibles avec des valeurs minimales inhibitrices (vis-à-vis de l'itraconazole) comprises entre 0,38 et 0,75 µg/mL. Les isolats de France sont pour la plupart sensibles avec des valeurs minimales inhibitrices (vis-à-vis de l'itraconazole) comprises entre 0.19 and 1 µg/mL. Quatre souches ont été considérées comme résistantes : 2 souches provenant de deux élevages en Chine et 2 souches provenant de deux élevages en France. Des mutations sur le gène Cyp51A ont été détectées pour 11 isolats (3 résistants et 8 sensibles). Vingt et une mutations nucléotidiques ont été identifiées. Onze de ces mutations sont silencieuses et 9 sont à l'origine d'un changement de la composition de la protéine. Sept substitutions ont déjà été décrites dans la littérature ; les mutations A116R, E130D et Q131H sont originales.

Cette thèse a pour but de contribuer à une meilleure compréhension de la tuberculose (TB) et desmycobactéries non-tuberculeuses dans la Caraïbe. La tuberculose a hanté l’humanité depuisplusieurs millénaires et reste de nos jours une des maladies infectieuses faisant le plus de victimeschaque année (1,5 millions de décès en 2013). La connaissance de l’épidémiologie de la tuberculoseest essentielle afin de concevoir des programmes de lutte anti-TB adaptés aux spécificitésrégionales et donc plus efficaces. Dans cette optique, la première partie de ce travail fourni un suivià long-terme de la résistance aux antituberculeux observée en Guadeloupe, Martinique et Guyanefrançaise ainsi qu’un aperçu de la diversité génétique et de la résistance aux antituberculeux dansla Caraïbe. Les données montrent une baisse graduelle de la fréquence des infections causées pardes souches résistantes parmi les nouveaux cas de TB dans les départements français d’Amérique.En ce qui concerne la Caraïbe, des différences marquées ont été observées entre les différentsterritoires, ce qui semble refléter le passé historique de cette région.La deuxième partie est consacrée à la phylogénie et l’évolution de M. tuberculosis, étudié à l’aide dedivers marqueurs génétiques comme spoligotypes, LSP, SNP et MIRU-VNTR. Les profils MIRUVNTR(format 12-loci) ont été étudiés afin de déterminer leur utilité comme marqueurphylogénétique. Il a été montré que ce marqueur est adapté pour retracer la phylogénie ducomplexe M. tuberculosis et que la précision du classement basé sur les MIRUs est supérieure àcelle du classement basé sur les spoligotypes. De plus, la technique MIRU-VNTR permetégalement d’observer la diversification évolutive d’une souche de M. tuberculosis au cours del’infection ou alors d’identifier des patients infectés par plusieurs souches de M. tuberculosis enmême temps. Les deux phénomènes ont été observés au cours de ce travail de thèse et les casconcernés sont décrits dans ce deuxième chapitre.Enfin, un premier aperçu de la diversité des mycobactéries non-tuberculeuses isolées desprélèvements cliniques en Guadeloupe, Martinique et Guyane est présenté dans la troisième partiede ce travail. Des différences marquées dans la fréquence d’isolement de certaines espèces ont puêtre observées entre les trois départements français d’Amérique. M. intracellulare par exemple étaitsignificativement plus abondant en Guadeloupe. Cependant l’existence d’une niche écologiquespécifique à cette île n’a pas pu être mise en évidence. La problématique de l’identification desmycobactéries non-tuberculeuses est abordée également à travers une étude rétrospective del’utilisation de hsp65-PRA pour l’identification des mycobactéries dans un laboratoire de routinemais aussi sous forme d’un travail prospectif visant à la mise en place d’un protocoled’identification de mycobactéries non-tuberculeuses avec MALDI-TOF MS. / This thesis aims at providing a better understanding of tuberculosis (TB) and non-tuberculousmycobacteria (NTM) in the Caribbean. TB is an ancient scourge of humanity and remains one ofthe deadliest infectious diseases today having claimed around 1.5 million lives in 2013.Understanding the epidemiology of TB is essential for optimizing regional TB control programs. Inthis context, the first part of this work provides long-term data on drug-resistance in Guadeloupe,Martinique and French Guiana as well as an insight in the genetic diversity and drug-resistance ofM. tuberculosis in twelve Caribbean territories. Encouragingly, the results show a gradual decreaseof drug-resistant TB in newly infected patients in Guadeloupe, Martinique and French Guiana. Onthe Caribbean level, distinct differences were observed from one territory to the next and thecurrent epidemiological landscape seems to reflect the historical past of the region.The second part addresses the phylogeny and evolution of M. tuberculosis using various geneticmarkers such as spoligotyping, large sequence polymorphism (LSP), single nucleotidepolymorphism (SNP), and MIRU-VNTRs. The suitability of 12-loci MIRU-VNTR profiles for use inphylogenetic studies was evaluated and it was found that this marker is not only able to resolvethe evolutionary relationships within the M. tuberculosis complex but also allows to achieve ahigher phylogenetic precision than spoligotyping. MIRU-VNTR also permits the identification ofon-going evolution in TB patients (in-patient microevolution) as well as mixed strain infections.Both phenomena were observed in our setting and the respective cases are described herein.Finally, a first insight in the diversity of NTM isolated from clinical specimen in Guadeloupe,Martinique and French Guiana is provided. The isolation frequency of some NTM species variedconsiderably between the three departments, the most striking example being the relativeabundance of M. intracellulare in Guadeloupe. However, no evidence of a privilegedenvironmental niche/infection source on this island could be found. Last but not least, the subjectof NTM identification is addressed in the form of a retrospective evaluation of hsp65-PRA basedidentification in a routine laboratory and in the form of a prospective study towards theimplementation of a MALDI-TOF MS based identification of NTM at the Pasteur Institute ofGuadeloupe.

Lors de travaux, la mise en suspension des spores d’Aspergillus constitue un facteur de risque reconnu dans le développement d’une aspergillose invasive. Durant l’année 2015, un pavillon de 6000 m2 (60 lits) de notre établissement a été entièrement déconstruit. L’objectif principal de cette étude a été d’évaluer l’association entre la concentration des spores d’Aspergillus fumigatus (AF) dans l’environnement extérieur et intérieur des pavillons, mais également avec la coexistence de cas cliniques, afin de proposer des recommandations d’amélioration (pratiques & techniques). Pour cela, durant 11 mois, une surveillance prospective de la contamination à Aspergillus fumigatus (AF) de l’air extérieur et intérieur par impaction sur gélose, mais aussi une investigation épidémiologique des patients à risque ont été mis en place. Au total, 3885 prélèvements d’air ont été réalisés (1744 extérieurs et 2141 intérieurs) permettant, par calcul des ratios de contamination (extérieurs vs intérieurs), de confirmer une efficacité des mesures de précautions pour réduire l’aérocontamination. Des prélèvements extérieurs continus des spores d’Aspergillacées (spore/m3/jour) ont également été réalisés par un capteur Hirst. Ce capteur, mais aussi le suivi des conditions météorologiques se sont révélés être des systèmes d’alerte utiles pour prévenir les pics de contamination. Enfin, 394 (383 environnementaux, 11 cliniques) isolats d’AF sensibles aux antifongiques ont été génotypés (MLVA). L’analyse des génotypes a montré 7 génotypes similaires entre des isolats d’AF cliniques et environnementaux confirmant un rôle de l’environnement hospitalier dans l’infection ou la colonisation des patients / Invasive aspergillosis (IA) due to Aspergillus has been associated with building construction, which may increase spores emission nearby immunocompromised patients. In 2015, one blocks of 6,000 m2 (60 beds) form our hospital has been entirely demolished. The aim of this study was to evaluate possible association between concentration of A. fumigatus (AF) spores in the outdoor and indoor environment and also with the clinical cases in order to propose some improvements in actuals methods and practices. A daily surveillance of fungal contamination was implemented during 11-months. Environmental survey was realized by air samplings, outdoor and indoor, with an automatic agar sampler. In parallel, surveillance of IA infection cases was conducted by epidemiological investigation. A total of 3885 air samples (1744 outdoor samples and 2141 indoor samples) were collected, allowing calculation of ratios (outdoor vs indoor) to confirm efficacy of preventives measures applied to reduce indoor aerocontamination. Outdoor continuous sampling of Aspergillaceae spores (spore/m3/day) was also realized by a Hirst collector. This collector was useful as alarm system to detect contamination peaks. Similarly, monitoring of meteorological parameters seems to be an interesting tool, to prevent Aspergillus peaks. Finally, 394 isolates of AF, susceptible to antifungals (383 environmental and 11 clinical isolates) were genotyped using MLVA. Analysis of genotypes showed 7 similar genotypes shared by environmental and clinical isolates, suggesting that clinical colonization and/or infection may originate from the hospital environment

Au cours des 60 dernières années le développement des infrastructures de transports (Autoroutes, Lignes Grandes Vitesse, Nationales doubles voies) a fragmenté l'habitat des cerfs élaphe (Cervus elaphus). D'après les observations naturalistes, cette anthropisation a causé la fragmentation de deux populations géographiques existantes en sept dans la partie Sud et d'une en trois dans la partie Nord. Afin d'évaluer l'impact de ces infrastructures sur la structuration génétique de ces populations de cerfs, nous avons échantillonné chacune de ces populations grâce à la coopération de trois fédérations de chasse. Le cours laps de temps écoulé depuis la construction de ces infrastructures nous a conduits à choisir comme marqueurs moléculaires les microsatellites, efficaces dans l'inférence d'évènements récents. Les nouvelles techniques de séquençages (NGS) permettent d'obtenir d'importants jeux de données rapidement, nous avons choisi d'utiliser ces méthodes de séquençage pour obtenir nos données. Aucun logiciel ne permettant de traiter les données de séquençage haut débit des microsatellites pour des espèces dont le génome n'est pas complètement séquencé, nous avons alors réalisé un programme, MicNeSs qui permet de génotyper rapidement et objectivement (sans intervention humaine) un grand nombre d'individus et de locus. Nous avons utilisé MicNeSs pour génotyper 345 individus pour 17 locus microsatellites. A partir de ce jeu de données, nous avons montré l'existence d'une structuration génétique des populations de cerfs élaphe en Île-de-France en liaison avec les infrastructures routières et ferroviaires. Nous avons mis en évidence un effet fort des jumelages autoroutes/LGV et une efficacité différentielle des passages grande faune de 2ème et 3ème génération sur les populations de cerfs élaphe en Île-de-France. / During the last 60 years, the development of urban areas, main roads, highways and railways in Île de France, has fragmented the habitat of the red deer (Cervus elaphus). According to naturalistic observations, it caused the fragmentation of the two existing putative populations in the South in to seven putative populations and one in three in the North.In order to estimate the impact of the infrastructure on the genetic structure of these populations we sampled each of the putative population with the help of three hunting societies. Due to the short time passed since the first highway construction we chose microsatellite loci as molecular markers, efficient in the inference of recent events. The next generation sequencing (NGS) enable to have quickly important data set, we chose to use this technic to obtain our data. No software permits to treat microsatellites data from NGS for the species without complete genome, we made one program, MicNeSs which genotypes quickly and objectively a lot of individuals and loci. We used MicNeSs to genotype 345 individuals for 17 microsatellite loci. With this data set we showed the presence of a genetic structure of the red deer populations in association with the road and rail infrastructure. We highlighted a strong impact of the paired of highway/railway and a differential efficiency of the wildlife passages of the second and third generation on the red deer populations in Île-de-France.

Le récent développement des méthodes de séquençage permet aujourd’hui d’identifier des variations structurales chez de nombreuses espèces. Chez le maïs, des milliers de grandes insertions et délétions (InDel) de quelques pb à plusieurs centaines de Kbp ont été découvertes entre le génome de référence B73 et de nombreux autres génomes reséquencés. Ces InDel peuvent changer la composition des gènes entre les individus et donc être impliquées dans la variation du phénotype, mais cet effet sur le phénotype reste mal connu. L’objectif de cette thèse était d'étudier la contribution des InDel à l'adaptation, aux variations phénotypiques et aux performances hybrides chez le maïs. Nous avons développé une puce de génotypage des InDel Affymetrix® Axiom® capable de génotyper 105 927 InDel de 35bp à 129,7Kbp. 79 969 de ces InDel ont leur séquences absentes du génome de référence B73 et ont été identifiées par l’assemblage 3 génomes (F2, C103, and PH207). Nous avons sélectionné 61 492 InDel polymorphiques pour génotyper 362 lignées de maïs représentant une large gamme de diversité pour étudier la contribution des InDel à la diversité génétique, l’adaptation et la variation des caractères. Nous avons également génotypé 1 million de SNP à partir de deux puces de génotypage et du génotypage par séquençage pour étudier la complémentarité entre les InDel et les SNP. Qu’ils soient calculés avec les InDel ou les SNP la structuration génétique et les valeurs d’apparentement entre les lignées sont très similaires, ce qui suggère que la plupart des InDel ont suivi la même trajectoire évolutive que les SNP. 51% des InDel ne sont pas en déséquilibre de liaison élevé (>0.8) avec aucun SNP proche donc l’effet de ces InDel n’est donc a priori pas capturé pas des SNP à cette densité. Parmi les 294 régions génomiques associées au phénotype (QTL), 13 nouveaux QTL ont été détectés grâce aux InDel par rapport aux SNP par une approche de génétique d’association (GA). Nous avons détecté un enrichissement en InDel sous sélection entre les lignées tropicales, cornées et dentées par rapport aux SNP, avec 56 sur 188 régions sous sélection détectées avec les InDel. Ces régions contiennent des gènes impliqués dans l’adaptation et/ou la tolérance aux stress. De plus, le plus grand nombre d’associations a été découvert pour la floraison, caractère adaptatif chez le maïs. Ces résultats suggèrent que les InDel sont plus souvent impliquées dans l’adaptation et la tolérance aux stress. Nous avons enfin testé l’effet des InDel sur les performances hybride en analysant un panel de 287 hybrides issus du croisement de 210 lignées tempérées du panel précédent. Nous avons décomposé la variance des performances hybrides en distinguant les effets de dominance et d’additivité pour la floraison femelle (FF), la hauteur (PH) et le rendement (GY). La plus forte part de dominance et d’interaction génotype-environnement a été observée pour le GY et la plus faible pour la FF. L’effet additif et de dominance de 51,844 InDel et 469 267 SNP a été testé pour 4 combinaisons d’environnements par une approche de GA. 78 et 133 QTL avec un effet additif et dominant respectivement ont été identifiés, dont 6 et 11 avec des InDel. 83% de ces QTL ont été identifiés dans une seule combinaison d’environnements. Un des QTL de rendement identifié avec des InDel est situé dans un large cluster d’InDel sur le chromosome 6 et colocalise avec un QTL déjà identifié avec des SNP avec un effet fort dans l’augmentation du rendement sous des températures élevées. L’ajout de l’effet de dominance en plus de l’effet additif permet d’augmenter la précision des prédictions génomiques jusqu’à 5,6% pour le rendement. Cependant, l’ajout du génotypage des InDel en plus de celui des SNP n’a pas permis d’améliorer les prédictions des phénotypes hybrides. / In the last decades, the rapid development of genome sequencing allowed to identify structural variations in many species. In maize, thousands of large insertions and deletions (InDels) from few bp to hundreds of Kbp were discovered by comparing the reference genome B73 and many other resequenced genomes. These InDel sequences can carry genes and therefore be involved in phenotypic variation by changing the gene composition between individuals, but their effect on phenotype was not well studied. The aim of this thesis was to study the contribution of InDels to adaptation, phenotypic variations and hybrid performances in maize. We developed an Affymetrix® Axiom® genotyping array that allowed to genotype 105,947 InDels sequences ranging from 35bp to 129,7Kbp of size. 79,969 out 105,947 sequences of these InDels were not present in B73 reference genome and have been discovered by assembling three genomes (F2, C103, and PH207). We selected 61,492 polymorphic InDels to genotype a 362 maize inbred lines panel representing a broad range of diversity to study the contribution of InDels to genetic diversity, adaptation and trait variation. We also assembled one million of SNPs from two genotyping arrays and genotyping by sequencing to study the complementarity between InDels and SNPs. Genetic structuration and relatedness between inbred lines displayed by SNPs or by InDels were highly similar suggesting that almost all indels and SNPs followed a similar evolutionary trajectory. 51% of InDels were not in high linkage disequilibrium (LD>0.8) with any nearby SNP suggesting that the effect of these InDels was not be well captured using this density of SNP. Thanks to InDels, we detected 13 new quantitative trait loci (QTLs) among 294 QTLs identified for 23 traits by a genome wide association studies (GWAS). Similarly, 56 out 188 regions under selection between tropical, dent and flint maize lines were identified by InDels leading to an enrichment of genomic regions under selection detected by InDels compared to SNPs. These InDels include genes involved in tolerance to biotic and abiotic stress and/or adaptive traits as flowering time. Accordingly, the highest number of associated InDels was found for flowering time. These results suggest that InDels were often involved in adaptation and stress tolerance. In order to study the effect of InDels on hybrid performances, we analyzed a panel of 287 hybrids derived from the crossing of 210 maize temperate inbred lines from the previous panel. We decomposed the variance of female flowering (FF), plant height (PH) and grain yield (GY) by distinguishing the additive and dominant genetic effects. We observed the highest dominance and genotype by environment effects for GY and the lowest for FF. We performed GWAS on this panel by testing additive and dominance effects of 51,844 InDels and 469,267 SNPs on these three traits in 4 different environment combinations. We identified 78 and 133 QTLs with an additive and dominance effect, respectively including 6 and 11 QTLs discovered only by InDels. 83% of all QTLs were found with only one environment combination. One QTL for GY detected with InDels was located in a large cluster of InDels on chromosome 6, previously identified to have a strong effect on GY in heat conditions. We finally used InDels and/or SNPs genotyping to predict hybrid performances. Whereas including a dominance effect in genomic prediction models increased by 1.5 to 5.6% predictive abilities (PA) for GY, including InDels genotyping did not increased PA.

Résumé : Cette thèse porte sur l’élaboration d’un outil de capture d’ADN permettant d’identifier une mutation génétique (SNP) grâce à la formation de sandwichs avec des particules de carboxylatex biofonctionnalisées avec des oligonucléotides couplée à une détection de la fluorescence. Le modèle biologique choisi pour ce projet est le génotypage plaquettaire et plus particulièrement la recherche du gène biallélique HPA-1. Le principal objectif de ce travail a été d’optimiser un outil de capture préalablement développé dans l’équipe (Trévisan, 2011) afin de réduire le nombre d’étapes et de simplifier la mise en œuvre globale du test en modifiant les interactions moléculaires utilisée pour capturer l’ADN cible et en utilisant des particules fluorescentes comme élément de détection. En présence d’ADN cible, des sandwichs sont formés entre les particules fluorescentes et les particules magnétiques biofonctionnalisées. Ces sandwichs sont purifiés par séparation magnétique et la fluorescence est détectée par trois méthodes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (détection par ondes évanescentes). Dans un premier temps, les paramètres de fonctionnalisation chimique et biologique des différentes particules (magnétiques et fluorescentes) ont été déterminés et optimisés ainsi que les conditions d’hybridation pour la capture de l’ADN cible. Ensuite, la formation des sandwichs et leur détection ont été suivies par des mesures de fluorescence en utilisant trois méthodes différentes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (capteur à ondes évanescentes). Les résultats obtenus avec les différentes méthodes de détection sont concordants et montrent que l’outil de capture d’ADN développé permet de capturer la cible synthétique (oligonucléotide) HPA-1 en réduisant le temps d’analyse de 45 min. Dans nos conditions, le test permet de discriminer l’allèle a de l’allèle b du gène HPA-1 qui ne diffère que d’un nucléotide. Le rapport des signaux de fluorescence issus du sandwich spécifique et du sandwich non spécifique est d’environ 2,5 à 3. Ce rapport devra être amélioré par la suite, en optimisant les conditions de formation des sandwichs. La prochaine étape consistera à optimiser le système de capture d’ADN développé pour gagner en spécificité et déterminer la limite de détection du test. Ce test devra également être validé avec des échantillons biologiques. A plus long terme, la fluorescence pourra être détectée par un photodétecteur miniaturisé actuellement développé à l’Université de Sherbrooke. Des études préliminaires présentées dans ce manuscrit montrent les potentialités de ce nouveau transducteur. // Abstract : This thesis is about the development of a new assay to capture DNA. This assay is based on the formation of sandwiches between biofunctionnalized with oligonucleotides carboxylatex microparticles combined with fluorescence detection. It should be able to discriminate single nucleotide polymorphism (SNP). This assay is designed to be applied to platelet genotyping for the research of the gene HPA-1. The main goal of this work was to improve an assay previously developed (Trévisan, 2011) by INL and EFS Rhône-Alpes. The objectives are to reduce the number of steps and to simplify the test. To do so, the molecular interactions used in order to capture target DNA are modified and fluorescent microparticles are used for the detection. In the presence of target DNA, sandwiches are formed between both biofunctionnalized fluorescent and magnetic particles. Those sandwiches are purified through magnetic separation. Then, fluorescence is detected by three methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader (detection with an evanescent wave). First, chemical and biological parameters for the functionalization of the different particles (magnetic and fluorescent) are determined. The conditions for the capture of target DNA were optimized. Then, the formation and the detection of the sandwiches were estimated by measuring the fluorescence using three different methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader. The results obtained with the three methods are consistent. They show that the new system enables to capture synthetic target (oligonucleotide) HPA-1 with a reduction of total time analysis of 45 min. In our conditions, SNP can be discriminated for HPA-1 gene. For this discrimination, the fluorescence signal ratio about 2.5 to 3. This ratio should be improved by optimizing the conditions of sandwiches formation. Next step will consist in the optimization of the system developed to capture DNA in order to gain specificity and to determine the limit of detection. This test should also be validated with biological samples. In the long term, fluorescence could be detected by a miniaturized photodetector developed in the University of Sherbrook. Preliminary studies presented in this manuscript show the potentialities of this new transducer.

Les derniers scénarios du changement climatique, prévoient une élévation de température (Europe, +2 à +4°C en moyenne en 2099, IPCC, 2007) associée à des épisodes extrêmes, sécheresses sévères par exemple. Connaître les potentialités d'adaptation des espèces forestières s'avère crucial afin de comprendre leurs réponses et le devenir des écosystèmes forestiers, dans un futur proche. Dans ce cadre, nous nous sommes intéressés à un complexe d'espèces du genre Fraxinus, (frêne, Oléacées). En France F. excelsior L., et F. angustifolia, Vahl, sont des espèces autochtones présentant une plasticité phénotypique et écologique remarquable. L'hybridation, suspectée depuis longtemps a été prouvée en conditions contrôlées et naturelles. Les principales zones documentées sont la vallée de la Saône et de la Loire. Cette hybridation entre les deux espèces de frênes européens, pourrait favoriser l'apparition d'individus (génotypes) plus aptes que les espèces parentales à faire face à un environnement changeant. Notre objectif est de caractériser les potentialités d'adaptations de différentes populations de frêne (espèces parentales et de statut hybride) sous une contrainte abiotique (contrainte hydrique). Pour répondre à cet objectif, nous avons testé les réponses à la fois écophysiologiques et génétique de jeunes plants à une contrainte légère (-0,9 MPa). Une seconde expérimentation, centré sur l'écophysiologie a eu pour objet de mesurer la perte de conductivité hydraulique des frênes, sous une forte contrainte (-4 MPa). Le principal résultat de ces travaux est le comportement souvent intermédiaire et très variable des populations de frênes hybrides testés dans ces 2 expérimentations (A, gs, WUEi, PLC), que ce soit en conditions avec ou sans contrainte hydrique. Ce comportement intermédiaire est en lien avec le degré d'introgression respectif des hybrides de frênes (plus proche de F.excelsior ou de F.angustifolia). Ces arbres hybrides pourraient servir de ressources et d'assurance contre des évènements de dépérissement catastrophiques pour les forestiers pour un environnement climatique futur. / The latest climate change scenarios predict a rise in mean temperature in Europe of 2 to 4°C for 2099 (IPCC, 2007), associated with extreme climatic events such as severe droughts. Knowing adaptation capabilities of tree species is crucial for understanding their responses and forest ecosystem fate in the near future. Our study object is a species complex inside the Fraxinus genus (ash, Oleaceae). In France, F. excelsior and F. angustifolia are autochthonous, form natural hybrid populations and show remarkable phenotypic and ecological plasticity. This could promote the emergence of new individuals (genotypes) more able to deal with fluctuating environments. Our objective is to characterise the capability of adaptation of different Fraxinus populations, representing the three statuses (F.excelsior, F.angustifolia and hybrids) under abiotic constraints (water constraint). To solve this issue, we examine in a low water constraint experiment (-0.9 MPa) ecophysiological and genetic response, using saplings. A second and more severe water constraint experiment (-4 MPa) was used to investigate ash response to the loss of hydraulic conductivity. The most noticeable result was an intermediate and highly variable behaviour of hybrid ash populations in the two experiments (A, gs, WUEi, PLC) linked with they respective introgression degree (closer to F.excelsior or F.angustifolia). This hybrid trees could be used for foresters as a resource and insurance against catastrophic forest stand decline, for a future climate.