Les bactéries à Gram négatif sont caractérisées par une organisation complexe de leur enveloppe,impliquant une membrane interne (ou cytoplasmique), un espace périplasmique et une membrane externe. Si le transport de petits composés chimiques se fait facilement, la sécrétion des protéines et des toxines nécessite par contre l’utilisation de machineries spécialisées : les systèmes de sécrétion.Chez Pseudomonas aeriginosa, une bactérie pathogène opportuniste, le système de sécrétion de Type II, ou sécrétion Xcp, constitue l’une des voies principales de la sécrétion. Ce sécréton Xcp est un complexe macromoléculaire de 12 protéines, nommées XcpAO et XcpPC-ZM, organisé en trois sous-complexes : une plateforme d’assemblage ancrée dans la membrane interne (XcpPC-SF etXcpYL-ZM), un pore localisé dans la membrane externe et formé par multimérisation de la sécrétine XcpQD, et un pseudopilus périplasmique impliquant les pseudopilines XcpTG-XK. Au travers de son introduction bibliographique, ce manuscrit présente les différents constituants de cette machinerie et leur implication dans la sécrétion. Un grand nombre de copies du constituant majoritaire de ce système, XcpTG, s’assemble sous forme d’un pseudopilus dont les cycles d’assemblage –désassemblage, semblables aux mouvements d’un piston, pourraient permettre la sécrétion des substrats à travers la membrane externe. Le travail effectué au cours de cette thèse a pour but d’approfondir la compréhension des conditions d’assemblage du pseudopilus, qui s’avère être une étape cruciale dans la sécrétion. Les résultats obtenus s’articulent autour de la détermination par RMN hétéronucléaire de la structure de XcpTG, le composant majoritaire du pseudopilus etre présente le premier constituant de la machinerie de type II de P. aeruginosa à voir sa structure résolue par RMN. / Gram negative bacteria are characterized by a complex organisation of their cell envelope, with aninner membrane (or cytoplasmic membrane), a periplasmic space and an outer membrane. Incontrast to the transport of chemical compounds, which is preformed usually by porins localized inthe impermeable cell envelop, secretion of proteins and toxins requires specialized machineries: thesecretion systems. In Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen, among the wide rangeof section systems, the Type II secretion system, called Xcp secreton, is a major pathway for therelease of virulence factors. This Xcp secreton is a macromolecular complex involving 12 proteinscalled XcpA0 and XcpPC to XcpZM. This machinery is organized in 3 complexes, the assemblyplatform anchored in the inner membrane (implicating XcpPC,RE,SF,YL and ZM), the pore localizedin the outer membrane and formed by multimerization of the secretin XcpQD, and the periplasmicpseudopilus involving XcpTG-XK matured by the prepilin peptidase XcpAO. The introduction of thismanuscript presents all the components of the type II secretion system and their principal functionin the secretion process. XcpTG, the major components of this system, seems to polymerize to allowtransfer of secretion products across the outer membrane by a piston-like process. The workpresented in this manuscript is underlined by the idea of improving the understanding of themecanism of the type II secretion. The results articulate around the heteronuclear NMR solutionstructure determination of the XcpTG, which represents the first structure obtained for a componentof the type II secretion system of P. aeruginosa.

Les bactéries à Gram négatif sont entourées par une enveloppe cellulaire qui, contrairement aux bactéries à Gram positif, possèdent une organisation membranaire complexe composée d’une membrane interne appelée généralement membrane cytoplasmique, un espace périplasmique contenant une matrice de peptidoglycane et une membrane externe asymétrique constituée d’une monocouche de phospholipides surmontée d’une assise de lipopolysaccharide (LPS). Afin de franchir cette barrière, les bactéries à Gram négatif ont développé différentes voies de sécrétions spécifiques dédiées à l’export des protéines (effecteurs) du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire. Jusqu'à présent, six systèmes de sécrétion ont été identifiés chez ces bactéries. Chez Pseudomonas aeruginosa, une bactérie pathogène opportuniste, le système de sécrétion de type II appelé aussi sécréton Xcp constitue l’un des facteurs principales de sa virulence. Le sécréton Xcp est un complexe macromoléculaire formé par 12 protéines, nommées XcpAO et XcpPC-XcpZM. Ce complexe macromoléculaire est organisé en trois sous-complexes : i) une plateforme d’assemblage ancrée dans la membrane interne formé par les protéines XcpRESFYLZM ii) un pore de sécrétion localisé dans la membrane externe formé par l’oligomérisation d’une protéine appelé la sécrétine XcpQD. Le pore de sécrétion est connecté à la plateforme de la membrane interne par une protéine appelée XcpPC iii) un pseudopilus périplasmique sous forme de fibre hélicoïdale qui est formé par la multimérisation d’une protéine appelée la pseudopiline majeure XcpTG. D’autres protéines appelées les pseudopilines mineures XcpUH-VI-WJ-XK intègrent le pseudopilus. La première partie du travail effectué au cours de cette thèse a eu pour but d’étudier et de comprendre par des approches structurales, biochimiques et biophysiques le mécanisme d’assemblage des pseudopilines en pseudopilus. La deuxième partie de ce travail a porté sur l’étude des réseaux d’interactions entre les substrats sécrétés et les composants de la machinerie Xcp. Durant cette thèse, nous avons ainsi i) identifier grâce à l’étude des interactions protéine-protéine l’existence d’un complexe quaternaire entre les pseudopilines mineures XcpUH-VI-WJ-XK localisées au sommet du pseudopilus ii) déterminer les structures de la pseudopiline majeure XcpTG par RMN et de la pseudopiline mineure XcpWJ par cristallographie aux rayons X iii) déterminer les différents éléments du sécréton qui interagissent avec les exoprotéines du sécréton. Ce réseau d’interaction nous a permis de proposer un modèle de fonctionnement du sécréton qui élucide le cheminement des exoprotéines dans le sécréton afin qu’elles soient exportées vers le milieu extracellulaire. / Gram-negative bacteria are characterized by a complex organization of their cell envelope composed by the inner membrane (IM) called cytoplasmic membrane, the periplasmic space containing a peptidoglycan layer and the outer membrane (OM) covered by the lipopolysaccharide matrix. Gram-negative bacteria have evolved several specialized machines called secretion systems to export their effectors from the intracellular medium to the extracellular milieu or to the host cells. Up to now, at least six secretion systems have been identified. In the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa, the type II secretion system called the Xcp secreton is the major pathway for the release of virulence factors. The Xcp secreton is a macromolecular complex composed by 12 proteins called XcpAO, XcpPC-XcpZM. This machinery is organized in 3 sub-complexes: i) the assembly platform localized in the IM implicating XcpRESFYLZM proteins ii) the OM pore composed by the oligomerization of the secretin XcpQD. The connection between the assembly platform and the secretin is performed by XcpPC anchored in the IM iii) a periplasmic pseudopilus consisting of the multimerization of the so-called major pseudopilin XcpTG. The pseudopilus is a helicoidally filament spanning the periplasmic area and pushing the substrate into the secretin pore. Four other proteins, the minor pseudopilins XcpUH-VI-WJ-XK, were found in the pseudopilus. In the present work we first focused on the study of the pseudopilus components by biochemical, biophysical and structural strategies to understand their assembly. Secondly, we investigate the protein interactome between periplasmic secreton component and secreted substrates. Thus, we revealed the presence of a quaternary complex composed by XcpUH-VI-WJ-XK located at the tip of the pseudopilus. To understand at atomic scale the regulation of the pseudopilus, we determined the structure of two components of the pseudopilus XcpTG by NMR and XcpWJ by X-ray crystallography. Using systematic protein-protein interaction studies between secreton components and purified exoproteins of Pseudomonas aeruginosa, we identified 5 proteins of the secreton able to interact with exoproteins. This interaction network allowed us to propose a model for the secretion process including the sequential steps followed by exoproteins inside the secreton to leave the cell envelop.