Clostridium difficile est responsable de vingt-cinq pour cent des diarrhées post-antibiotiques et de la majorité des cas de colite pseudomembraneuse. C'est un bacille anaérobie à Gram positif sporulant. La bactérie est recouverte par un réseau cristallin bidimensionnel appelé couche S. Elle est formée par deux sous-unités de haut et bas poids moléculaire issues du clivage du précurseur SlpA par la protéase Cwp84. Ces deux protéines sont codées par des gènes situés dans le locus cwp et sont sécrétées par le système de sécrétion de type SecA2. Elles sont impliquées dans l'adhésion/colonisation du côlon par C. difficile. L'adhésion est une étape commune avec la formation du biofilm par les bactéries. Le biofilm est une communauté bactérienne enchâssée et protégée par une matrice extracellulaire produite par les membres de la communauté. C'est le mode de vie principal des bactéries. Nous avons caractérisé la voie de sécrétion de type SecA2 de C. difficile. La protéine SecA2 (codée également par un gène du locus cwp) est essentielle pour la survie de C. difficile. Elle a une double localisation : le cytoplasme et la membrane intracellulaire. SecA2 de B. anthracis est capable de dimériser avec les protéines SecA1 et SecA2 de C. difficile. De plus, la complémentation du mutant secA2 de B. anthracis par le gène secA2 de C. difficile est fonctionnelle. Le rôle de la couche S, de la protéase Cwp84 et de la mobilité dans le biofilm de C. difficile ont été également étudiés. La souche 630∆erm forme un biofilm fin et fragile tandis que le mutant 630∆ermcwp84::erm forme un biofilm épais et robuste. Nous avons montré que l'activité protéolytique de Cwp84 était impliquée dans la formation du biofilm. De plus, une inhibition de la traduction de l'ARN slpA avec un ARN antisens spécifique permet une augmentation de la taille du biofilm formé par la souche 630∆erm. Similairement, l'expression de l’allèle secA2 muté dominant qui bloque au moins partiellement la voie de sécrétion de type SecA2 augmente la taille du biofilm. Nos résultats suggèrent que la couche S, la protéase Cwp84 et la protéine SecA2 sont impliquées dans la formation du biofilm de C. difficile. Par ailleurs nous avons testé un panel de souches dans leur capacité à former un biofilm. Les résultats montrent que les souches non mobiles ne seraient pas capables de former un biofilm épais. Enfin, nous avons étudié la capacité de C. difficile à se développer en aérobiose au sein d’un biofilm mixte avec Bacillus cereus. Nous avons mis en évidence un recrutement et une multiplication de C. difficile dans la pellicule formée à l'interface air/liquide par B. cereus. Un rapport optimal des spores des deux espèces est requis pour le développement de C. difficile dans ces conditions. La présence de spores de C. difficile dans la pellicule suggère que les biofilms de l'environnement pourraient être des réservoirs de spores de C. difficile, et à l'origine de contaminations humaine et animale. / Clostridium difficile is responsible for twenty-five percent of post-antibiotics diarrhea and for most cases of pseudomembranous colitis. It is an anaerobic, sporulating, Gram-positive bacillus. The bacterium is covered by a two-dimensional lattice called S-layer. It is formed by two subunits of high and low molecular weight after the cleavage of the SlpA precursor by the Cwp84 protease. These two proteins are encoded by genes located in the locus cwp and are secreted by the SecA2 secretion system. They are involved in colonic adhesion/colonization by C. difficile. Adhesion is a common step with biofilm formation by bacteria. The Biofilm is a microbial community embedded in and protected by an extracellular matrix produced by the community members. The biofilm is the main bacterial way of life.We have characterized the SecA2 secretory pathway of C. difficile. The SecA2 protein (as encoded by a gene locus cwp) is essential for the survival of C. difficile. It has a dual location: cytoplasm and intracellular membrane. SecA2 of B. anthracis is able to dimerize with SecA1 and SecA2 proteins of C. difficile. Moreover, the complementation of B. anthracis secA2 mutant with secA2 gene of C. difficile is functional.The role of the S-layer, of the Cwp84 protease and of the motility in the biofilm of C. difficile have also been studied. The 630∆erm strain forms a thin and weak biofilm while the 630∆ermcwp84::erm mutant forms a thick and robust biofilm. We have shown that proteolytic activity of Cwp84 was involved in biofilm formation. Furthermore, a decrease in the translation of slpA RNA with an antisense RNA specific permits an increase in the size of the biofilm of the strain 630∆erm strain. Similarly, the expression of the dominant mutated secA2 allele, which at least partially blocks the SecA2 secretory pathway, increases the biofilm size. Our results suggest that the S-layer, the Cwp84 protease and the SecA2 protein are involved in biofilm formation of C. difficile. On the other hand, we have tested a panel of strains in their capacity to form a biofilm. The results show that non-motile strains are unable to form a thick biofilm.Finally, we have studied the ability of C. difficile to grow aerobically in a mixed biofilm with B. cereus. We highlighted a recruitment and proliferation of C. difficile in the film formed at the air/liquid interface with B. cereus. An optimal ratio of spores of both species is required for the development of C. difficile in these conditions. The presence of C. difficile spores in the film suggests that the environment biofilms could be reservoirs of spores of C. difficile, and the source of human and animal contamination.

Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène impliquée dans la toxi-infection alimentaire à l’origine de la listeriose, une maladie peu fréquente mais avec un taux de mortalité de 25 % chez l’homme. Cette bactérie est capable de former un biofilm lui permettant de mieux résister aux stress environnementaux ainsi qu’aux traitements de décontamination. Une nouvelle stratégie d’analyse génomique a été développée et a permis de cibler des systèmes de sécrétion et des protéines potentiellement impliqués dans la formation de biofilm. L’inactivation de la voie SecA2 entraîne la formation d’un biofilm aérien et par conséquent fragile. Ce morphotype est capable de croître de façon sessile à 20°C sur du polystyrène alors que ce n’est pas le cas pour la souche sauvage. De nouvelles protéines sécrétées de façon SecA2 dépendante ont été identifiées par l’étude de l’exoprotéome du mutant ΔsecA2 en comparaison avec celui de la souche sauvage. Le rôle des lipoprotéines dans la formation de biofilm ainsi que leur maturation par les peptidases signal de type II, LspA et LspB, a également été abordé. La combinaison d'une analyse de l’expression des gènes codant les lipoprotéines au cours de la formation de biofilm avec l’analyse génomique basé sur le sécrétome a permis de cibler trois lipoprotéines, dont LpeA qui serait impliquée dans les phases tardives de formation de biofilm. Enfin, l’importance majeure de LspA dans la maturation des lipoprotéines, a été mise en évidence par l’étude de l’exoprotéome des doubles mutant ΔlgtΔlspA et ΔlgtΔlspB en comparaison avec celui de Δlgt. / Listeria monocytogenes is a foodborne pathogenic bacteria responsible for listeriosis, a rare but high mortality rate disease in humans (25 %). This bacterium can form biofilm allowing a better resistance to environmental stresses as well as decontamination treatments. A new strategy for genomic analysis was developed and allowed to target secretion systems and proteins potentially involved in biofilm formation. Inactivation of the SecA2 pathway leads to the formation of an aerial and fragile biofilm. This morphotype is able to grow in a sessile mode at 20 °C on polystyrene whereas this is not the case for the wild type strain. New proteins secreted in a SecA2 manner were identified by comparing the ΔsecA2 exoproteome to the one of the wild type. The role of lipoproteins in biofilm formation and their maturation by the signal peptidase II, LpsA and LspB, was also tackled. Combining expression analysis of genes encoding lipoproteins during biofilm formation with genomic analysis based on the secretome allowed targeting three lipoproteins, including LpeA, which appeared to be involved in the later stages of biofilm formation. Finally, the importance of LspA in the maturation of lipoproteins,was highlighted by comparing of the double mutant ΔlgtΔlspA and ΔlgtΔlspB exoproteomes to the one of Δlgt.

Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène impliquée dans la toxi-infection alimentaire à l'origine de la listeriose, une maladie peu fréquente mais avec un taux de mortalité de 25 % chez l'homme. Cette bactérie est capable de former un biofilm lui permettant de mieux résister aux stress environnementaux ainsi qu'aux traitements de décontamination. Une nouvelle stratégie d'analyse génomique a été développée et a permis de cibler des systèmes de sécrétion et des protéines potentiellement impliqués dans la formation de biofilm. L'inactivation de la voie SecA2 entraîne la formation d'un biofilm aérien et par conséquent fragile. Ce morphotype est capable de croître de façon sessile à 20°C sur du polystyrène alors que ce n'est pas le cas pour la souche sauvage. De nouvelles protéines sécrétées de façon SecA2 dépendante ont été identifiées par l'étude de l'exoprotéome du mutant ΔsecA2 en comparaison avec celui de la souche sauvage. Le rôle des lipoprotéines dans la formation de biofilm ainsi que leur maturation par les peptidases signal de type II, LspA et LspB, a également été abordé. La combinaison d'une analyse de l'expression des gènes codant les lipoprotéines au cours de la formation de biofilm avec l'analyse génomique basé sur le sécrétome a permis de cibler trois lipoprotéines, dont LpeA qui serait impliquée dans les phases tardives de formation de biofilm. Enfin, l'importance majeure de LspA dans la maturation des lipoprotéines, a été mise en évidence par l'étude de l'exoprotéome des doubles mutant ΔlgtΔlspA et ΔlgtΔlspB en comparaison avec celui de Δlgt.